專利名稱：一種石斛小菇f35復合菌劑及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種石斛小菇F35復合菌劑，特別涉及一種由石斛小菇F35 (Mycena dendrobii Fan et Guo)和木霉菌(Trichoderma)復合而成的石斛小燕F35復合菌劑及其應用方法，具有促進石斛苗快速生長，提高多糖和石斛堿含量等作用。背景技術：
在珍稀藥用植物石斛栽培過程中，由于其生長發育中特有的復雜性使得產業化工作的難度很大。一是石斛開花多，能結果的只占極少數，果實為蒴果，種子細如粉塵，種胚的發育不超過球形階段，又缺乏胚乳組織，必須飄落到非常適宜的環境與真菌共生才能萌發， 自然條件下的發芽率不到5%，而且由種子萌發的植株生長發育十分緩慢。二是石斛幾乎都是菌根植物，自然生長狀態下，都必須部分或完全依賴與真菌建立共生關系才能完成正常生命活動，人工條件下進行大規模開發和擴繁時，往往因缺少適宜共生菌根真菌的參與，使得其不能正常生長，使得珍稀藥用植物石斛產業化難度加大。此外，石斛的組培繁殖技術仍然有較大的困難，能進行組培繁殖的外植體少，目前只有莖尖可以組培成功，葉片、根等外植體還沒有成功的報道。靠根狀莖方式繁殖，其特點是啟動慢、周期長、繁殖系數低，是影響國石斛種苗規模生產的主要原因。另外，石斛組培苗栽培至開花所需時間長，也是組培繁殖的制約因素之一，組培苗出瓶種植一般需5 7年才能開花。這種現狀嚴重影響了我國石斛產業化由數量擴張向質量提高轉型，也約束了石斛產業的進一步發展。因此，如何提高石斛種子發芽率和幼苗生長速度已成為石斛產業化急需解決的問題之一。
生物菌劑是近年來發展起來的一種新型栽培基質添加劑，它含有大量活的微生物，其本身無毒、無味、無污染、無公害，以微生物生命活動及其產物來改善作物營養條件和生長環境。生物菌劑具有明顯的抗病作用，其包含的微生物能分泌抗菌素，抑制多種致病真菌和細菌的生長，能減少了大量農藥的投入，減少了農藥給環境及農產品帶來的污染。生物菌劑還能夠促進土壤團粒結構的形成，改善土壤板結狀況，將土壤中大量有效養分吸附、蓄積在土壤團粒中，不僅減少了水土流失，還能緩解化肥特別是氮肥的流失所造成的江、河、 湖泊水體的富營養化及飲用水、地下水硝酸鹽含量的增高等問題，并減少硝酸鹽在農產品中的積累等問題。因此，生物菌劑開發對發展可持續農業、生態農業、綠色農業以及保護人類生存環境都具有深遠影響。
發明內容
本發明目的是提供一種促進石斛苗生長的復合菌劑及其應用方法，該復合菌劑促進了石斛苗快速生長，提高了石斛生物活性物質成分多糖和石斛堿含量。
本發明采用的技術方案是
本發明提供一種石斛小菇F35復合菌劑，所述復合菌劑由如下質量配比的原料組成石斛小菇F35純培養物3份、木霉菌純培養物7份和占石斛小菇F35純培養物與木霉菌純培養物總重量2%的粘合劑；所述石斛小菇F35純培養物是石斛小菇F35 (Mycenadendrobii Fan et Guo)經固體發酵培養獲得的含石斛小菇F35的菌塊粉碎后得到所述石斛小菇F35純培養物，所述木霉菌純培養物是木霉菌(Trichoderma)經固體發酵培養獲得的含木霉菌的菌塊粉碎后得到所述木霉菌純培養物，所述粘合劑為遼寧眾信魚餌開發中心的眾信3A粘粉。
進一步，所述石斛小菇F35純培養物按如下步驟制備
(I)斜面培養將石斛小菇F35接種至PDA固體培養基a，25°C培養14天，獲得斜面菌體；所述PDA固體培養基a終濃度組成為馬鈴薯300g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 20 g/L，溶劑為水，pH 7.0 ；
(2)種子培養從斜面菌體挑取一接種環接種至H)液體培養基a，在28°C、200r/ min條件下振蕩培養10 d，獲得種子液；所述H)液體培養基a終濃度組成為馬鈴薯300g/ L、葡萄糖20 g/L，溶劑為水，ρΗ7· O ；
(3)發酵培養將步驟(2)獲得的種子液按照20mL種子液/IOOOg發酵培養基的比例接種至固體發酵培養基a中，25°C發酵培養20 d，獲得含石斛小菇F35的固體菌塊，將菌塊(包括菌體和培養基)粉碎，獲得所述石斛小菇F35純培養物；所述固體發酵培養基a終濃度組成為木屑820 g/L、麩皮270 g/L、玉米粉270 g/L、稻糠140 g/L、草灰140 g/L、泥炭1360 g/L，溶劑為水，pH 7.0。
進一步,所述木霉菌純培養物按如下步驟制備
①斜面培養將木霉菌接種至PDA固體培養基b，25°C培養14天，獲得斜面菌體; 所述PDA固體培養基b終濃度組成為馬鈴薯300g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 20 g/L，溶劑為水，PH 7. O ；
②種子培養從斜面菌體挑取一接種環接種至H)液體培養基b，在28°C、200r/min 條件下振蕩培養10 d，獲得種子液；所述ro液體培養基b終濃度組成為馬鈴薯300g/L、葡萄糖20 g/ L，溶劑為水，pH 7.0 ；
③發酵培養將步驟②獲得的種子液按照20mL種子液/IOOOg發酵培養基的比例接種至固體發酵培養基b中，25°C發酵培養20 d，獲得含木霉菌的菌塊，將菌塊(包括菌體和培養基)粉碎，獲得所述木霉菌純培養物；所述固體發酵培養基b終濃度組成為木屑820 g/L、麩皮270 g/L、玉米粉270 g/L、稻糠140 g/L、草灰140 g/L、泥炭1360 g/L，溶劑為水， pH 7. O。
本發明還提供一種所述石斛小菇F35復合菌劑在石斛培養中的應用，所述石斛小菇F35復合菌劑的使用量為3g/株石斛苗。
本發明還涉及一種所述石斛小菇F35復合菌劑在石斛培養用肥料中的應用，所述肥料是將泥炭、蛭石和木屑按質量比1:1:1混合成營養土，然后按營養土與石斛小菇F35復合菌劑質量比30:1的比例加入石斛小菇F35復合菌劑組成所述肥料。
本發明所述石斛小燕F35 (Mycena dendrobii Fan et Guo)分離自云南省昆明市野生金釵石斛，保存于浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室。
所述木霉菌(Trichoderma)分離自云南昆明市野生金釵石斛,保存于浙江省藥用植物種質改良與質量控制技術重點實驗室。
所述PDA固體培養基a、PDA固體培養基b均為PDA固體培養基，PD液體培養基a 和ro液體培養基b均為ro液體培養基，固體發酵培養基a和固體發酵培養基b均為固體發酵培養基，為便于區分不同菌種所用的培養基而命名，字母本身沒有含義。
本發明的有益結果主要體現在本發明提供的石斛小菇F35復合菌劑不僅促進了石斛苗生長速度，而且還提高了生物活性物質多糖和石斛堿含量，該生物菌劑開發復合可持續農業、生態農業、綠色農業發展要求，適合珍稀藥用植物石斛規模化生產。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此
實施例I :石斛小菇F35純培養物的制備I.實驗材料石斛小燕F35菌株(Mycena dendrobii Fan et Guo)分離自云南昆明市野生金釵石斛。
2.液體培養將石斛小菇F35菌株接種PDA固體培養基，在25°C培養14 d后，切取石斛小菇F35菌株，接種在無菌的盛有100 mL PD液體培養基的500 mL的三角瓶內，置 28°C、轉速200r/min的搖床上振蕩(往復式)培養10 d，得到石斛小菇F35種子液。
3.固體(3)發酵培養將步驟(2)獲得的種子液按照20mL種子液/IOOOg發酵培養基的比例接種至固體發酵培養基中，25°C發酵培養20 d，獲得含石斛小菇F35的固體菌塊，將固體菌塊粉碎，獲得所述石斛小菇F35純培養物；所述固體發酵培養基終濃度組成為木屑820 g/L、麩皮270 g/L、玉米粉270 g/L、稻糠140 g/L、草灰140 g/L、泥炭1360 g/L，溶劑為水，pH 7.0。
實施例2 :木霉菌純培養物的制備
I.實驗材料木霉菌(Trichoderma)分離自云南昆明市野生金釵石斛。
2.液體培養將木霉菌接種PDA固體培養基，在25°C培養14 d后，切取木霉菌菌片，接種在無菌的盛有100 mL H)液體培養基的500 mL的三角瓶內，置28°C、轉速200r/min 的搖床上振蕩(往復式)培養10 d，得到木霉菌種子液。
3.固體(3)發酵培養將步驟(2)獲得的種子液按照20mL種子液/IOOOg發酵培養基的比例接種至固體發酵培養基中，25°C發酵培養20 d，獲得含木霉菌的固體菌塊，將菌塊粉碎，獲得所述石斛小菇F35純培養物；所述固體發酵培養基終濃度組成為木屑820 g/ L、麩皮270 g/L、玉米粉270 g/L、稻糠140 g/L、草灰140 g/L、泥炭1360 g/L，溶劑為水， pH 7. O。
實施例3 :石斛小菇F35復合菌劑的制備
將實施例I制備的石斛小菇F35純培養物和實施例2制備的木霉菌純培養物按照重量比=3:7混合，然后添加石斛小菇F35純培養物和木霉菌純培養物總重量2%的眾信3A 粘粉(遼寧眾信魚餌開發中心)，混合均勻，獲得石斛小菇F35復合菌劑。
實施例4:石斛小菇F35復合菌劑的應用
I、實驗材料金釵石斛苗，采集自云南，經實驗室自行授粉、組織培養至株高5 cm 后保持使用；
2、實驗操作將實施例3方法制備的石斛小菇F35復合菌劑按照3g/株打穴接入金釵石斛苗根圍，溫室25°C培養60 d，以不接種石斛小菇F35復合菌劑的金釵石斛苗作為對照。
3、金釵石斛鮮重測定
60 d后，上述施用石斛小菇F35復合菌劑的金釵石斛苗增重為O. 16 g，對照石斛苗僅增重O. 03 g。
4、石斛多糖和總生物堿含量測定
石斛多糖提取及測定取種植60 d后施用石斛小菇F35復合菌劑的金釵石斛和對照組種植的石斛，80°C烘干研磨成粉末后，分別取O. 500 g置于圓底燒瓶中，加入石油醚50 ml, 650C回流提取I h，脫脂，過濾，揮干溶劑，加入體積濃度80%乙醇水溶液50 ml,回流提取I h，過濾，揮干溶劑，加入蒸餾水20ml于80°C回流提取2 h，趁熱過濾，取濾液滴在ATAGO PAL-I型糖度計上測定可溶性多糖含量。每個處理為15株苗，每個處理設3個重復。
石斛堿提取及測定將種植60 d后施用石斛小菇F35復合菌劑的金釵石斛和對照組種植的石斛80°C烘干至恒重，粉碎，精密稱取O. 500 g置100 ml圓底燒瓶中，加2 ml氨水潤濕30 min后,加入氯仿50 ml,稱重,65°C回流提取2 h,以氯仿補足失重,減壓回收溶劑至干，濃縮物加甲醇超聲溶解，定量轉入2 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，吸入注射器，用0.45 μ m微孔濾膜過濾，濾液注入進樣瓶。利用GC測定含量，GC色譜條件為色譜柱為毛細管柱，19091J-413 HP-5，30. O X 320 μ mX O. 25 μ m，載氣為氮氣，流速為 O. 7 ml/min, 進樣口溫度250°C，柱溫以5°C /min的速度從120°C升溫至150°C (起始溫度點和終止溫度點均穩定15 min)，氫火焰離子化檢測器檢測，檢測器溫度為250°C。每個處理為15株苗， 每個處理設3個重復。
測定結果發現，60 d后，施用石斛小菇F35復合菌劑的金釵石斛苗，其多糖含量為O.132 g/ g干重,石斛堿含量為O. 181mg/g干重,而對照石斛苗多糖含量為O. 101 g/g干重，石斛堿含量為O. 113mg/g干重。
實施例5:
I、實驗材料金釵石斛苗，采集自云南，經實驗室自行授粉、組織培養至株高5 cm 后保持使用；泥炭、蛭石、木屑(質量比I :1 :1)組成營養土，按營養土 石斛小菇F35復合菌劑(實施例3方法制備)=30 1的比例混合均勻，制成石斛培養用肥料。
2、實驗操作利用上述步驟I中石斛培養用肥料栽培金釵石斛苗，溫室25°C培養 60 d，以泥炭、蛭石、木屑(質量比I :1 :1)組成的營養土作為對照。
3、金釵石斛鮮重測定
60 d后，上述施用石斛小菇F35復合菌劑的營養土栽培金釵石斛苗增重為O. 17 g，對照石斛苗僅增重O. 03 g。
4、石斛多糖和總生物堿含量測定
多糖及總石斛堿含量測定方法同實施例4，每個處理為15株苗，每個處理設3個重復。測定結果發現，60 d后，施用石斛小菇F35復合菌根菌劑營養土的的金釵石斛苗，其多糖含量為O. 147 g/ g干重,石斛堿含量為O. 179mg/g干重,而對照石斛苗多糖含量為O.101 g/g干重,石斛堿含量為O. 113mg/g干重。
權利要求
1.一種石斛小菇F35復合菌劑，其特征在于所述復合菌劑由如下質量配比的原料組成石斛小菇F35純培養物3份、木霉菌純培養物7份和占石斛小菇F35純培養物與木霉菌純培養物總重量2%的粘合劑；所述石斛小菇F35純培養物是石斛小菇F35 (Mycenadendrobii Fan et Guo)經固體發酵培養獲得的含石斛小菇F35的菌塊粉碎后得到所述石斛小菇F35純培養物，所述木霉菌純培養物是木霉菌(Trichoderma)經固體發酵培養獲得的含木霉菌的菌塊粉碎后得到所述木霉菌純培養物，所述粘合劑為遼寧眾信魚餌開發中心的眾信3A粘粉。
2.如權利要求I所述石斛小菇F35復合菌劑，其特征在于所述石斛小菇F35純培養物按如下步驟制備(1)斜面培養將石斛小菇F35接種至PDA固體培養基a，25°C培養14天，獲得斜面菌體；所述PDA固體培養基a終濃度組成為馬鈴薯300g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 20 g/L，溶劑為水，PH 7. O ；(2)種子培養從斜面菌體挑取一接種環接種至H)液體培養基a，在28°C、200r/min條件下振蕩培養10天，獲得種子液；所述H)液體培養基a終濃度組成為馬鈴薯300g/L、葡萄糖20 g/L，溶劑為水，pH7.0 ;(3)發酵培養將步驟(2)獲得的種子液按照20mL種子液/IOOOg發酵培養基的比例接種至固體發酵培養基a中，25°C發酵培養20天，獲得含石斛小菇F35的固體菌塊，將菌塊粉碎，獲得所述石斛小菇F35純培養物；所述固體發酵培養基a終濃度組成為木屑820 g/L、麩皮270 g/L、玉米粉270 g/L、稻糠140 g/L、草灰140 g/L、泥炭1360 g/L，溶劑為水，pH7.O。
3.如權利要求I所述石斛小菇F35復合菌劑，其特征在于所述木霉菌純培養物按如下步驟制備①斜面培養將木霉菌接種至PDA固體培養基b，25°C培養14天，獲得斜面菌體；所述PDA固體培養基b終濃度組成為馬鈴薯300g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂15 20 g/L，溶劑為水，pH 7. O ；②種子培養從斜面菌體挑取一接種環接種至ro液體培養基b，在28°C、200r/min條件下振蕩培養10天，獲得種子液；所述H)液體培養基b終濃度組成為馬鈴薯300g/L、葡萄糖20 g/L，溶劑為水，pH 7.0 ；③發酵培養將步驟②獲得的種子液按照20mL種子液/IOOOg發酵培養基的比例接種至固體發酵培養基b中，25°C發酵培養20天，獲得含木霉菌的菌塊，將菌塊粉碎，獲得所述木霉菌純培養物；所述固體發酵培養基b終濃度組成為木屑820 g/L、麩皮270 g/L、玉米粉 270 g/L、稻糠 140 g/L、草灰 140 g/L、泥炭 1360 g/L，溶劑為水，pH7. O。
4.一種權利要求I所述石斛小燕F35復合菌劑在石斛培養中的應用,其特征在于所述石斛小菇F35復合菌劑的使用量為3g/株石斛苗。
5.一種權利要求I所述石斛小菇F35復合菌劑在石斛培養用肥料中的應用，其特征在于所述肥料是將泥炭、蛭石和木屑按質量比1:1:1混合成營養土，然后按營養土與石斛小菇F35復合菌劑質量比30:1的比例加入石斛小菇F35復合菌劑組成所述肥料。
全文摘要
本發明公開了一種石斛小菇F35復合菌劑及應用，所述復合菌劑由如下質量配比的原料組成石斛小菇F35純培養物3份、木霉菌純培養物7份和占石斛小菇F35純培養物與木霉菌純培養物總重量2%的粘合劑；本發明提供的石斛小菇F35復合菌劑不僅促進了石斛苗生長速度，而且還提高了生物活性物質多糖和石斛堿含量，該生物菌劑開發復合可持續農業、生態農業、綠色農業發展要求，適合珍稀藥用植物石斛規模化生產。
文檔編號A01N63/04GK102919278SQ201210393079
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月16日 優先權日2012年10月16日
發明者王慧中, 徐祥彬, 應奇才 申請人:杭州師范大學