專利名稱：一株防治香蕉枯萎病的細菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一株防治香蕉枯萎病的細菌及其應用。
背景技術：
粉蕉是香蕉的雜交栽培種，因其果型小、外型美、果皮金黃、皮薄肉白、口感嫩滑甜蜜、清香、營養豐富等特點，深受廣大消費者喜愛。近十年來，粉蕉種植得到快速發展。目前，廣西、廣東和海南的粉蕉種植面積分別在5000、500和200公頃左右。由于枯萎病危害，粉蕉的規模化種植不僅受到嚴重制約，而且需要輪作。由古巴尖鐮孢菌[Fusarium oxysporumf.sp.cubense (E.F.Simth) Snyder et Hansen]引起的香蕉枯萎病(也稱巴拿馬病)是一種毀滅性的土傳真菌病害，自1910年巴拿馬香蕉枯萎病大爆發至今，已給南美、非洲和亞洲的各主要香蕉種植國造成慘重損失。古巴尖鐮孢菌有4個生理小種，其中，對香蕉危害性最大的是1號和4號小種，均危害粉蕉。國內外對香蕉枯萎病的防治技術作了大量研究，涉及化學防治、間作/輪作、抗病品種培育和生物防治等多個方面。由于香蕉枯萎病是土傳維管束病害，病原菌從根、莖基部侵入后在維管束中侵染蔓延，所以化學防治技術幾乎是無效的(NelB,ViljoenA, Steinberg C，et al.Evaluation of chem ical substances for themamagement and control ofFusarium wilt of banana[A].1n Claudine Picq, AnneVezina Eds20d Intern ationalsymposium on Fusarium wilt on banana Brazil[C].Salvador de Bahia, 2003.)。韭菜與巴西香蕉輪作可顯著降低枯萎病發生率(黃永紅，李春雨，左存武，等.韭菜對巴西香蕉枯萎病發生的抑制作用.中國生物防治學報，2011，27 (3):344-348).室內試驗表明，韭菜葉片提取液對巴西香蕉和廣粉1號粉蕉的枯萎病防控效果在75%左右(黃永紅，李春雨，魏岳榮，等.韭菜對香蕉枯萎病菌的拮抗及其對盆栽香蕉枯萎病發生的抑制作用.浙江農業學報，2011，23 ￠):1162-1166)。香蕉抗枯萎病品種培育主要采用組培苗變異選擇和毒素篩選兩種方式。但是，選育出的抗性品種往往在產量和品質等方面都不理想(黃秉智，唐小浪，許林兵，等.香蕉抗枯萎病品種抗枯5號引種試驗.中國果樹，2009，6:17-19)。至今，香蕉抗枯萎病轉基因育種尚未開始。因此，用綠色環保的生物防治方法來控制香蕉枯萎病越來越受到人們的重視(鐘群有，鄭卓輝，彭增明，等.香蕉枯萎病生物防治研究概述.廣東農業科學，2007，7:64-65)。目前，國內外對香蕉枯萎病生物防治的研究剛剛起步，主要集中在對香蕉枯萎病4號小種拮抗菌的篩選、室內防治或短期田間試驗方面。這些拮抗菌涉及木霉菌(ThandaveluR, Palaniswami A, Doraiswamy S，et al.The effect of Pseudomonasfluorescens andFusarium oxysporumf.sp.cubense oninduction of defenceenzymesandphenolics inbanana.Biol PI ant arum, 2003, 46 (1): 107-110)、青霉菌(王宇光,盧娟，孫建波，等.一株拮抗香蕉枯萎病的青霉菌的分離及鑒定.中國農學通報，2011，27 (04):178-182)、放線菌(茹祥，曾濤，莫坤聯，等.海南吊羅山原始林區抗香蕉枯萎病土壤放線菌的分離及田間防治效果試驗.中國農學通報，2012,28(13):97-102)、芽孢桿菌(付業勤，張科立，潘羨心，等.內生拮抗細菌BEB2的分子鑒定及其對香蕉枯萎病菌的抑制作用.熱帶作物學報，2009，30
(I):80-85)、鏈霉菌(林梅，張紹升.鏈霉菌F-1013蝦殼粉發酵液對3種植物病原真菌的抑制作用.福建農林大學學報(自然科學版)，2010，39 (6):584-589)和假單孢桿菌(鐘小燕，梁妙芬，甄錫壯，等.假單胞菌對香蕉枯萎病菌的抑制作用.植物保護，2009，35 (I)86-89)。
發明內容
本發明的目的是提供一株防治香蕉枯萎病的細菌及其應用。本發明所提供的細菌具體為芽孢桿菌(Bacillus sp.)Bsp.6。該菌株已于2012年8月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCC N0.6459。本發明的另一個目的是提供一種菌劑。本發明所提供的菌劑的活性成分為所述芽孢桿菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCCN0.6459。具體的，所述菌劑為將所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)Bsp.6CGMCC N0.6459接種到培養基中培養，得到菌體濃度為3X 104-4.5X 105cfu/mL的菌液；所述菌液的使用過程中，可根據實際需要進行稀釋，調整使用濃度。在本發明的一個實施例中，所述菌劑具體為含有
3.8X 105cfu/mL 所述芽抱桿菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459 的菌液。所述培養基可由如下配比的原料制成:黃豆粉(黃豆籽粒粉末)、距離地面0.5-1.5米(如1.0米)的香蕉假莖、蔗糖和水的配比為5g:10g:20g:1L。進一步，所述培養基可由黃豆粉濾液、香蕉組織液、所述蔗糖和所述水按照IOOmL:IOOmL:20g:800mL 的配比混合而成，pH 為 7.0-7.2 (如 pH7.0)。所述黃豆粉濾液的制備方法具體可包括如下步驟:將所述黃豆粉與所述水按照Ig:30mL至Ig:400mL的比例混合，煮沸后過濾，獲得所述黃豆粉濾液；所述煮沸的持續時間為 20-60min。在本發明的一個實施例中，所述黃豆粉與所述水的比例具體為Ig =IOOmL ;所述煮沸的持續時間具體為20min。所述香蕉組織液的制備方法具體可包括如下步驟:將所述香蕉假莖與所述水按照Ig =IOOmL至Ig:25mL的比例混合，煮沸后過濾，獲得所述香蕉組織液；所述煮沸的持續時間為 20-40min。在本發明的一個實施例中，所述香蕉假莖與所述水的比例具體為Ig:50mL ;所述煮沸的持續時間具體為20min。在本發明的一個實施例中，所述培養基的制備方法具體包括如下步驟:A)所述黃豆粉濾液的制備:稱所述黃豆粉5g，加入到500mL所述水(蒸餾水)中，煮沸20分鐘后過濾，獲得所述黃豆粉濾液(約IOOmL)；B)所述香蕉組織液的制備:取距離地面I米左右的所述香蕉假莖20g，加所述水IOOOmL,煮沸20分鐘后過濾，獲得濾液即為所述香蕉組織液(約200mL)。C)將IOOmL步驟A)獲得的所述黃豆粉濾液、IOOmL步驟B)獲得的所述香蕉組織液和20g蔗糖混合后，調整pH至7，加蒸餾水800mL，即獲得所述培養基。
所述芽孢桿菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459，或所述的菌劑在下述a)或
b)中應用也屬于本發明的保護范圍:a)抑制枯萎病菌；b)防治植物枯萎病。在上述應用中，所述枯萎病菌具體可為古巴尖鐮孢菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense);所述枯萎病具體可為由古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense)所引起的枯萎病； 所述古巴尖鐮孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)具體可為古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) I號小種和/或古巴尖鍵抱菌(Fusantanoxysporum f.sp.cubense)4號小種；所述植物可為香蕉,具體如粉蕉,更加具體如粉蕉品種廣粉I號。本發明的又一個目的是提供一種利用所述菌劑防治香蕉枯萎病的方法。本發明所提供的利用所述菌劑防治香蕉枯萎病的方法具體可包括如下(I)和(2)的步驟:(I)在香蕉組培苗定植后抽出第I片新葉、第2-3片新葉、第4-5片新葉和第6_7片新葉這四個時期各施用I次所述菌劑；所述施用的濃度如下:四次所述施用的濃度均為所述菌劑濃度的1/5-1/10，如1/10 (即將所述菌劑進行10倍稀釋)；所述施用的劑量如下:前三次所述施用的劑量為60_80g/株，如60g，第四次所述施用的劑量為100g-200g/株(如150g/株)；所述施用的方式如下:四次所述施用的方式均為根部灌施；(2)在香蕉苗定植大田后，待80%_90%所述香蕉苗抽出新葉后I周內，開始施用所述菌劑，直至80%-90%所述香蕉苗抽蕾后I周為止；所述施用的頻率為如下(a)和(b):(a)自80%_90%所述香蕉苗抽出新葉時起，至所述香蕉苗定植大田滿3個月時止，平均每月施用I次所述菌劑；(b)自所述香蕉苗定植大田第4個月時起，至80%_90%所述香蕉苗抽蕾后I周時止，平均每兩個月施用I次所述菌劑；所述施用的濃度如下:所述(a)和(b)中的每次所述施用的濃度均為所述菌劑濃度的1/5-1/10，如1/10 (即將所述菌劑進行10倍稀釋)；所述施用的劑量如下:所述(a)中的每次所述施用的劑量均為400g_600g/株(如500g/株)；所述(13)中的每次所述施用的劑量均為800g-1200g/株(如IOOOg/株)。所述施用的方式如下:所述(a)中的第一次所述施用的方式為根部灌施；所述(a)中的第二次及以后所述施用，和所述(b)中的每次施用的方式均為環狀布施；所述環狀布施為在所述香蕉中部葉片外緣垂 直對應的土壤部分施用所述菌劑。在上述方法中，步驟(I)中在香蕉組培苗定植后抽出第4-5片新葉時施用所述菌齊IJ(即第三次施用)前在距離膠杯外緣Icm處傷根I圈。在上述方法中，所述枯萎病可為由古巴尖鐮孢菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense)所引起的枯萎病；所述古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)具體可為古巴尖鐮孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) I號小種和/或古巴尖鐮孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) 4號小種；所述香蕉具體可為粉蕉，更加具體的可為粉蕉品種廣粉I號。在上述方法中，所述菌劑濃度的1/5-1/10為將所述菌劑原液進行5-10倍稀釋。本發明所提供的芽孢桿菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459能夠同時抑制古巴尖鐮孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) I號和4號小種。以所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)Bsp.6CGMCC N0.6459為活性成分的菌劑能夠防控粉蕉枯萎病，其大田防控效果達95%左右。本發明所提供的芽孢桿菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459及其菌劑對于粉蕉枯萎病具有顯著的防控效果，這將很大程度上促進香蕉種植業的快速發展。保藏說明菌種名稱:芽孢桿菌
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拉丁名:(Bacillussp.)菌株編號:Bsp.6保藏機構:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱:CGMCC地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏日期:2012年8月17日保藏中心登記入冊編號:CGMCC N0.6459
圖1為菌株Bsp.6的對峙試驗結果。其中，A為古巴尖鐮孢菌(Fusantanoxysporumf.sp.cubense)l 號小種；B為菌株Bsp.6 與古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense)l 號小種的對峙；C 為古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)4號小種；D為菌株Bsp.6與古巴尖鐮孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) I號小種的對峙。圖2為芽孢桿菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459抑菌活性的檢測結果。其中，1-6分別表示組1-組6。圖3為芽孢桿菌(Bacillus sp.) Bsp.6CGMCC N0.6459對香蕉枯萎病防治效果盆栽試驗結果(植株存活率統計)。其中，1-6分別表示組1-組6。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。菌株:芽孢桿菌(Bacillus sp.) BEB2，即內生細菌BEB2或內生拮抗細菌BEB2:記載于“付業勤.香蕉內生細菌BEB2菌株對香蕉枯萎病的防治作用研究.海南大學碩士學位論文，2008” 一文，以及“付業勤，張科立，潘羨心等.內生拮抗細菌BEB2的分子鑒定及其對香蕉枯萎病的抑制作用.熱帶作物學報，2009年01期”一文中，公眾可從中國熱帶農業科學院
海口實驗站獲得。古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) I號小種和古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) 4號小種，即香蕉枯萎病菌I號和4號生理小種:記載在“曹永軍，程萍，喻國輝等.香蕉枯萎病菌I號和4號生理小種在幾種培養基上的生長特性.熱帶作物學報，2010年第08期” 一文中，公眾可從中國熱帶農業科學院海口實驗
站獲得。培養基:NA培養基:牛肉 浸膏3g,酵母浸膏Ig,蛋白胨5g,葡萄糖IOg,瓊脂15g,蒸懼水IOOOmL, pH7.0。PDA培養基:馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，水1000mL，pH自然(約6.0)。NB液體培養基:牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水lOOOmL，pH7.2。菌株母液培養基:牛肉浸膏3g,香蕉組織液100-200mL,蛋白胨5g,蒸懼水定容至IOOOmL, pH7.0。擴大培養菌液培養基:黃豆粉2-10g，加200_400mL水，煮沸20_60分鐘后過濾，取其濾液IOOmL,香蕉組織液100-200mL，蔗糖20g_40，pH值7，加蒸餾水至1000mL。其中，所述香蕉組織液的制備方法如下:取距離地面0.5-1.5米左右的香蕉假莖10-40g，加水IOOOmL,煮沸20-40分鐘，過濾，保存濾液，即為香蕉組織液。實施例1、芽孢桿菌(Bacillus sp.) Bsp.6的分離與鑒定一、芽抱桿菌(Bacillus sp.) Bsp.6 的分離1、采用組織分離法，獲取植物組織中的菌株從中國海南健康的大田粉蕉植株體上采集距地表10-15cm的根(直徑0.2-0.5cm)l-2g，用自來水沖洗10-30min，再依次用體積百分比為70%的乙醇和質量百分比為3.25%的次氯酸鈉消毒Imin和3min,然后用無菌水漂洗3次。將根置于研缽中,加無菌水充分研磨。靜置15min后，吸上清液，進行ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—3梯度稀釋。各取100 μ L稀釋液，涂布于NA培養基平板，對照涂布100 μ L的第3次無菌水漂洗液。28°C培養3_5天后，挑取形態完整、差異明顯的單菌落，在NA培養基平板上劃線培養，獲得不同類型菌株。2、抗性菌株分離( I)香蕉枯萎病病原菌劃線培養取2個PDA培養基平板,分別劃線接種古巴尖鐮孢菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense) I 號小種和古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) 4 號小種，28°C，培養3-5天。(2)不同類型菌株劃線培養將步驟I得到的不同類型菌株分別劃線接種于PDA培養基平板，28°C，培養1_2天。( 3)對崎頭驗檢測抑囷效果從步驟(2)中培養分離得到的每個菌株的平板中挑取單菌落，分別劃線接種在兩個新的PDA培養基平板的一側邊緣，在相對應的另一側放置邊長3_含有病原菌菌絲的膠塊(即兩平板之一放置來自于步驟(I)中接種了古巴尖鐮孢菌(Fusantanoxysporum f.sp.CUbenSe)l號小種培養后的PDA培養基膠塊，兩平板中的另一放置來自于步驟(I)中接種了古巴尖鐮孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)4號小種培養后的PDA培養基膠塊)，蓋上蓋子，用保鮮膜封口，放入28°C條件下培養5至7天，得到對枯萎病菌-古巴尖鐮孢菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)l 號小種和古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)4號小種均有較強抑制作用的菌株,將其中一個菌株記作Bsp6。菌株Bsp6的對峙試驗結果如圖1所示。二、芽孢桿菌(Bacillus sp.) Bsp.6 的鑒定從以下幾個方面鑒定步驟一分離得到的菌株Bsp.6:1、形態學鑒定對于處于對數生長期的菌株Bsp.6，經涂片染色后采用光學顯微鏡觀察，其主要形態特征為:大小為(0.5 Ι.Ομπι) X (1.5 2.3μπι)，淺黃白色，不透明，濕潤、菌體表面有褶皺，邊緣不規則。2、生理生化特征分析采用常規生理生化鑒定方法對菌株Bsp.6進行鑒定，結果如表I。表1菌株Bsp.6的生理生化特征
權利要求
1.孢桿菌(Bacillussp.) Bsp.6,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.6459。
2.劑，它的活性成分為權利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillussp.)Bsp.6CGMCCN0.6459。
3.據權利要求2所述的菌劑，其特征在于:所述菌劑為將所述芽孢桿菌(Bacillussp.) Bsp.6CGMCC N0.6459接種到培養基中培養，得到菌體濃度為3X 104-4.5X 105cfu/mL 的菌液； 所述培養基由如下原料制成:黃豆粉、距離地面0.5-1.5米的香蕉假莖、蔗糖和水的配比為 5g:10g:20g:1L。
4.據權利要求3所述的菌劑，其特征在于:所述培養基由黃豆粉濾液、香蕉組織液、所述蔗糖和所述水按照IOOmL:100mL:20g:800mL的配比混合，pH為7.(Γ7.2。
5.據權利要求4所述的菌劑，其特征在于:所述黃豆粉濾液的制備方法包括如下步驟:將所述黃豆粉與所述水按照Ig:30mL至Ig:400mL的比例混合而成，煮沸后過濾，獲得所述黃豆粉濾液； 所述香蕉組織液的制備方法包括如下步驟:將所述香蕉假莖與所述水按照Ig =IOOmL至Ig:25mL的比例混合，煮沸后過濾，獲得所述香蕉組織液。
6.利要求1所述的芽孢桿菌(Bacillussp.)Bsp.6CGMCC N0.6459，或權利要求2-5中任一所述的菌劑在下述a)或b)中應用: a)抑制枯萎病菌； b)防治植物枯萎病。
7.據權利要求6所述應用，其特征在于:所述枯萎病菌為古巴尖鐮孢菌(Fusantanoxysporum f.sp.cubense);所述枯萎病為由古巴尖鍵抱菌(Fusantanoxysporum f.sp.cubense)所引起的枯萎病；所述植物為香蕉。
8.用權利要求2-5中任一所述的菌劑防治香蕉枯萎病的方法，包括如下步驟: (1)在香蕉組培苗定植后抽出第I片新葉、第2-3片新葉、第4-5片新葉和第6-7片新葉這四個時期各施用I次所述菌劑； 所述施用的濃度如下:四次所述施用的濃度均為所述菌劑濃度的1/5-1/10 ； 所述施用的劑量如下:前三次所述施用的劑量為60-80g/株，第四次所述施用的劑量為 IOOg 200g/ 株； 所述施用的方式如下:四次所述施用的方式均為根部灌施； (2)在香蕉苗定植大田后，待80%-90%所述香蕉苗抽出新葉后I周內，開始施用所述菌齊U，直至80%-90%所述香蕉苗抽蕾后I周為止； 所述施用的頻率為如下(a)和(b): Ca)自80%-90%所述香蕉苗抽出新葉時起，至所述香蕉苗定植大田3個月時止，平均每月施用I次所述菌劑； (b)自所述香蕉苗定植大田4個月時起，至80%-90%所述香蕉苗抽蕾后I周時止，平均每兩個月施用I次所述菌劑； 所述施用的濃度如下 :所述(a)和(b)中的每次所述施用的濃度均為所述菌劑濃度的1/5-1/10 ；所述施用的劑量如下:所述(a)中的每次所述施用的劑量均為400g飛OOg/株；所述(b)中的每次所述施用的劑量均為IOOOg/株； 所述施用的方式如下:所述(a)中的第一次所述施用的方式為根部灌施；所述(a)中的第二次及以后所述施用，和所述(b)中的每次所述施用的方式均為環狀布施；所述環狀布施為在所述香蕉中部葉片外緣垂直對應的土壤部分施用所述菌劑。
9.據權利要求8所述的方法,其特征在于:所述枯萎病為由古巴尖鐮孢菌(Fusantanoxysporum f.sp.cubense)所引起的枯萎病；所述植物為香蕉。
10.據權利要求7所述 的應用，或權利要求9所述的方法，其特征在于:所述古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense)為古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporumf.sp.cubense) I 號小種和 / 或古巴尖鍵抱菌(Fusantan oxysporum f.sp.cubense) 4 號小種。
全文摘要
本發明公開了一株防治香蕉枯萎病的細菌及其應用。本發明所提供的細菌具體為芽孢桿菌(Bacillus sp.)Bsp.6，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.6459。實驗證明，本發明所提供的芽孢桿菌(Bacillus sp.)Bsp.6CGMCC No.6459能夠同時抑制古巴尖鐮孢菌(Fusantan oxysporumf．sp．cubense)1號和4號小種。以所述芽孢桿菌(Bacillus sp.)Bsp.6CGMCC No.6459為活性成分的菌劑能夠防控粉蕉枯萎病，其大田防控效果達95%左右；本發明所提供的芽孢桿菌(Bacillus sp.)Bsp.6CGMCC No.6459及其菌劑對于粉蕉枯萎病具有顯著的防控效果，這將很大程度上促進香蕉種植業的快速發展。
文檔編號A01P3/00GK103087956SQ20131002304
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月22日 優先權日2013年1月22日
發明者付業勤, 王必尊, 龍自梅, 金志強 申請人:海南業勤香蕉產業技術開發有限公司, 中國熱帶農業科學院海口實驗站