專利名稱：一種利用莫氏蘭腋芽組織培養組培苗的快速繁殖方法
一種利用莫氏蘭腋芽組織培養組培苗的快速繁殖方法技術領域
本發明屬植物栽培技術領域，涉及一種植物生物技術中組培苗(試管苗)繁殖方法，具體涉及一種利用莫氏蘭腋芽組織培養組培苗的快速繁殖方法。
背景技術：
莫氏蘭(Mokara)是由新加坡高級蘭花育種家侯偉勵用萬代蘭、鳥舌蘭、蜘蛛蘭三個屬雜交出來的新型蘭花。近十幾年來莫氏蘭以它獨特的花姿，風靡世界各地，種植面積和市場需求逐年上漲，已上升為主要的蘭花切花品種之一。目前，莫氏蘭的繁殖方法主要采用傳統的單莖切離繁殖方法，是取生長3 4年以上的莫氏蘭植株，且植株健壯、根系健康發達，然后進行單莖切離，一個成株一次只可以切離I 2段，切離的小段植株要生長I 2 年才可以開花，產率低，耗時長，成本高，效率低。
隨著花卉產業的不斷發展，人民生活水平的不斷提高，花卉在日常生活中的需求量不斷的增長，莫氏蘭傳統的單莖切離繁殖方法已不能滿足生產的需要，植物組織培養成為了莫氏蘭種苗快速繁殖的新途徑。植物組織培養即植物無菌培養技術，又稱離體培養，是利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實等)組織(如形成層、表皮、皮層、髓部細胞、胚乳等)或細胞(如大孢子、小孢子、體細胞等)以及原生質體，在無菌和適宜的人工培養基及光照、溫度等人工條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的學科。目前國內對莫氏蘭組織培養的研究報道很少，國外對于莫氏蘭的研究多處于對其花的研究，對植株組織培養的報道也相對較少。發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種利用莫氏蘭腋芽組織培養組培苗的快速繁殖方法，以莫氏蘭腋芽為外植體，通過誘導腋芽產生原球莖，再由原球莖分化成叢生芽，最后形成具有根系的組培苗，有效地提高了莫氏蘭工廠化育苗的繁殖效率，填補莫氏蘭組織培養的技術空白，無論從數量上還是時間上，該繁殖方法要明顯優于傳統的單莖切離的繁殖方法，具有較高的商業價值。
本發明是采用的技術方案
一種利用莫氏蘭腋芽組織培養組培苗的快速繁殖方法，包括腋芽誘導過程、原球莖增殖過程、原球莖誘導叢生芽過程、壯苗培養過程、生根培養過程，其具體步驟如下
I、腋芽誘導過程
將經過消毒的腋芽接種于誘導培養基上進行培養，培養條件暗培養，溫度23 270C ;培養至腋芽表面分化出原球莖。所述誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁I 200ml/L、a_蔡乙酸O. 02 O. 5mg/L、6_節氛基嘿呤I 5mg/L、腺嘿呤O. 5 3mg/ L0
所述基礎培養基的成分和含量分別為①大量元素KN03450 1000mg/L、 KH2PO4150 250mg/L、(Ca) 3P04150 250mg/L、MgSO4 · 7H20200 370mg/L、(NH) 2S04350 800 mg/L ;②微量元素FeS04 · 7H2018. 5 27. 8mg/L、Na2_EDTA24. 86 37. 3mg/L、 MnSO4 ·Η207· 5 14. 8mg/L、ZnS04 ·7Η201 3. 2mg/L、H3B03l 2. 5mg/L ;③肌醇 I 250mg/ L ;④糖 I 20g/L ;⑤瓊脂 4. 5 5. 5g/L ；pH 為 5· I 5· 4。
2、原球莖增殖過程
將原球莖接種于增殖培養基上進行增殖培養，培養條件暗培養，溫度23 27°C ； 40 50d轉移一次。所述增殖培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁I 200ml/L、 蛋白胨I 2. 00g/L、a-萘乙酸O. 02 O. 5mg/L、6_芐氨基嘌呤I 5mg/L、腺嘌呤O. 5 3mg/L。
3、原球莖誘導叢生芽過程
將增殖后的原球莖接種于叢生芽誘導培養基上進行叢生芽誘導培養，至分化形成小芽，培養條件光培養，光照強度為1000 2000LX，溫度23 27°C。所述叢生芽誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁I 200ml/L、蛋白胨I 2. 00g/L、香蕉10 100g/L、馬鈴薯 10 100g/Lo
4、壯苗培養過程
將叢生芽接種于壯苗培養基上進行壯苗培養，培養條件光培養，光照強度為 2000 3000Lx，溫度26 29°C ;培養35 45d后，小芽長成3 5 cm高的小苗，植株健壯。所述壯苗培養基是在基礎培養基的基礎上添加香蕉10 100g/L、馬鈴薯10 IOOg/ L、活性炭I. O 2. 0g/L。
5、生根培養過程
將小苗轉入到生根培養基中進行生根培養，培養條件光培養，光照強度為 2000 3000Lx，溫度26 29°C;生根培養60d后，小苗基部產生大量的根系，形成完整的植株。所述生根培養基是在基礎培養基的基礎上添加香蕉10 100g/L、馬鈴薯10 IOOg/ L、a-萘乙酸 0. 02 0. 5mg/L、活性炭 I. O 2. 0g/L。
按照常規組培苗移栽方法將生根苗進行煉苗、晾苗，然后移栽到大田進行種植。
本發明以莫氏蘭腋芽組織為外植體，通過原球莖接分化快速繁殖莫氏蘭種苗，提高莫氏蘭種苗的繁殖速度和繁殖數量，建立了莫氏蘭組培的快速繁殖體系，為莫氏蘭種苗的大規模工廠化生產提供一條有效途徑，具有較大的經濟效益。
圖I是腋芽誘導效果圖。
圖2是原球莖誘導效果圖。
圖3是叢生芽誘導效果圖。
圖4是壯苗培養效果圖。
圖5是生根培養效果圖。
具體實施方式
下面結合實施例，對本發明的具體實施方式
作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。4
I、將基礎培養基中大量元素成分、微量元素成分、鐵鹽成分和有機物成分分別按 20倍、200倍、200倍和100倍濃度配制成儲備母液，生長調節劑6-芐氨基嘌呤、a_萘乙酸、 腺嘌呤分別配制成lmg/mL、0. 5mg/mL> lmg/mL的儲備母液,保存于4°C的冰箱中。基礎培養基pH值的調節主要用lmol/L稀鹽酸、lmol/L氫氧化鈉。
2、利用常規的培養基配制方法，配制各階段相應的培養基，其中基礎培養基按如下配方配制
①大量元素=KNO3525mg/L ；KH2PO4 250mg/L ； (Ca)3PO4 200 mg/L ；MgS04 · 7H20 250 mg/L ； (NH) 2S04 5 00mg/L ;②微量元素:FeSO4 · 7H20 27. Omg/L ；Na2-EDTA 37. 0 mg/L ； MnSO4 .H2O 10. Omg/L ；ZnSO4 *7H201. Omg/L ；H3BO31. Omg/L ;③肌醇 lOOmg/L ;④糖 lOg/L ； 瓊脂粉5. Og/L ;pH調節為5.2。
實施例一
I、腋芽誘導截取莫氏蘭莖頂端30 cm，剝除所有葉片露出莖部，取各節上的腋芽作為外植體，用75%的酒精消毒30 S，用水沖洗I 2次，在用2%次氯酸鈉溶液消毒15 min, 用水沖洗3 4次,最后用2%次氯酸鈉溶液消毒3 min,用水沖洗3 4次,整個消毒過程中間歇搖動三角瓶，這樣會使外植體充分接觸消毒液，從而達到更好的消毒效果。將消毒好的莖段切成4cm且中部至少有2個腋芽的莖段，然后將莖段上的腋芽小心摘出，不要破損生長點，接種到誘導培養基上進行培養，每瓶培養基接種2個腋芽，經過15 d左右的誘導培養，腋芽開始膨大，培養30 d左右腋芽膨大明顯，有芽點逐漸形成突起，在45 d后膨大的腋芽萌動長成小芽，腋芽四周發生脫分化，其表面分化出有少量的原球莖，長勢較強。整個誘導培養過程為暗培養，培養溫度25±1°C。誘導分化比例約為1:3。結果見表I。
所述誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁100ml/L、a_萘乙酸0. Img/ L、6-芐氨基嘌呤2. 5mg/L、腺嘌呤lmg/L。
2、原球莖增殖將原球莖轉移到增殖培養基上進行培養，45d后，原球莖可增殖5 倍，僅有小部分原球莖分化成小芽，小芽比較健壯，這類小芽可用于壯苗培養。可根據實際情況進行多次轉接增殖，一般45d轉接一次，增殖培養為暗培養，培養溫度25± 1°C。結果見表I。
所述增殖培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁100ml/L、蛋白胨I. 0g/L、 a-萘乙酸0. 05mg/L、6-芐氨基嘌呤I. 0mg/L、腺嘌呤I. 0mg/L。
3、原球莖誘導叢生芽將增殖后的原球莖轉移到叢生芽誘導培養基上分化成小芽，培養35d左右出現葉鞘的再分化，50d左右葉逐漸伸展，60d左右能明顯觀察到小芽形成。這個階段的培養光照強度為1000 2000Lx，培養溫度25± 1°C。誘導成活率在90%以上。結果見表I。
所述叢生芽誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁100ml/L、蛋白胨 I. 0g/L、香蕉 20g/L、馬鈴薯 10g/L。
4、壯苗培養將誘導產生的叢生芽接種于壯苗培養基上進行壯苗培養，培養35 45d后，小芽長成3 5 cm高的小苗，植株健壯，此階段的光照強度2000 3000 Lx，培養溫度 27±1°C。
所述壯苗培養基是在基礎培養基的基礎上添加香蕉30g/L、馬鈴薯20g/L、活性碳 I. 5g/L。
5、生根培養將3 5 cm高的小苗轉入到生根培養基中進行生根培養，光照強度 2000 3000Lx，培養溫度27 土 1°C。培養30d生根率可達到100 %，培養35 45d后，有 2 3條3厘米以上的根，經60d的培養，小苗基部即可產生大量的根系，形成完整的植株。 結果見表2。
所述生根培養基是在基礎培養基的基礎上添加香蕉50g/L、馬鈴薯30g/L、a_萘乙酸 O. 3mg/L、活性碳 I. 5g/L。
將組培瓶苗移到溫室里進行為期15天的煉苗。煉苗后，小心取出小苗，用清水沖洗基部根系上的培養基，再用70%的甲基托布津殺菌劑配制成1500倍的藥液浸泡2分鐘左右即可晾苗，然后用水苔將根系包裹好移植到穴盤中，光照強度4000 5000LX，溫度25 30°C。移栽成活率達到95%以上。結果見表2。
實施例二
實施步驟及組培瓶苗移栽方式同實施例一，結果見表I、表2。基礎培養基和各階段的培養基分別為
基礎培養基①大量元素=KNO3685mg/L ；KH2PO4 200mg/L ； (Ca)3P04 1 80 mg/L ； MgSO4 · 7H20 300 mg/L ； (NH)2SO4 400mg/L ;②微量元素FeSO4 · 7H20 22. Omg/L ；Na2-EDTA 31. 0 mg/L ；MnSO4 · H2O 11. Omg/L ；ZnSO4 · 7H202. Omg/L ；H3BO31. 5mg/L ;③肌醇 150mg/L ；@ 糖15g/L 瓊脂粉5. Og/L ；pH調節為5. 4。
誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁150ml/L、a_萘乙酸O. 3mg/L、 6-芐氨基嘌呤3. 5mg/L、腺嘌呤2mg/L。
增殖培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁130ml/L、蛋白胨I. 5g/L、a_萘乙酸O. 2mg/L、6-芐氨基嘌呤3. Omg/L、腺嘌呤2. 5mg/L。
叢生芽誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁180ml/L、蛋白胨I. Og/ L、香蕉50g/L、馬鈴薯40g/L。
壯苗培養基是在基礎培養基的基礎上添加香蕉60g/L、馬鈴薯40g/L、活性碳 I. 0g/L。
生根培養基是在基礎培養基的基礎上添加香蕉20g/L、馬鈴薯40g/L、a_萘乙酸0.lmg/L、活性碳 2. 0g/L。
實施例三
實施步驟及組培瓶苗移栽方式同實施例一，結果見表I、表2。基礎培養基和各階段的培養基分別為
基礎培養基①大量元素=KNO3 890mg/L ；KH2PO4 170mg/L ； (Ca)3P04 250 mg/L ； MgSO4 · 7H20 350 mg/L ； (NH)2SO4 700mg/L ;②微量元素FeSO4 · 7H20 20. Omg/L ；Na2-EDTA 28. 0 mg/L ；MnSO4 · H2O 8. Omg/L ；ZnSO4 · 7H202. 5mg/L ；H3B032. Omg/L ;③肌醇 200mg/L ；@ 糖16g/L 瓊脂粉4. 8g/L ；pH調節為5. 3。
誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁180ml/L、a_萘乙酸0. 2mg/L、 6-芐氨基嘌呤4. 0mg/L、腺嘌呤I. 5mg/L。
增殖培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁160ml/L、蛋白胨I. 2g/L、a_萘乙酸0. 3mg/L、6-芐氨基嘌呤2. 0mg/L、腺嘌呤2. 0mg/L。
叢生芽誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁150ml/L、蛋白胨2. Og/L、香蕉70g/L、馬鈴薯60g/L。
壯苗培養基是在基礎培養基的基礎上添加香蕉50g/L、馬鈴薯70g/L、活性碳I.5g/L。
生根培養基是在基礎培養基的基礎上添加香蕉70g/L、馬鈴薯50g/L、a_萘乙酸O.3mg/L、活性碳，I. Og/L。
表I莫氏蘭腋芽組織培養誘導率
權利要求
1.ー種利用莫氏蘭腋芽組織培養組培苗的快速繁殖方法，包括腋芽誘導過程、原球莖增殖過程、原球莖誘導叢生芽過程、壯苗培養過程、生根培養過程，其具體步驟如下 1)、腋芽誘導過程 將經過消毒的腋芽接種于誘導培養基上進行培養，培養條件暗培養，溫度23 27°C ；·培養至腋芽表面分化出原球莖；所述誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁I ·200ml/L、a-萘こ酸O. 02 O. 5mg/L、6_節氨基嘌呤I 5mg/L、腺嘌呤O. 5 3mg/L ； 所述基礎培養基的成分和含量分別為①大量元素KN03450 1000mg/L、KH2P04150 ·250mg/L、(Ca) 3P04150 250mg/L、MgSO4 · 7H20200 370mg/L、(NH) 2S04350 800 mg/L ；②微量元素=FeSO4 · 7Η2018· 5 27. 8mg/L、Na2_EDTA24. 86 37. 3mg/L、MnSO4 · Η207· 5 ·14. 8mg/L、ZnS04 ·7Η201 3. 2mg/L、H3B03l 2. 5mg/L ;③肌醇 I 250mg/L 糖 I 20g/·L ;⑤瓊脂 4. 5 5. 5g/L ;pH 為 5. I 5. 4 ; 2)、原球莖增殖過程 將原球莖接種于增殖培養基上進行増殖培養，培養條件暗培養，溫度23 27°C ；40 ·50d轉移一次；所述增殖培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁I 200ml/L、蛋白胨·1 2. 00g/L、a_萘こ酸O. 02 O. 5mg/L、6_節氨基嘌呤I 5mg/L、腺嘌呤O. 5 3mg/L ； 3)、原球莖誘導叢生芽過程 將增殖后的原球莖接種于叢生芽誘導培養基上進行叢生芽誘導培養，至分化形成小芽，培養條件光培養，光照強度為1000 2000Lx，溫度23 27°C;所述叢生芽誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加椰子汁I 200ml/L、蛋白胨I 2. 00g/L、香蕉10 IOOg/L、馬鈴薯10 100g/L ； 4)、壯苗培養過程 將叢生芽接種于壯苗培養基上進行壯苗培養，培養條件光培養，光照強度為2000 ·3000Lx，溫度26 29°C;培養35 45d后，小芽長成3 5 cm高的小苗；所述壯苗培養基是在基礎培養基的基礎上添加香蕉10 100g/L、馬鈴薯10 100g/L、活性炭I. O 2. Og/L ； 5)、生根培養過程 將小苗轉入到生根培養基中進行生根培養，培養條件光培養，光照強度為2000 ·3000Lx，溫度26 29°C ;生根培養60d后，小苗基部產生大量的根系，形成完整的植株；所述生根培養基是在基礎培養基的基礎上添加香蕉10 100g/L、馬鈴薯10 100g/L、a-萘こ酸 0. 02 0. 5mg/L、活性炭 I. O 2. 0g/L。
全文摘要
本發明屬植物栽培技術領域，涉及一種利用莫氏蘭腋芽組織培養組培苗的快速繁殖方法，包括腋芽誘導過程、原球莖增殖過程、原球莖誘導叢生芽過程、壯苗培養過程、生根培養過程。本發明以莫氏蘭腋芽組織為外植體，通過原球莖接分化快速繁殖莫氏蘭種苗，提高莫氏蘭種苗的繁殖速度和繁殖數量，建立了莫氏蘭組培的快速繁殖體系，為莫氏蘭種苗的大規模工廠化生產提供一條有效途徑，具有較大的經濟效益。
文檔編號A01H4/00GK102972293SQ20121050857
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月4日 優先權日2012年12月4日
發明者刑孔惠, 孫崇格 申請人:三亞柏盈熱帶蘭花產業有限公司