專利名稱：基因OsBBX22b在延遲水稻開花期方面的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程技術領域，具體涉及基因0sBBX22b在延遲水稻開花期方面的應用。
背景技術：
開花期(從種子萌發到始穗的時間，days to flowering)是水稻及禾谷類農作物的重要農藝性狀之一，開花期長短直接反映了水稻品種生育期長短，適宜的生育期在維持水稻高產穩產中扮演著關鍵角色(Tsuji et al.，Rice，2008，1:25-35 ;胡時開等，中國水稻科學，2012，26(3) :373-382)。一直以來，水稻開花期調控機制是分子生物學家和育種家關注和研究的熱點。開花期由許多基因控制，而這些基因的表達水平與環境因子如日照長度和溫度密切相關。
光周期調控的開花期是一個復雜的系統過程。葉片測定光周期產生可移動的開花信號(稱為成花素，florigen)，該信號從葉片移至莖頂端，然后莖頂端分生組織感受信號啟動花芽形成。水稻是典型的短日植物，短日(SD)條件誘導Hd3a (Heading date3a)的表達。 在SD條件下，Hd3a在葉片韌皮組織中表達上調，這些蛋白質轉移至頂端分生組織，誘導花芽的啟動，因此 Hd3a 被稱為成花素(Tamaki et al. Science, 2007，316:1033-1036)。在植物中最保守的光周期調控開花途徑是GI (gigantea) -CO (constans) -FT (glowering locus T)。在擬南芥中，該途徑僅僅在長日(LD)條件下有活性，這是因為在LD條件下CO的表達在光期結束時表達提高，這樣避免了暗條件下COPl對其降解作用，從而保證有充足的CO誘導 FT的表達，然而SD條件下，CO積累出現在暗期，CO蛋白質一旦產生會立即被降解。水稻中對應的光周期開花途徑是OsGI-Hdl (Heading datel) _Hd3a，它們分別是擬南芥GI、CO和 FT的直系同源基因。OsGI是Hdl的激活子，其表達顯示生物節律性，表達峰值出現在光期結束時。Hdl編碼Β-box鋒指蛋白，其C端含有CCT結構域(constans, constans-like, and timing of cab expression)。在SD條件下，hdl突變體中Hd3a的表達水平降低。Hdl在暗期中間表達水平最高，Hd3a在光期開始時表達水平最高。在SD條件下，Hd3a表達的另一個激活子是Ehdl (Early heading datel),它是一種B型響應調節子(B-type response regulator) (Doi et al. Genes Dev, 2004，18:926-936)。Ehdl 在擬南芥中無直系同源基因，它的表達受 0sMADS51 和 Ehd2/RIDl/0sIDl 的上調(Wu et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105:12915-12920; Itoh et al.，Nat Genet, 2010，42:635-638))。此外，OsGI 通過0sMADS51或者通過藍光信號激活Ehdl在光期開始時大量表達(Kim et al.，Plant Physiol, 2007，145:1484-1494)。
然而，LD條件抑制Hd3a表達。在LD條件下，Hdl抑制Hd3a的表達，Hd3a的表達水平相當低，這樣0sGI-Hdl-Hd3a形成了一個開花阻遏途徑。光敏色素介導的信號是Hdl 從SD下的促進子轉變成LD下的阻遏子的重要調節因子。LD下，Hdl阻遏子的功能還被 CK2 (casein kinase2)活性增強。此外，在LD下，Hd3a的表達也被Ehdl上調，而Ehdl被 Ghd7 (Grain number, plant height and heading date7)抑制。在 LD 下，Ghd7 的表達被特異性地上調，因此Ghd7通過抑制Ehdl-Hd3a途徑而下調Hd3a表達，從而抑制開花(Xue et al. , Nat Genet, 2008，40 (6) : 761-767)。另外 E3 泛素連接酶 SPLll (Spotted IeaflI) 通過與其相互作用蛋白質SPIN相互作用而抑制Hd3a的表達。在長日條件下，0sMADS56、 LECl 和 FUSCA-LIKE1 (OsLFLl)能夠消弱 Ehdl 的表達。
水稻是短日植物，但是在LD條件下，水稻最終也能開花。這可能是因為，盡管LD下 Hd3a的表達相當低，但是殘余的Hd3a也能夠最終誘導水稻開花。然而Hd3a RNAi轉基因植株在SD條件下開花延遲，但在LD下對開花無影響。據此推測，除了 Hd3a，還有其他成花素控制開花。后來研究表明RFTl (rice flowering locusl)是另一個成花素(Komiya et al., Development, 2009, 135:3443-3450)0RFTlRNAi株系對SD下的花期無影響，但明顯延遲長日照下的開花。可見水稻根據光周期不同利用兩種成花素Hd3a和RFTl控制開花(Komiyaet al. , Development, 2008，135:767-774)。當Hd3a和RFTl的表達均被抑制時，水稻不能開花， 這表明水稻開花完全依賴于成花素活性。在長日條件，RFTl促進開花，其表達受0sMADS50 和Ehdl正調控，0sMADS50-Ehdl-RFTl這條途徑也是LD下所特有的。Ghd7通過抑制Ehdl的表達而下調 RFTl 基因的表達(Osugi et al.，Plant Physiol, 2011，157 (3) : 1128-1137.)。 Hd3a或者RFTl作為成花素從葉片移至頂端分生組織，促進0sMADS14和0sMADS15基因的表達，從而啟動生殖生長的開始(Komiya et al.，Development, 2009，135:3443-3450)。發明內容
本發明從水稻日本晴中分離克隆到B-box鋅指蛋白的0sBBX22b基因(進化樹分析表明，該蛋白質與擬南芥的BBX22屬于同一個分支，該基因編碼的氨基酸序列與擬南芥的 AtBBX22蛋白質同源性為68%，故命名為0sBBX22b)，該基因在水稻中過量表達后，轉基因陽性植株的開花時間明顯較非轉基因植株延遲，在長日條件下延遲8-10天，在短日條件下延遲15天。因此，在水稻中過量表達0sBBX22b基因對于延遲水稻開花期具有重要意義，這為調控水稻及其它植物開花時間提供了新的基因資源和新思路。
本發明申請人在一個水稻光敏色素突變體中，利用基因表達圖譜鑒定到一個序列號為AK106865的、編碼B-box鋅指蛋白的0sBBX22b基因的信使RNA序列。水稻0sBBX22b 基因信使RNA序列為2055個堿基，編碼377個氨基酸和一個終止密碼子。本發明是通過 PCR方法，擴增出水稻品種日本晴的0sBBX22b基因的全長編碼區，包含1134個堿基，正向連接在植物表達載體pCAMBIA1390-ubi上；再進行遺傳轉化至水稻中，提高0sBBX22b基因的表達，得到0sBBX22b基因表達增強的轉基因水稻植株。在轉基因的T3代植株中發現，試驗田條件下(5月_9月，山東濟南，長日條件)，陽性轉基因水稻植株的開花期較非轉基因植株延遲了 8-10天，而在短日條件下(9小時光照，30° C± I ; 15小時黑暗，27° C±l)，轉基因水稻的開花時間較非轉基因水稻延遲了約15天。利用熒光定量分析結果表明，0sBBX22b 過量表達抑制了開花素編碼基因Hd3a和RFTl的表達，從而延遲了水稻開花。
本發明用于構建過量表達0sBBX22b基因的植物表達載體、增強0sBBX22b基因表達的DNA序列如SEQ ID NO I所不，氣基酸序列如SEQ ID NO 2所不。
本發明利用水稻品種日本晴的0sBBX22b基因的cDNA片段作為應用基因，將該基因正向轉入水稻中，提高0sBBX22b基因的表達水平，轉基因水稻植株表現出開花期延遲。
本發明的優點在于
(I)本發明提供了一種延遲開花的水稻基因0sBBX22b的應用。申請人在水稻中過量表達0sBBX22b基因表達后，發現轉基因陽性植株的開花期延遲。
(2)本發明首次分離克隆了水稻0sBBX22b基因，并首次在水稻中過量表達了 0sBBX22b基因。為改良過早成熟的水稻品種提供了新的思路，也為其它作物利用異源基因技術延遲開花期提供了理論支持。
(3)本發明首次揭示了水稻0sBBX22b基因延遲開花的機制，為水稻等禾谷類作物以及其它作物改良開花期的研究提供支持。
圖I為本發明的0sBBX22b基因表達載體的構建示意圖。將克隆在pMD18_T載體上的0sBBX22b基因利用BamHI和SpeI酶切，替換pCAMBIA1390_ubi植物表達載體上BamHI 和SpeI之間的DNA片段，這樣0sBBX22b基因正向插入玉米泛素基因啟動子(Pubi)后，即 pCAMBIA1390-ubi-BBX22b 植物表達載體。
圖2為檢測T3代轉基因水稻陽性植株中0sBBX22b基因轉錄本相對表達水平結果圖。其中0sBBX22b-0X表示轉0sBBX22b基因的植株，#3、#5、#7、#16和#17代表獨立的陽性轉基因株系；WT代表野生型水稻植株。EF-Ia作為熒光定量PCR分析的內參基因。
圖3為轉0sBBX22b基因水稻植株和野生型植株在大田條件及短日條件下開花時間比較圖。A圖是大田條件下的開花時間，材料生長在山東濟南，生長期是2012 年5月-2012年10月；B圖是短日條件下的開花時間，短日光周期條件是9小時光照 (30° C±l)/15小時黑暗(27° C±l)。C圖是短日條件下轉0sBBX22b基因水稻株系(#7) 與野生型植株開花期表型圖。其中0sBBX22b-0X表示轉0sBBX22b基因的植株，#3、#7和 #16代表三個獨立的陽性轉基因株系；WT代表野生型水稻植株。
圖4為轉0sBBX22b基因水稻植株和野生型植株生物鐘節律比較圖。A圖是 0sBBX22b基因和生物鐘核心組分基因(OsLHY和OsPRRl)在非轉基因水稻中的表達模式圖； B圖是0sBBX22b基因和生物鐘核心組分基因(OsLHY和OsPRRl)在0sBBX22b轉基因植株中的表達模式圖。其中0sBBX22b-0X表示轉0sBBX22b基因的植株(#7株系)；WT代表野生型水稻植株。
圖5為轉0sBBX22b基因水稻植株和野生型植株中開花相關基因的表達水平比較圖。其中0sBBX22b-0X表示轉0sBBX22b基因的植株，#7和#16代表獨立的陽性轉基因株系；WT代表野生型水稻植株。Hd3a和RFTl是水稻的兩個開花素基因；Hdl和Ehdl是兩個開花素基因的上游基因。6:00、10:00、14:00和18:00代表取材時間是上午6點和10點，下午2點和6點。
圖6為0sBBX22b基因延遲水稻開花期的機制圖。生物鐘調控0sBBX22b基因的表達，而0sBBX22b抑制成花素編碼基因Hd3a和RFTl基因的表達，從而延遲水稻開花期。
具體實施方式
以下實施例定義了本發明，并描述了本發明在分離克隆用于構建0sBBX22b基因植物表達載體的DNA片段，以及驗證功能的方法。根據以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，并且在不偏離本發明精神和范圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其使用不同的用途和條件。
實施例I :分離克隆用于構建0sBBX22b基因植物表達載體的DNA片段
采用TRIZOL試劑(Invitrogen)從水稻品種日本晴(公開報道的一個品種)的葉片中提取總RNA。具體步驟如下將20毫克葉片放至液氮預冷的研缽中，加入液氮快速磨成粉末，將粉末裝入I. 5ml離心管中,迅速加入Iml Trizol (Invitrogen)顛倒混勻,室溫靜置 5分鐘。在4°C，12000rpm離心10分鐘，取上清液移至新的1.5ml離心管中。加入200 μ I 氯仿，用手劇烈搖動15秒鐘，室溫靜置2 — 3分鐘。4°C，12000rpm離心15分鐘。取無色水相至一新的I. 5ml離心管中，加入250 μ I異丙醇，250 μ I高鹽溶液，顛倒混勻，室溫靜置 10分鐘。4°C，12000rpm離心10分鐘，吸除上清液。加入Iml冰冷的75%乙醇，上下倒置幾次，然后4°C，7500rpm離心5分鐘，棄上清，在室溫下干燥至沉淀變透明。加入適量的DEPC 水(一般為60 μ I)溶解沉淀，利用紫外分光光度計測定RNA的濃度。
利用反轉錄酶SuperScript II (Invitrogen)將其反轉錄成cDNA,具體步驟如下 依次加入 I μ 1500 μ g/ml oligo (dT)12_18、2 μ g 總 RNA、I μ IlOmM dNTP 混合物和 DEPC 水至12μ 1，在65°C水浴中5分鐘，迅速冰浴5分鐘，稍微離心收集樣品于管底。然后依次加入 4μ 15 X 第一鏈緩沖液、2 μ 10. IM DTI^Plyl RNaseOUT (40U/μ I )，42°C，2 分鐘。然后加入I μ ISuperScript II，輕微混合均勻，42°C反應50分鐘，然后70°C水浴15分鐘使酶失活，這樣就合成了第一鏈cDNA，以第一鏈cDNA為模板擴增目的基因。用帶有酶切位點的上游引物 0sBBX22bF (5’ -ATGGATCCATGTCGCCTCCTCCTCCACCATATTA-3’，SEQ ID N0:3)，序列特異引物外加BamHI位點和兩個保護堿基；和下游引物0sBBX22bR(5’-AACTAGTTTATTGCC TCCGGCGTTTGGAGGTG-3’，SEQ ID NO :4)，序列特異引物外加SpeI位點和兩個保護堿基。利用 PrimerSTAR HS DNA polymerase with GC buffer (TaKaRa)擴增目的片段,PCR 反應條件是94°C預變性I分鐘；98°C 10 #,68°C 4分鐘，30個循環。利用TArget Clone TM-Plus 試劑盒(Τ0Υ0Β0)在PCR產物末端加A。然后連接到pMD18-T載體(TaKaRa)。篩選陽性克隆并測序，獲得所需DNA片段(序列如SEQ ID NO 1所示)，將該克隆命名為pMD18_0sBBX22b cDNA。
實施例2 0sBBX22b基因植物表達載體的構建和遺傳轉化
為了能更好地分析0sBBX22b的功能，申請人通過過量表達技術使0sBBX22b基因在水稻中表達水平提聞。根據轉基因植株的農藝性狀特征研究該基因的功能。
0sBBX22b基因植物表達載體的構建方法如下首先將實施例I中得到的陽性克隆pMD18-0sBBX22b cDNA用BamHI和SpeI雙酶切，回收插入片段；并用同樣的方法酶切pCAMBIA1390-ubi的植物表達載體，回收載體片段。用回收的插入片段和載體片段做連接反應，轉化大腸桿菌XLl-Blue。通過酶切篩選陽性克隆，獲得植物表達載體，命名為 pCAMBIA1390-ubi-BBX22b (見圖I)。pCAMBIA1390_ubi是在國際常用的植物遺傳轉化載體 (見圖I)。將pCAMBIA1390-ubi-BBX22b轉化至農桿菌菌株EHA105。
通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化體系(參見本發明后面的實施例)將其導入到水稻品種日本晴中，經過預培養、侵染、共培養、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、移苗得到轉基因植株。農桿菌介導的水稻遺傳轉化體系在Hiei等人報道的方法基礎上進行改良(Hiei等，1994，PlantJ.，6:271-282)。轉化共獲得18株獨立的轉基因水稻植株。
具體步驟如下
(I)愈傷誘導去殼的野生型日本晴水稻種子,用70%乙醇表面消毒I分鐘；5%(活性氯含量)NaClO溶液表面消毒20分鐘；無菌水沖洗4-5次；播種于愈傷誘導培養基上誘導愈傷組織(成分見后)，于25-26°C暗培養4-7天后，將從成熟胚盾片處誘導出初生愈傷組織，同時用鑷子去掉胚上長出的胚芽，繼代于愈傷誘導培養基繼續培養2周，直至長出色澤淡黃，質地堅硬呈顆粒狀的胚性愈傷組織。
(2)愈傷組織的預培養將愈傷組織轉至新鮮的愈傷誘導培養基培養，于25_26°C 暗培養4天。
(3)農桿菌培養挑取農桿菌單克隆接種到5mLYEP液體培養基中(含有50mg/L的卡那霉素)，280C，220rpm,培養至對數生長晚期(大約培養18-24小時)。將獲得的菌液按1% 接種量轉接到50mL新鮮的、含有50mg/L卡那霉素的AB液體培養基中(成分見后)；28°C, 220rpm,培養至0D600值為O. 5左右(培養5-6小時)。
(4)農桿菌侵染把50mL菌液轉入離心管，4°C，4000g離心10分鐘，棄上清，加入等體積的AAM培養基重懸菌體。把(2)的日本晴胚性愈傷組織浸入上述AAM菌液，侵染2分鐘，緩慢搖動。用無菌吸水紙將愈傷組織吸干，置于共培養培養基上(培養基上鋪一層無菌濾紙)，26 0C，黑暗共培養2-3天。
(5)愈傷洗滌和選擇培養共培養后的愈傷組織用無菌水洗4次，然后再用含 500mg/L羧芐青霉素Cb的無菌水洗2次，再用無菌吸水紙吸干后置于工作臺吹30分鐘。將愈傷組織置于固體篩選培養基(含有25mg/L潮霉素，400mg/L羧芐青霉素)上，26°C暗培養2 周。然后轉移到固體篩選培養基(含有30mg/L潮霉素，300mg/L羧芐青霉素)上，26°C暗培養，每2周繼代一次，篩選4周。
(6)分化培養把抗性愈傷組織轉移至分化培養基上，28°C光照培養7天，轉接一次后，培養至產生再生苗。
(7)壯苗、移栽將再生的小植株轉至新鮮的1/2MS培養基上，于培養瓶中生根壯苗。待小苗長至IOcm左右，打開封口膜，煉苗2-3天，將再生苗移至土中培養。
試劑配方
(I)試劑和溶液縮寫本發明中作用到的植物激素的縮寫表示如下Cb (Cabenicillin,羧節青霉素);KT (Kinetin,激動素);NAA (Napthalene acetic acid,萘乙酸);2,4_D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2, 4_ 二氯苯氧乙酸);AS (Acetosyringone, 乙酸丁香酮)；DMS0 (Dimethyl sulfoxide, 二甲基亞諷)。
(2)用于水稻遺傳轉化的培養基配方
1)YEP液體培養基2g Bacto-蛋白胨，2g酵母粉，Ig NaCl，加水定容至200mL，用 5N NaOH 調 PH 至 7. O。
2)愈傷誘導培養基N6大量，N6微量，鐵鹽，N6維生素，O. 5g/L酸水解酪蛋白，30g/ L 鹿糖，2mg/L2, 4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH5. 8。
3) AB 液體培養基3g/LK2HP04, lg/LNaH2P04, lg/LNH4Cl, 300mg/LMgS04 · 7H20, 150mg/L KCl, lOmg/L CaCl2 · 2H20, 2. 5mg/L FeSO4 · 7H20，5g/L 葡萄糖，ρΗ7· 0。
4)AAM培養基AA大量，AA微量，0.9g/L L-谷氨酰胺，O. 3g天冬氨酸，MS維生素，O.5g/L 酸水解酪蛋白，36g/L 葡萄糖,68. 5g/L 鹿糖，20mg/LAS, pH5. 2。
5)共培養培養基N6大量，N6微量，鐵鹽，N6維生素，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，O. 5g/L 酸水解酪蛋白，2mg/L2, 4_D，20mg/LAS，Gelrite (Sigma) 4g/L，ρΗ5· 8。
6)固體篩選培養基Ν6大量、Ν6微量和Ν6維生素，O. 5g/L酸水解酪蛋白，30g/L 鹿糖，2mg/L2, 4-D, Gelrite (Sigma) 4g/L, pH5. 8,合適濃度的潮霉素和羧節青霉素。
7)分化培養基MS大量，MS微量，鐵鹽和MS維生素，2g/L酸水解酪蛋白，30g/L蔗糖，30g/L 山梨醇，2mg/LKT，0. 2mg/LNAA, pH5. 8，30mg/L 潮霉素 B，200mg/L 羧芐青霉素。
8) 1/2MS 培養基1/2MS 大量，1/2MS 微量，MS 維生素，30g/L 蔗糖，4g/L Gelrite, 30mg/L潮霉素B，200mg/L羧芐青霉素，pH5. 8.
(3)主要溶液配方
I )N6 大量元素(IOX)
KNO328.3 g4.0 g LS5 g 1.66 g 4.63 gKH2PO4MgSO4IH2OCaCl2*2H20(NH4)2SO4
用水定容IL
2) N6 微量(1000X):
MnSOr-IHnOZnSO4TH2OH, BO34.400 g 1.500 g1.600 g 0.800 g 0.250 gNaMo04-2H20
用水定容IL
3)N6 維生素(1000X)
imm鹽_硫胺素BI 鹽_吡哆素B6煙_肌醇200 mg 100 mg 50 mg 50 mg IOg
用水定容IOOmL
3) MS 大量元素(IOX)
權利要求
1.基因OsBBX22b在延遲水稻開花期方面的應用，所述基因OsBBX22b的DNA序列如SEQID NO 1 所示。
2.如權利要求I所述的基因OsBBX22b在延遲水稻開花期方面的應用，其特征是，基因OsBBX22b過量表達抑制了開花素編碼基因Hd3a和RFTl的表達，從而延遲了水稻開花。
3.基因OsBBX22b延遲水稻開花期方面的應用方法，其特征是，通過PCR方法，擴增出水稻品種日本晴的OsBBX22b基因的全長編碼區，正向連接在植物表達載體pCAMBIA1390-ubi上；再進行遺傳轉化至水稻中，提高OsBBX22b基因的表達，得到OsBBX22b基因表達增強的轉基因水稻植株，陽性轉基因水稻植株在長日條件下和在短日條件下均表現出開花期延遲，所述基因OsBBX22b的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。
全文摘要
本發明公開了基因OsBBX22b在延遲水稻開花期方面的應用。本發明通過PCR方法，擴增出水稻品種日本晴的OsBBX22b基因的全長編碼區，正向連接在植物表達載體pCAMBIA1390-ubi上；再進行遺傳轉化至水稻中，提高OsBBX22b基因的表達，得到OsBBX22b基因表達增強的轉基因水稻植株。在轉基因的T3代植株中發現，長日條件下陽性轉基因水稻植株的開花期較非轉基因植株延遲了8-10天，而在短日條件下，轉基因水稻的開花時間較非轉基因水稻延遲了約15天。本發明利用熒光定量分析結果表明，OsBBX22b過量表達抑制了開花素編碼基因Hd3a和RFT1的表達，從而延遲了水稻開花。
文檔編號A01H5/00GK102978217SQ20121057269
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者謝先芝, 周晉軍, 王盈盈, 趙杰, 吳修 申請人:山東省水稻研究所