專利名稱：從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及一種提取生物蛋白質的方法，尤其是一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法。
背景技術：
魚粉作為重要的飼料原料之一，具有蛋白質含量高、營養均衡、利于飼養動物的吸收利用；魚類脂肪中含較大比例的多不飽和脂肪酸，如二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)，對飼養動物幼體的正常生長發育具有良好促進作用；魚粉也是良好的鈣、磷、碘、硒等礦物質的來源，此外，魚粉還含有多種維生素，因此魚粉是廣泛使用且難以替代的優良飼料原料。然而隨著社會經濟的發展及資源的過度掠奪，有限的魚粉資源逐漸耗竭，已經帶來較嚴重的生態問題。對疾病的水平及垂直傳播的擔憂以及環境污染的持續惡化，水產品變得越來越多地被有毒化合物如重金屬、PCB、農藥等污染，迫切需要發展可以替代魚粉的新型蛋白質飼料資源。盡管已經開展了很多利用植物蛋白資源替代魚粉的研究，然而很難達到完美替代魚粉的效果，主要有如下原因氨基酸組成的均衡性(魚粉含有高水平的必需氨基酸及含硫氨基酸)，蛋白質的生物利用度(魚粉中氨基酸主要以非常容易消化吸收的小肽形式存在)，必需的多不飽和脂肪酸含量(魚粉中含有較多的多不飽和脂肪酸，如二十二碳六烯酸DHA的含量為O. 03% O. 9%)等。海洋產油微藻中含有豐富的脂肪酸、蛋白質和維生素等營養成分，是一種很好的可再生資源，也是魚類體內的多不飽和脂肪酸的原始來源。以裂壺藻(Aurantiochytriumsp)為例，其油脂含量可達細胞干重的50%以上，其中二十二碳六烯酸(DHA)的含量可占到脂肪酸含量的50%左右。提取脂肪酸的藻渣中蛋白質含量大幅提高，高達50 60%左右，同時還有殘存的多不飽和脂肪酸，是一種很好的可以全面替代魚粉的蛋白質飼料資源。裂壺藻制備多不飽和脂肪酸以及藻體作為水產餌料的安全性己經被廣泛認可，如何最大限度的利用產油微藻提取多不飽和脂肪酸生產過程的單細胞蛋白副產物是一個需要解決的問題。由此可見，現有技術有待于更進一步的發展。
發明內容
本發明為解決現有技術中的缺陷提出了一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法，該生物蛋白質可以作為魚粉蛋白質飼料的添加劑，該方法采用的原料為廢棄的裂壺藻藻渣，既節約能源又可以變廢為寶。為解決上述技術問題，本發明方案包括—種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法，所述方法包括以下步驟向裂壺藻藻洛中加入O.1 1. 5%的果膠酶,溫度40 60°C,水解2 5h ;然后加入O.1 1. 5%的蛋白酶，溫度40 60°C，水解2 5h ;噴霧干燥，進風溫度140 190°C，出風溫度60 90°C，最后制得含有生物蛋白質的干粉。上述裂壺藻藻渣是按照下述方法制備得到的
I)對裂壺藻菌株進行發酵培養的步驟；2)對得到的發酵液進行分離，收集藻體，將收集的藻體進行洗滌、油脂提取后得毛油；3)將步驟2)制得的毛油經堿煉、脫色和脫臭后得到裂壺藻油脂，剩余的即為裂壺
藻藻渣。上述裂壺藻菌株發酵培養是按照下述方法制備得到的:I)將保存在甘油管的菌株接入裝有50ml種子培養基的250ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，以150 200rpm的轉速，培養24 48h，獲得一級種子液；2)將上述一級種子液接入裝有IOOml種子培養基的500ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，轉速150 200rpm，培養24 48h，獲得二級種子液；3)將二級種子液接入裝有發酵培養基的發酵罐中，接種量2 10%v/v，通氣量
0.2 2vvm，轉速200 800rpm，罐溫20 30°C，pH6 7，得到裂壺藻油脂。上述種子培養基中碳源含量為30 60g/L，氮源含量為10 20g/L，溶劑為海水和蒸餾水的混合物，所述海水和蒸餾水按照質量比為1:1進行混合；所述碳源為葡萄糖、甘油、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉糖化液或木質纖維素糖化液；所述氮源為有機氮源或無機氮源，所述有機氮源為酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、牛肉浸膏、大豆蛋白、谷氨酸鈉或尿素，所述無機氮源為氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、氨水或硝酸鉀。上述發酵培養基中包括如下組分:葡萄糖20 60g/L，酵母提取物5 30g/L，蛋白胨5 20g/L，磷 酸二氫鉀0.5 8g/L，硫酸鎂0.5 5g/L，檸檬酸鈉0.5 5g/L，海水晶5 3(^/1，維生素則10 100mg/L，維生素B610 100mg/L，維生素B123 50mg/L，生物素2 50mg/L。上述步驟3)中的發酵方式為分批發酵、補料-分批發酵、連續發酵或半連續發酵。上述步驟2)中的分離為離心分離、板框過濾或膜過濾；所述油脂提取為機溶劑萃取、聞壓均質破壁或蛋白酶水解破壁。上述有機溶劑為環己烷、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、石油醚、乙醚、甲苯、氯仿、或幾種的混合物。上述生物蛋白質可作為魚粉蛋白質飼料添加劑。本發明提供了一種利用自主篩選的裂壺藻高產菌株經過發酵獲得的裂壺藻藻渣，并利用該裂壺藻藻渣提取生物蛋白質的方法，其藻渣經過二次酶解，蛋白質含量達50%以上，大部分蛋白質均以非常容易消化的小肽形式存在，多不飽和脂肪酸DHA含量為
0.029Γ2%，是一種很好的魚粉蛋白質飼料添加劑；本發明充分利用提取脂肪酸后廢棄的藻渣，變廢為寶增加了經濟效益，而且實現了微藻細胞的綜合利用，實現多不飽和脂肪酸的清潔生產。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明的方法做進一步詳細的說明，但本發明并不局限于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特別說明，均為常規方法；所述試劑和原料，如無特別說明，均可從商業途徑獲得。
實施例中所用的裂壺藻藻渣是裂壺藻菌株(該裂壺藻菌株可從現有渠道中獲得)經發酵培養，發酵培養完成后，將得到的發酵液進行分離，收集藻體，將收集的藻體進行洗滌、油脂提取后得毛油；將得的毛油經堿煉、脫色和脫臭后得到裂壺藻油脂和裂壺藻藻渣。具體制備方法如下一級種子液的制備將保存在甘油管的裂壺藻菌株接入裝有50ml種子培養基的250ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，以150 200rpm的轉速，培養24 48h，獲得一級種子液，上述種子培養基含有30 60g/L的碳源，10 20g/L的氮源，溶劑為海水和蒸餾水的混合物，海水和蒸餾水按照質量比為1:1進行混合；碳源可以采用葡萄糖、甘油、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉糖化液或木質纖維素糖化液；氮源可采用有機氮源或無機氮源，有機氮源為酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、牛肉浸膏、大豆蛋白、谷氨酸鈉或尿素，無機氮源為氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、氨水或硝酸鉀。二級種子液的制備將上述一級種子液接入裝有IOOml種子培養基的500ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，轉速150 200rpm，培養24 48h，獲得二級種子液，上述種子培養基和一級種子液所米用的培養基相同。將二級種子液接入裝有發酵培養基的發酵罐中，接種量2 10%v/v，通氣量O. 2 2vvm,轉速200 800rpm，罐溫20 30°C，pH6 7，得到裂壺藻油脂，上述發酵培養基中包括如下組分葡萄糖20 60g/L,酵母提取物5 30g/L,蛋白胨5 20g/L,磷酸二氫鉀
O.5 8g/L，硫酸鎂O. 5 5g/L，檸檬酸鈉O. 5 5g/L，海水晶5 30g/L，維生素BllO 100mg/L，維生素B610 100mg/L，維生素B123 50mg/L，生物素2 50mg/L，上述發酵方式可以為分批發酵、補料-分批發酵、連續發酵或半連續發酵。在上述發酵過程中，還可以增加補糖操作，保證葡萄糖的濃度為20 60g/L，所述發酵時間為80 110h，發酵結束時葡萄糖濃度不高于10g/L。裂壺藻油脂的精制及其裂壺藻藻渣的收集在以下具體實施例中詳細說明。實施例1 :對上述發酵液進行離心分離，并洗滌不溶物2次，收集不溶物藻體，加入適量水調節粘度，進行高壓均質破壁，壓力40Mpa，循環2次；加入正己烷及乙醇萃取3次，有機相蒸干溶劑，得毛油，經堿煉、脫色和脫臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油562克，含DHA38. 5% ；剩余藻渣加入1%果膠酶，50°C水解3小時，再加入1%蛋白酶，溫度50°C，作用時間3小時，噴霧干燥，進風溫度160°C，出風溫度80°C，得干粉約350克，蛋白質含量約56. 5%，DHA含量0. 02%，可以作為蛋白質飼料添加劑。實施例2 對發酵液進行離心分離，并洗滌不溶物2次，收集不溶物藻體，加入適量水調節粘度，進行酶法破壁；加入正己烷及乙醇萃取3次，有機相蒸干溶劑，得毛油，經堿煉、脫色和脫臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油551克，含DHA38. 3% ；剩余藻渣加入0. 1%果膠酶，60°C水解5小時，再加入0. 1%蛋白酶，60°C水解5小時，噴霧干燥，進風溫度190°C，出風溫度90°C，得干粉約354克，蛋白質含量約56. 9%，DHA含量0. 05%，可以作為蛋白質飼料添加劑。實施例3
對發酵液進行離心分離，并洗滌不溶物2次，收集不溶物藻體，加入適量水調節粘度，進行酶法破壁，再進行高壓均質破壁，壓力40Mpa，循環I次；離心分離游離油及乳化層，凍融破乳后得毛油，經堿煉、脫色和脫臭后得到多不飽和脂肪酸精煉油502克，含DHA40.1% ；剩余藻渣加入1.5%果膠酶，40°C水解2小時，再加入1.5%蛋白酶，40°C水解2小時，噴霧干燥，進風溫度140°C，出風溫度60°C，得干粉約392克，蛋白質含量約52.6%，DHA含量2%，可以作為蛋白質飼料添加劑。表I為制得的蛋白質飼料氨基酸和總蛋白分析數據，其中，1-16采用GB/T5009.124-2003 測數據，17 采用 GB/T6432-1994 測數據。表1蛋白生物飼料氨基酸和總蛋白組成分析
權利要求
1.一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟:向裂壺藻藻洛中加入0.1 1.5%的果膠酶,溫度40 60°C,水解2 5h ;然后加入0.1 1.5%的蛋白酶，溫度40 60°C，水解2 5h ;噴霧干燥，進風溫度140 190°C，出風溫度60 90°C，制得含有生物蛋白質的干粉。
2.根據權利要求1所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法，其特征在于:所述裂壺藻藻渣是按照下述方法制備得到的:1)對裂壺藻菌株進行發酵培養的步驟；2)對得到的發酵液進行分離，收集藻體，將收集的藻體進行洗滌、油脂提取后得毛油；3)將步驟2)制得的毛油經 堿煉、脫色和脫臭后得到裂壺藻油脂，剩余的即為裂壺藻藻渣。
3.根據權利要求2所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法，其特征在于:所述裂壺藻菌株發酵培養是按照下述方法制備得到的:1)將保存在甘油管的菌株接入裝有50ml種子培養基的250ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，以150 200rpm的轉速，培養24 48h，獲得一級種子液；2)將上述一級種子液接入裝有IOOml種子培養基的500ml搖瓶中，在20 30°C的搖床中，轉速150 200rpm，培養24 48h，獲得二級種子液；3)將二級種子液接入裝有發酵培養基的發酵罐中，接種量2 10%v/v，通氣量0.2 2vvm,轉速200 800rpm，罐溫20 30°C，pH6 7，得到裂壺藻油脂。
4.根據權利要求3所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法，其特征在于:所述種子培養基中碳源含量為30 60g/L，氮源含量為10 20g/L，溶劑為海水和蒸餾水的混合物，所述海水和蒸餾水按照質量比為1:1進行混合；所述碳源為葡萄糖、甘油、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉糖化液或木質纖維素糖化液；所述氮源為有機氮源或無機氮源，所述有機氮源為酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米漿、牛肉浸膏、大豆蛋白、谷氨酸鈉或尿素，所述無機氮源為氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、氨水或硝酸鉀。
5.根據權利要求3所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法，其特征在于:所述步驟3)的發酵培養基中包括如下組分:葡萄糖20 60g/L，酵母提取物5 30g/L，蛋白胨5 20g/L，磷酸二氫鉀0.5 8g/L，硫酸鎂0.5 5g/L，檸檬酸鈉0.5 5g/L，海水晶5 3(^/1，維生素則10 100mg/L，維生素B610 100mg/L，維生素B123 50mg/L，生物素2 50mg/L。
6.根據權利要求3所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法，其特征在于:所述步驟3)中的發酵方式為分批發酵、補料-分批發酵、連續發酵或半連續發酵。
7.根據權利要求2所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法，其特征在于:所述步驟2)中的分離為離心分離、板框過濾或膜過濾；所述油脂提取為機溶劑萃取、高壓均質破壁或蛋白酶水解破壁。
8.根據權利要求7所述的一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法，其特征在于:所述有機溶劑為環己烷、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、石油醚、乙醚、甲苯、氯仿、或幾種的混合物。
9.根據權利要求1 8中任一項所述的生物蛋白質，其特征在于:所述生物蛋白質可.作為魚粉蛋白質飼料添加劑。
全文摘要
本發明提出了一種從裂壺藻藻渣中提取生物蛋白質的方法，所述方法將裂壺藻菌株進行發酵培養，對得到的發酵液進行分離處理，收集藻體，將收集的藻體進行洗滌、油脂提取后得毛油；將制得的毛油經堿煉、脫色和脫臭后得到裂壺藻油脂和裂壺藻藻渣，該裂壺藻藻渣經過二次酶解，蛋白質含量達50%以上，大部分蛋白質均以非常容易消化的小肽形式存在，多不飽和脂肪酸DHA含量為0.02%~2%，是一種很好的魚粉蛋白質飼料添加劑；本發明充分利用提取裂壺藻油脂后廢棄的藻渣，變廢為寶增加了經濟效益，而且實現了微藻細胞的綜合利用，實現多不飽和脂肪酸的清潔生產。
文檔編號A23K1/16GK103070293SQ20131002171
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月22日 優先權日2013年1月22日
發明者李悅明, 崔球, 張希銘, 宋曉金, 徐建春, 高莽, 夏修巒 申請人:青島瑯琊臺集團股份有限公司