專利名稱：一株根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌yc0136及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌YC0136及其應用，屬于微生物技術領域，主要是ー株多粘類芽孢桿菌能有效促進煙株生長并誘導其系統抗性。
背景技術：
煙草黑胚病(Phytophthoraparasitica var. nicotianae)是我國發生最為嚴重的煙草土傳病害之一，其造成的年均損失12303. 38萬元，僅次于病毒病。目前我國主要采用甲霜靈等化學農藥來防治該病，但是長期使用化學農藥容易使病原菌產生抗藥性，導致防治效果下降。此外，長期、反復和大量使用化學農藥可引起土壌、水體和大氣的污染，同時也殺傷了其他有益微生物、昆蟲和畜禽，破壞了生態平衡。生物防治越來越受到人們的重 視，其中利用植物根際促生細菌(PGPR)防治土傳病害成為生物防治的重要研究領域。利用PGPR誘導系統抗性使煙草具有對多種病害的抵抗能力在煙草生產中具有十分重要的意義。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供了一株根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌YC0136及其應用，目的是研究煙草黑胚病拮抗菌多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136的防病和促生效果，并且通過測定煙草抗性相關生理指標來探討其對煙株系統抗性的誘導作用，為拮抗菌在煙草田間的應用提供理論依據。本發明是通過如下技術方案實現—株分離自貴州煙田根際土壤的多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)菌株編號為YC0136,平板對峙實驗中對煙草寄生疫霉(Phytophthora nicotianaevar.nicotianae)和煙草青枯病病原菌爺科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)具有很強的拮抗能力。該菌株分類命名為PaenibacilluspolymyxaYC0136,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。以菌株YC0136的總DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物(27F :5’ -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 和 1495R :5’ -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’ )進行 PCR 擴增，得到約為I. 4kb的擴增產物，其核苷酸序列如SEQ NO. I所示。根據GenBank序列Blast比對，菌株YC0136與多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspolymyxaDSM 8320 的 16S rDNA 序列相似性達 99%。結合菌株的生理生化特征，將YCO13 6初歩鑒定為多粘類芽孢桿菌，命名為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的菌落和菌體特征為在LB平板上培養24h后呈圓形不透明，微黃，表面干燥；產芽抱，卵圓形，芽孢囊膨大，G+，細胞桿狀。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的生理生化特征為接觸酶試驗陽性，氧化酶實驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性，淀粉水解試驗陽性，吲哚試驗陰性，檸檬酸鹽利用試驗陰性，運動性試驗陽性，葡萄糖產酸，果糖產酸，蔗糖產酸，甘露醇產酸。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的培養條件為菌株活化采用LB培養基，即蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸餾水1000ml。搖瓶發酵采用豆芽汁培養基黃豆芽200g，蔗糖20g，蒸餾水1000mL。30°C、170r/min搖瓶發酵培養3d。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株可以用于制備微生物菌齊U。應用時，培養菌種，得菌懸液，作為液態肥料，菌懸液的濃度優選為I. OX IO8CfuAil。溫室盆栽試驗結果表明，煙草根際接種多粘類芽孢桿菌(Paenibocilluspolymyxa) YC0136顯著降低了黑胚病病情指數，定植35d后溫室相對防效達到95. 9%，防治效果好于甲霜靈錳鋅，同時能夠促進煙草的生長發育。對煙草根系發育的調查中發現接種拮抗菌能夠促進煙草的根部生長，根系活力高于對照。接種YC0136后在不同時期測定了煙草葉片中SOD、POD、CAT、PPO和PAL的活性和葉綠素、電解質相對滲透率等生理指標，發現拮抗細菌YC0136誘導系統抗性好于化學誘導因子(甲霜靈錳鋅)，葉片中幾 種防御酶活性和葉綠素含量均顯著高于對照，電解質相對滲透率比對照有所降低，同時溫室試驗中發現接種拮抗菌的煙草花葉病發病率比對照有所降低，最高幅度可達33. 33%，以上結果證明生防細菌可誘導煙草產生系統抗性，增強煙草對病害的抵抗力。煙草定植60d時，生防細菌誘導系統抗性作用最為顯著，此時也是煙草田間病害的高發期，誘導作用在煙草生長后期仍有一定體現。結果表明拮抗菌YC0136能有效防治煙草黑脛病、促進煙株生長，具有良好的應用潛力。保藏信息一株多粘類芽抱桿菌YC0136 (Paenibacilluspolymyxa),于 2012 年 8月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號=CGMCCNO. 6475。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進ー步的說明。實施例I菌株的特性及其鑒定(I)菌株的分離篩選土壤樣品來自貴州煙田根際土壌。供試病原菌為煙草寄生疫霉(Phytophthoranicotianaevar. nicotianae)和煙草青枯病病原菌爺科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)。分離用培養基為馬鈴薯鹿糖培養基(PDA)和牛肉膏蛋白胨培養基(NA)。拮抗菌的分離采用樣品梯度稀釋法得到分離物。采用平板對峙法篩選拮抗菌將馬鈴薯蔗糖培養基倒平板，用接種鋤將活化好的病原真菌切成黃豆粒般大小的塊狀，置于平板中央，于28°C培養2cT3d，待病原真菌長到直徑為2cm時，用接種環挑取分離物，從靠近病原真菌的一側沿與其生長方向相交的方向劃線接種，每個培養皿接種6-8個試驗菌，于28°C培養24tT48h，根據有無抑菌帶及抑菌帶的大小判斷其拮抗效果。篩選得到ー株煙草根際拮抗菌，其分類命名為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YCO136,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。(2)多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株的菌落和菌體特征在LB平板上30°C培養24h后呈圓形不透明，微黃，表面干燥；產芽孢，卵圓形，芽孢囊膨大，G+，細胞桿狀。(3)多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株的生理生化特征接觸酶試驗陽性，氧化酶實驗陰性，硝酸鹽還原試驗陽性，淀粉水解試驗陽性，吲哚試驗陰性，檸檬酸鹽利用試驗陰性，運動性試驗陽性，葡萄糖產酸，果糖產酸，蔗糖產酸，甘露醇產酸。(4) 16S rDNA 序列分析 PCR 擴增 16S rDNA 序列采用常規方法提取細菌總DNA，以細菌總DNA為模板，27F和1495R作引物擴增YCO136 的 16S rDNA 序列。PCR 反應條件為95°C 5min，94°C lmin，56°C lmin，72°C I. 5min,30個循環，72 °C延伸lOmin。用3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒(3S SpinAgaroseGel DNA purification kit)純化 PCR 產物。16S rDNA序列測定及分析測序由上海博尚生物技術有限公司完成。測序結果用NCBI數據庫中的BLAST進行相似性分析。16S rDNA基因序列提交GenBank，其登錄號為EU430119. I。將所測16SrDNA序列與GenBank數據庫中的序列比對，結果表明YC0136的16S rDNA序列與PaenibacilluspolymyxaDSM 8320的16S rDNA序列相似性達99%。結合菌落形態，生理生化特征和16S rDNA序列分析,將其鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。實施例2制備菌劑多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa) YC0136菌株的最適培養條件為菌株活化采用LB培養基，即蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸餾水1000ml。搖瓶發酵采用豆芽汁培養基黃豆芽200g，蔗糖20g，蒸餾水lOOOmL。30°C、170r/min搖瓶發酵培養3d。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136菌株可以用于制備微生物菌齊U。在LB培養基上劃線接種于30°C溫箱培養過夜，然后取菌種接種至三角瓶液體豆芽汁培養基，30°C搖床轉速為170r/min搖瓶發酵培養3d，得菌懸液，作為液態肥料，使用時進行稀釋至菌懸液的濃度為I. OX 108CfU/ml最佳，最高稀釋倍數可以達到200倍，稀釋菌液作為液態肥料可以浸根、灌根或噴施。實施例3盆栽試驗將煙草盆栽試驗在日光溫室內進行，設置三個處理，其中A處理接種多粘類芽孢桿菌(PaenibaCilluSpOlymyXa)YC0136菌液；B處理為施加甲霜靈錳鋅作為藥劑對照；C處理為發病對照。每處理五次重復，每重復三棵煙苗。選擇長勢一致的5-6片真葉期的煙苗，移栽前將煙草幼苗在I X 108CFU/mL濃度的YC0136菌液中浸根30min，然后將煙苗移栽至盆中，藥劑對照和發病對照采用培養基浸根。緩苗3天后用移液槍頭將相應的YC0136菌懸液(I X 108CFU/mL)灌入煙株根際，每株煙4mL菌液，同時取ImL菌液淋于莖基部，發病對照接入等量培養基，藥劑對照采用58%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑500倍稀釋液澆灌處理，每盆150mL。Id后將配制好的黑脛病游動孢子菌懸液(IO4個/mL)灌接于各處理煙苗根部，接種量為5mL/株。其余按照溫室常規管理，澆水保濕以利于發病。(I)拮抗菌多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136對煙草病害的防治效果表I拮抗菌對煙草黑脛病溫室防效
權利要求
1.一株保藏編號為CGMCC NO. 6475的根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌YC0136(Paenibacilluspolymyxa),其特征在于已于2012年8月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.如權利要求I所述的根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌YC0136在煙草中的應用，可防治煙草黑脛病、促進煙草根系的發育，提高煙草的根系活力，促進煙株生長。
全文摘要
本發明涉及一株根際拮抗細菌多粘類芽孢桿菌YC0136及其應用，目的是研究煙草黑脛病拮抗菌多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)YC0136的防病和促生效果，并且通過測定煙草抗性相關生理指標來探討其對煙株系統抗性的誘導作用，為拮抗菌在煙草田間的應用提供理論依據；本發明分離得到的菌株能有效防治煙草黑脛病、促進煙株生長，具有良好的應用潛力。
文檔編號C05F11/08GK102851250SQ20121034806
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者丁延芹, 姚良同, 杜秉海 申請人:山東農業大學, 德州創迪微生物資源有限公司