D-氨基酸抑制香蕉細菌性軟腐病菌生物膜及其培養基的制作方法
【專利摘要】本發明屬于農作物病害防治領域，公開了一種D-氨基酸在抑制香蕉細菌性軟腐病菌細菌生物膜中的應用及其培養基。本發明篩選的D-氨基酸可顯著有效抑制香蕉細菌性軟腐病菌的細菌生物膜的生長。本發明篩選獲得4種可顯著抑制細菌性軟腐病菌的細菌生物膜生長的D-氨基酸，D-酪氨酸、D-纈氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸；并獲得其最低抑制濃度。本發明還提供了上述4種D-氨基酸的混配配方，大大降低了各種D-氨基酸的使用濃度。本發明還提供了一種用于上述應用的D-氨基酸培養基。基于本發明的內容可為開發細菌性軟腐病菌的防治新技術提供新的方法及思路；結合D-氨基酸使用，提高化學農藥、生物農藥等防治方法的使用效果。
【專利說明】D-氨基酸抑制香蕉細菌性軟腐病菌生物膜及其培養基
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農作物病害防治領域，特別涉及一種D-氨基酸在抑制香蕉細菌性軟 腐病菌細菌生物膜中的應用及其培養基。
【背景技術】
[0002] 香蕉主要生長在熱帶、亞熱帶地區，已至少有107個國家生產香蕉；2013年，香 蕉是產值全球第四大的食用植物，僅次于米、麥及玉米，近10年全世界香蕉種植面積呈增 長的趨勢。然而，該作物現已受到香蕉細菌性軟腐病的嚴重危害；從本研宄組首次報道的 Dickeya sp.引起的香蕉細菌性軟腐病在中國大陸的發生（Lin et al，2010)起，細菌性軟 腐病的擴展蔓延速度迅速，在廣東香蕉主要產區及海南、廣西、福建等香蕉產區均發現該病 害的發生。該病害田間發病率20%?30%，嚴重可達100%以上，并造成整株死亡，已嚴重 危害香蕉產業。綜合生化特征、保守基因序列等，該病原菌被鑒定為Dickeya zeae (Zhang et al，2010)〇
[0003] 細菌為適應生存環境而吸附著于生物或非生物材料表面會形成膜樣多細菌復合 體，即細菌生物膜（Bacterial biofilm，BBF) (Stoodley et al，2002)。生物膜狀態的細 菌比浮游狀態下的細菌具有更強的耐藥性、毒力和對抗宿主免疫防御的能力，能在宿主抑 菌成分中生存，細菌生物膜已成為病原細菌的重要致病因子（Morris and Monier，2003)， 并在植物與病原物互作的動態過程中發揮作用（Danhom and Fuqua, 2007)。細菌生物 膜是銅綠假單胞菌侵染多種寄主的關鍵因子，掃描電鏡觀察發現它在寄主植物組織中 形成了細菌生物膜（Tan et al, 1999);引起葡萄皮爾氏病的苛養木桿菌在木質部可形 成細菌生物膜并阻塞導管，使植物失水和養分運輸受阻而表現出癥狀（Guilhabert and Kirkpatrick，2005);同時，植物保護同樣面臨細菌生物膜的抗藥性增加的難題。由于細菌 生物膜胞外物質的屏障作用、細菌密度以及通過降低細胞膜的通透性等，減少抑菌藥物進 入細胞內及增強細胞內的藥物外排，使得細菌在生物膜狀態有著比浮游態高出千百倍的抗 藥性。因此，針對植物病原細菌，與細菌生物膜的抑制因子篩選相關的研宄可為植物保護技 術的開發提供新思路，對于防控細菌性植物病害也具有重要意義。
【發明內容】
[0004] 為了克服上述現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供D-氨基酸在 抑制香蕉細菌性軟腐病菌細菌生物膜中的應用。本發明提供的D-氨基酸對香蕉細菌性軟 腐病菌的細菌生物膜具有顯著的抑制作用。
[0005] 本發明另一目的在于提供一種用于上述應用的D-氨基酸培養基。
[0006] 本發明的目的通過下述方案實現：
[0007] D-氨基酸在抑制香蕉細菌性軟腐病菌（Dickeya zeae)細菌生物膜中的應用，所 述的D-氨基酸為D-酪氨酸、D-色氨酸、D-纈氨酸和D-蛋氨酸中的至少一種。
[0008] 為了進一步更好地實現本發明，單獨使用所述D-酪氨酸時，其有效抑制濃度為 420 μΜοΙ/L ；
[0009] 為了進一步更好地實現本發明，單獨使用所述D-色氨酸時，其有效抑制濃度為 5mMol/L ；
[0010] 為了進一步更好地實現本發明，單獨使用所述D-纈氨酸時，其有效抑制濃度為 llmMol/L ；
[0011] 為了進一步更好地實現本發明，單獨使用所述D-蛋氨酸時，其有效抑制濃度為 15mMol/L〇
[0012] 本發明優選混合使用兩種、三種或四種上述D-氨基酸，混合搭配使用上述D-氨基 酸，相互間具有協效作用，可有效減少各種D-氨基酸的用量。
[0013] 更優選地，所述應用中四種D-氨基酸搭配使用時的用量可為120 μ Mol/L的D-酪 氨酸、5mMol/L的D-纈氨酸、7mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0014] 或所述應用中四種D-氨基酸搭配使用時的用量可為160 μΜοΙ/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-繳氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0015] 或所述應用中四種D-氨基酸搭配使用時的用量可為120 μΜοΙ/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸；
[0016] 或所述應用中四種D-氨基酸搭配使用時的用量可為320 μΜοΙ/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-纈氨酸、3mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸。
[0017] 上述將D-氨基酸應用于抑制香蕉細菌性軟腐病菌細菌生物膜中，可顯著抑制細 菌生物膜生長，為開發細菌性軟腐病菌的防治新技術提供新的方法及思路
[0018] 本發明還提供了一種用于上述D-氨基酸培養基在抑制香蕉細菌性軟腐病菌細菌 生物膜中是應用的D-氨基酸培養基，為在本領域常用的液體培養基中添加有D-氨基酸得 到的培養基，如NA液體培養基等。所述的D-氨基酸為D-酪氨酸、D-色氨酸、D-纈氨酸和 D-蛋氨酸中的至少一種。
[0019] 為了進一步更好地實現本發明，所述的D-氨基酸培養基中優選添加上述四種 D-氨基酸。
[0020] 更優選地，所述的D-氨基酸培養基中四種D-氨基酸的含量為120 μ Mol/L的D-酪 氨酸、5mMol/L的D-纈氨酸、7mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0021] 或所述的D-氨基酸培養基中四種D-氨基酸的含量為160 μ Mol/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-繳氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0022] 或所述的D-氨基酸培養基中四種D-氨基酸的含量為120 μ Mol/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸；
[0023] 或所述的D-氨基酸培養基中四種D-氨基酸的含量為320 μ Mol/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-纈氨酸、3mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸。
[0024] 本發明提供的D-氨基酸培養基可顯著抑制香蕉細菌性軟腐病菌細菌生物膜的生 長，為開發香蕉細菌性軟腐病菌的防治新技術提供新的方法及思路；結合D-氨基酸使用， 提高化學農藥、生物農藥等防治方法的使用效果，開發新型的高效、低毒、環保農藥。
[0025] 本發明相對于現有技術，具有如下的優點及有益效果：
[0026] 本發明篩選的D-氨基酸可顯著有效抑制香蕉細菌性軟腐病菌的細菌生物膜的生 長。本發明通過篩選獲得4種可顯著抑制細菌性軟腐病菌的細菌生物膜生長的D-氨基酸， D-酪氨酸、D-纈氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸；并篩選獲得它們各自的最低抑制濃度。同時， 本發明也通過結晶紫染色及激光共聚焦顯微鏡明確D-氨基酸抑制香蕉細菌性軟腐病菌的 顯著效果及細胞學特征。本發明還提供了上述4種D-氨基酸的混配配方，大大降低了各種 D-氨基酸的使用濃度，并可同樣顯著抑制細菌生物膜的生長。本發明還提供了一種用于上 述應用的D-氨基酸培養基。基于本發明的內容可為開發細菌性軟腐病菌的防治新技術提 供新的方法及思路；結合D-氨基酸使用，提高化學農藥、生物農藥等防治方法的使用效果。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 圖1為Dickeya zeae MSl的細菌生物膜生物量相對定量，其中，D. zeae biofilms、 D. zeae planktonic分別表示細菌生物膜及浮游細菌的相對定量。
[0028] 圖2為Dickeya zeae MSl細菌生物膜的形態特征激光共聚焦顯微圖。
[0029] 圖3為D-氨基酸處理后Dickeya zeae MSl細菌生物膜結晶紫染色分析圖。
[0030] 圖4為D-纈氨酸抑制Dickeya zeae MSl細菌生物膜生長的激光共聚焦分析圖。
[0031] 圖5為4種D-氨基酸混配配方抑制Dickeya zeae MSl的細菌生物膜形成的分析 圖。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0033] 香蕉細菌性軟腐病菌（Dickeya zeae MSI)在文獻"Identification of Dickeya zeae as a Causal Agent of Bacterial Soft Rot in Banana in China. Plant Disease, 2014, 98 (4) :436-442. "中公開，由廣東省農業科學院植物保護研宄所實驗室提 供；
[0034] D-氨基酸均在Sigma-Aldrich公司購買。
[0035] 實施例1 :細菌的培養及細菌生物膜的培養
[0036] 取甘油凍存（-80 °C )的細菌菌株 Dickeya zeae MSI (Identif ication of Dickeya zeae as a Causal Agent of Bacterial Soft Rot in Banana in China. Plant Disease, 2014, 98 (4) :436-442.)分別接種到NA固體培養基（牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白胨 5g、葡萄糖10g、瓊脂18g，水定容至lOOOmL，pH為7. 2?7. 4)平板上，劃線培養；挑取單菌 落于液體NA培養基（牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水定容至1000mL，pH為 7. 2 ?7. 4)中培養，180rpm，32°C培養。
[0037] 培養Dickeya zeae MSl至108CFU/mL ;NA液體培養基稀釋菌液至1:1000。取2mL 稀釋的菌液加入聚苯乙烯24微孔板中，每樣品3個重復，32°C靜置培養，培養不同時間后 作下一步檢測。培養6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、144h、216h后，先抽取浮游細菌 于96孔板中，在酶標儀測取600nm(0D 6QQ)的吸光度值（Multiskan Spectrum，Thermo Lab Systems);下一步將余下浮游細菌和細菌生物膜混勾，再次測取600nm(0D6CICI)的吸光度值。 計算混勻后的細菌OD值減去浮游細菌OD值，即為細菌生物膜生物量的相對定量。
[0038] 培養Dickeya zeae MSl至108CFU/mL ;NA培養基稀釋菌液至1:1000。加入5mL稀 釋的菌液于聚苯乙烯6孔板中，使用聚苯乙烯的光學玻片浸泡入細菌培養基中，與細菌共 同培養6h、24h。使用PBS緩沖液清洗去除浮游細菌，粘附基質玻片的細菌細胞使用5%的 戊二醛進行固定lh，再用PBS緩沖液清洗；PI用于DNA染色，Alexa-Fluor Concanavalin A(ConA)用于結合胞外多糖，染料的分別結合用于分析Dickeya zeae MSl細菌生物膜在 不同時間段形成的特征。使用以下的氬激光激發、接收波長參數：PI 630-633nm激發和 650-800nm接收，ConA 346nm激發和442nm接收，激光共聚焦顯微鏡觀察。
[0039] 結果見圖1及圖2。由圖可見，0?12h，浮游菌生長量大于細菌生物膜；至24h達到 動態平衡，生長速度一致；48h后，浮游菌衰亡而細菌生物膜不變；表明Dickeya zeae MSl 離體培養后24h即可形成穩定的細菌生物膜。激光共聚焦顯微鏡觀察結果類似，在6h時形 成的細菌生物膜較稀薄，到24h時，細菌已形成完整、密集的細菌生物膜。
[0040] 實施例2 :不同D-氨基酸抑制香蕉細菌性軟腐病菌的效果分析
[0041 ] 配制D-纈氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-蘇氨酸、D-精氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨 酸、D-絲氨酸、D-組氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-苯丙氨酸、D-丙氨酸 等的IOOmMoVL的儲存液；配制D-酪氨酸的IOmMoVL的儲存液，其中D-酪氨酸儲存液含 0. IMol/L的HCl。按照不同濃度配比，配制系列D-氨基酸濃度的NA液體培養基；分別配置 200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480 及 500 μΜοΙ/L(簡寫 μΜ)濃度的D-酪氨酸的NA液體培養基（牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水 定容至 lOOOmL，pH 為 7. 2 ?7. 4);分別配置 1、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17· 5 及 20mMol/L(簡寫mM)的其他D-氨基酸的NA培養基（牛肉膏3g、酵母膏lg、蛋白胨5g、葡萄 糖l〇g，水定容至lOOOmL，pH為7. 2?7. 4)。
[0042] 取甘油凍存（_80°C )的細菌菌株Dickeya zeae MSl接種到NA固體培養基（牛肉 膏3g、酵母膏lg、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂18g，水定容至lOOOmL，pH為7. 2?7. 4)平 板上，劃線培養；挑取單菌落于NA液體培養基中培養，180rpm，32°C培養。
[0043] 培養Dickeya zeae MSl至108CFU/mL ;利用不同濃度D-氨基酸的NA培養基稀釋 菌液至1:1000,設置無 D-氨基酸菌液對照（CK)，及無菌NA液體培養基對照（NA)。取2mL 稀釋的菌液加入聚苯乙烯24微孔板中，32°C靜置培養。培養24h后，先抽取浮游細菌于96 孔板中，每樣品3個重復，在酶標儀測取600nm(0D_)的吸光度值（Multiskan Spectrum， Thermo Lab Systems);下一步將余下浮游細菌和細菌生物膜混勾，再次測取600nm(0D_) 的吸光度值。計算混勻后的細菌OD值減去浮游細菌OD值，即為細菌生物膜生物量的相對 定量，結果見表1?2。
[0044]
【權利要求】
1. D-氨基酸在抑制香蕉細菌性軟腐病菌（Dickeya zeae)細菌生物膜中的應用。
2. 根據權利要求1所述的D-氨基酸在抑制香蕉細菌性軟腐病菌（Dickeya zeae)細菌 生物膜中的應用，其特征在于：所述的D-氨基酸為D-酪氨酸、D-色氨酸、D-纈氨酸和D-蛋 氨酸中的至少一種。
3. 根據權利要求2所述的D-氨基酸在抑制香蕉細菌性軟腐病菌（Dickeya zeae)細菌 生物膜中的應用，其特征在于：所述D-酪氨酸的有效抑制濃度為420 y Mol/L ;所述D-色氨 酸的有效抑制濃度為5mMol/L ;所述D-纈氨酸的有效抑制濃度為llmMol/L ;所述D-蛋氨酸 的有效抑制濃度為15mMol/L。
4. 根據權利要求2所述的D-氨基酸在抑制香蕉細菌性軟腐病菌（Dickeya zeae)細菌 生物膜中的應用，其特征在于：所述D-氨基酸搭配使用時的用量為120 y Mol/L的D-酪氨 酸、5mMol/L的D-纈氨酸、7mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸； 或為160 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/ L的色氨酸； 或為120 yMol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L 的色氨酸； 或為320 yMol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、3mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L 的色氨酸。
5. -種用于權利要求1?4任一項所述的D-氨基酸在抑制香蕉細菌性軟腐病菌 (Dickeya zeae)細菌生物膜中的應用中的D-氨基酸培養基，其特征在于：通過在液體培養 基中添加有D-氨基酸得到。
6. 根據權利要求5所述的D-氨基酸培養基，其特征在于：其中添加有D-酪氨酸、D-色 氨酸、D-纈氨酸和D-蛋氨酸中的至少一種。
7. 根據權利要求6所述的D-氨基酸培養基，其特征在于：所述的D-氨基酸培養基中 四種D-氨基酸的含量為120 y Mol/L的D-酪氨酸、5mMol/L的D-纈氨酸、7mMol/L的D-蛋 氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸。
8. 根據權利要求6所述的D-氨基酸培養基，其特征在于：所述的D-氨基酸培養基中 四種D-氨基酸的含量為160 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋 氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸。
9. 根據權利要求6所述的D-氨基酸培養基，其特征在于：所述的D-氨基酸培養基中 四種D-氨基酸的含量為120 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋 氨酸、3mMol/L的色氨酸。
10. 根據權利要求6所述的D-氨基酸培養基，其特征在于：所述的D-氨基酸培養基中 四種D-氨基酸的含量為320 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、3mMol/L的D-蛋 氨酸、3mMol/L的色氨酸。
【文檔編號】C12R1/01GK104498395SQ201410715110
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】張景欣, 林壁潤, 黃寧, 沈會芳, 蒲小明, 潘群英 申請人:廣東省農業科學院植物保護研究所