一種鑒定水稻Wx-mw基因的方法及其在優質水稻培育中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物育種技術領域，具體涉及一種鑒定水稻低直鏈淀粉含量突變基因 Wx-mw不同基因型的四引物PCR分子標記方法以及利用該分子標記培育具優良食味品質水 稻品種的方法。
【背景技術】
[0002] 水稻作為我國乃至世界范圍內的重要糧食作物對保障我國糧食安全具有重要的 作用。近幾十年來，我國水稻產量不斷提高，尤其是隨著國民消費水平和生活品味的提高， 對多樣化優質稻米的需求越來越多。
[0003] 稻米品質表現為多樣性，就優質食用而言，主要包括碾磨品質、外觀品質、蒸煮與 食味品質和營養品質四個方面，這些品質性狀直接決定了稻米的商品價值和消費者的消費 行為。蒸煮與食味品質稻米品質構成中的最重要方面，由于胚乳是稻米的主要食用部分，而 其中的淀粉又是其主要組份。因此，淀粉的組成與結構尤其是直鏈淀粉的含量是決定稻米 蒸煮與食味品質的最重要因素（Tian等，PNAS. 2009(51)21760-21765)。
[0004] 由水稻蠟質基因（Waxy，Wx)編碼的顆粒結合淀粉合成酶GBSSI主要負責 直鏈淀粉的合成，該基因的不同等位變異決定了稻米直鏈淀粉含量的多少（Wang等， PlantJournal. 1995(4) 613-622)。截止目前至少有7個已發表的Wx等位基因。在 懦稻中，由于第二外顯子中缺失23bp造成了wx轉錄提前終止（Wanchana等，Plant Science. 2003 (6) 1193-1199)。在非糯品種中，Wx基因主要分化為Wx-a和Wx-b兩種等 位類型。其中，攜帶Wx-a的稻米直鏈淀粉含量都很高（25%以上），屬于高直鏈淀粉類 型。Wx-b主要分布在粳稻品種中，攜帶該基因稻米的直鏈淀粉含量屬中等至較低水平 (15-18%左右）。與Wx-a相比，Wx-b的變異是由第一內含子剪接位點處G-T變異造成的， 突變降低了前體mRNA的剪接效率從而減少了GBSSI的量進而導致了較低的直鏈淀粉含量 (Wang等，PlantJournal. 1995(4)613-622)。此外，Mikami等克隆了Wx_in等位基因，證 明在第六外顯子上發生的A-C變異使直鏈淀粉含量降至中等水平（18-20% ) (Mikami等， TheorApplGenet. 2008(7)979-989)。除了上述常規等位基因外，還有3個"暗胚乳基因" 被克隆，即Wx-mq、Wx-mp和Wx_op。與Wx_b相比，Wx-mq在第四和第五外顯子處存在兩處 突變，導致直鏈淀粉含量降到10 %左右（Sato等，BreedingResearch. 2001 (3) 13-19)。 等位基因Wx-mp，是在Wx-mq基礎上第五外顯子發生了回復突變，攜帶該等位基因的稻米 直鏈淀粉含量也在10%左右（Yang等，PlantBreeding.2013(6)595-603)。另一個軟米 基因為Wx-〇p(或者Wx-hp)是由第4外顯子的A-G突變造成的（Mikami等，TheorAppl Genet. 2008(7)979-989)。
[0005] 低直鏈淀粉含量基因是進行低直鏈淀粉水稻品種選育的重要遺傳資源。在水稻 中，攜帶暗胚乳基因Wx-mp、Wx_mq和Wx-op的稻米具有非常好的食味表現。利用這些等位基 因，目前已選育出了很多具有優良食味品質的優質稻米，如江蘇最好吃大米"南粳46"（王 才林等，中國水稻科學.2009, 23 (I) 25-30)。然而由于直鏈淀粉含量較低，這類稻米在 含水量低的時候表現為云霧狀、乳白色、透明度差等暗胚乳的特性（SatoH等，Breeding Sci，2002, 52(2) 131-135)，嚴重影響了稻米的外觀品質。因此，通過挖掘特定的Wx等位變 異基因，使得稻米在適當降低直鏈淀粉含量、具有優良食味表現的基礎上，保持優良的外觀 品質，是水稻品質改良的重要基礎。
[0006] 發明人在前期研究中分離克隆了水稻中一個新的控制低直鏈淀粉含量的Wx等位 基因Wx-mw，該基因來源于秈稻品種魔王谷。通過直鏈淀粉測定，攜帶Wx-mw的水稻直鏈淀 粉含量在13%左右，顯著低于含Wx-b的常規水稻品種、但略高于暗胚乳稻米（10%左右）。 因此，Wx-mw在優良食味稻米新品種的培育中具有重要的應用價值。
[0007] 目前，基于DNA變異的分子標記在水稻遺傳改良中發揮了非常重要的作用。在水 稻品質改良研究方面，不同的研究者已針對不同的Wx等位基因開發出了相應的分子標記， 如分別針對第一內含子和第六外顯子SNP變異位點開發出了基于限制性內切酶的CAPS分 子標記（Chen,JournalofCerealScience. 2008 (48) 781-788)，針對水稻暗胚乳突變基因 Wx-mq開發了顯性PCR分子標記（Sato等，BreedingSci. 2002 (52) 131-135)和CAPS分子 標記等（Chen等，RiceSci. 2009 (16) 106-110)。上述分子標記尤其是CAPS標記操作繁瑣， 且常常存在酶切不完全現象而造成難以準確鑒定不同的基因型的現象。有關Wx-mw等位基 因目前并未見報道，也沒有相關分子標記的開發。因此，建立一種基于PCR技術的快速、準 確鑒定水稻低直鏈淀粉含量突變基因Wx-mw的分子標記是加快該新等位基因在稻米品質 改良應用中的重要工具。
【發明內容】
[0008] 本發明針對發明人前期分離克隆的水稻中一個新的控制低直鏈淀粉含量突變基 因Wx-mw的特異突變位點，即在Wx第一內含子剪切位點G和T的差異以及第六外顯子第62 個堿基位點上A和C的差異，開發出了一種基于四引物擴增受阻突變體系PCR的特異分子 標記，特異地用于鑒定Wx-mw基因。該分子標記與低直鏈淀粉含量性狀完全連鎖，在水稻生 長的任何時期任何組織均可對其進行基因型檢測。
[0009] 本發明公開了 Wx-mw等位基因第一內含子第二個堿基和Wx-mw等位基因第六外顯 子62bp的堿基作為鑒定水稻Wx-mw基因的分子標記的應用。
[0010] 本發明還公開了一組用于鑒定水稻Wx-mw基因的特異性引物，其特征在于，由下 列4對引物組成：
[0011] ⑴分子標記1的兩對引物：
[0012]正向外引物Wx-mw-〇utl-F:5'-AAGTCGGmTGCmTGGIT-3'（SEQ IDNO. 1)，
[0013]反向外引物Wx_mw-〇utl-R:
[0014] 5'-CCCCTGGGTATGTTTCTCTAGACTCT-3'（SEQ IDNO. 2);
[0015]正向內引物Wx-mw-inl-F:
[0016] 5,-TTCATCAGGAAGAACATCTGCTAGG-3,（SEQ IDNO. 3)，
[0017]反向內引物Wx-mw-inl-R:5' -GGAAACAAAGAATTATAAACAAATATGTAGAA-3'（SEQ ID NO. 4)；
[0018] 所述分子標記I是指Wx-mw等位基因第一內含子第二個堿基位點；
[0019] (2)分子標記2的兩對引物如下：鑒定Wx-mw與Wx-a/b/mq/mq/op的兩對正向外
[0020] 反向外引物Wx-mw-〇ut2-R:5'-GTAGATGCCAITGGGCTGGTAGT-3'（SEQIDNO. 6)
[0021] 正向內引物Wx-mw-in2-F: 5' -AACAACCCATACTTCAAAGGAACATC-3'（SEQIDNO. 7)
[0022] 反向內引物Wx-mw_in2-R:
[0023] 5,-TCTTGAGATCAATTGTAACTCCCCAT-3,（SEQIDNO. 8);
[0024] 所述分子標記2是指Wx-mw等位基因第六外顯子62bp的堿基位點。
[0025] 本發明還提供了一種鑒定水稻Wx-mw基因的方法，用上述的4對引物擴增水稻品 種的基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳后在紫外光下觀察DNA條帶的大小來鑒定Wx-