專利名稱：香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農作物病害防治及植物檢疫領域，具體涉及一種香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法與應用，即利用聚合酶鏈式反應(PCR)分子生物學技術對香蕉細菌性軟腐病害病原菌進行高靈敏度快速檢測，可用于香蕉種苗檢疫、田間香蕉軟腐病的早期診斷以及病菌的監測和鑒定。
背景技術：
香蕉細菌性軟腐病病原菌為菊基腐病菌(PectcAacterium chrysanthemi)，屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)歐文氏菌屬(Erwinia)。該病原菌的致病性很強，可能為強致病亞種。這是我國新入侵危險病害，于2009年9月在廣州番禺香蕉種植區首次發現，主要危害粉蕉、巴西蕉等。該病害為系統性維管束病害，首先內部葉片近葉柄處變臟黃色，葉柄崩潰，葉片萎蔫而死亡。感病假莖橫切面維管束變綠黃色至紅褐色，甚至黑色，尤其是里面葉鞘和果柄、假莖、根圍及單個香蕉上均有暗色膠狀物質及細菌菌溢。染病植株6 8天死亡，發病率達20 40%，嚴重地塊可達90%以上，發病植株死亡率100%，且以較快的速度擴大感染面積。該病具有傳播快，毀滅性強等特點，給香蕉生產造成巨大的經濟損失。香蕉細菌性軟腐病初期發病癥狀和香蕉枯萎病有些相似，故蕉農很難準確判斷病原，傳統的病原菌分離培養鑒定的方法又依賴于專業人員豐富的經驗和系統的病原菌分類的理論知識，這樣就會貽誤最佳的防治時機。目前，防治香蕉細菌性軟腐病還沒有行之有效的方法。主要是以并定期檢查蕉園，發現零星病株及時清除銷毀，并撒施生石灰處理病土區，種植抗病耐病香蕉品種等綜合防治措施。香蕉細菌性軟腐病在溫濕度適宜的條件下發病迅猛，健康植株一旦染病會很快死亡。因此，對香蕉細菌性軟腐病應以預防為主，著重加強對該病害的檢疫檢測。為防止香蕉細菌性軟腐病從疫區傳入非疫區，確保國內香蕉的安全生產，建立一套穩定、簡便、快速、靈敏的分子檢測方法對香蕉種苗及種植區的土壤進行檢疫檢測是非常必要的。PCR檢測方法具有靈敏度高、精度高、取樣量微小、檢測時間短等優點。通過該技術對香蕉種苗、種植區土壤浸提液、灌溉水等定性檢測，為確保我國香蕉無病種苗生產基地的建設、安全生產，同時堵截國外危險性帶病香蕉傳入我國具有重要意義。
發明內容
本發明的主要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法。該方法操作簡便易行，可以以試劑盒的形式直接應用于生產實踐，用于帶菌植物組織和土壤的高靈敏度快速檢測，確保為生產提供健康無菌種苗、對病原菌分子預警具有十分重要的意義。本發明的另一目的在于提供所述香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法的應用。本發明的目的通過下述技術方案實現一種香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法，包括以下步驟
(1)設計PCR引物，其中上游引物LF 5，-TTCGTCTAGAGGCCCAGGAC-3，下游引物LR 5，-TCAGCTTGTTCCGGATTGTT-3，(2)對樣本進行處理，得到樣本中的DNA ；然后以樣本的DNA為模板，進行PCR反應，電泳檢測PCR產物，當PCR產物呈現171bp條帶，即樣本中含有香蕉細菌性軟腐病害病原菌。步驟( 中所述的樣本為香蕉植株組織時，所述處理的方式優選為利用CTAB法抽提香蕉植株組織中的DNA;步驟O)中所述的樣本為土壤時，所述處理的方式優選為用無菌水浸泡土壤，得到的上清液為模板；更優選為每0. 5克土壤使用Iml無菌水浸泡半小時，得到的上清液為模板；步驟O)中所述的樣本為病水時，所述處理的方式優選為用0. 22μπι的濾膜對病水進行過濾富集，制備更高濃度的病水直接作為模板；步驟⑵中所述PCR反應中的反應條件優選為94°C預變性5min ；94°C變性20s， 53°C退火20s，72°C延伸30s，35個循環；72°C總延伸IOmin ；所述香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法應用于香蕉種苗檢疫、田間香蕉軟腐病的早期診斷以及病菌的監測和鑒定。本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果本發明根據香蕉細菌性軟腐病病原菌的基因組序列，設計特異性引物。通過該技術對香蕉種苗、種植區土壤浸提液、灌溉水等定性檢測，從而實現我國香蕉無病種苗生產基地的建設、安全生產，同時堵截國外危險性帶病香蕉傳入的目的。
圖1是本發明所述方法對不同參試菌株DNA擴增的結果示意圖，其中泳道M為DNA Marker 2000 ；泳道1為香蕉細菌性軟腐病菌；泳道2為梨火疫病病菌；泳道3為野油菜黃單胞病菌；泳道4為胡蘿卜歐文氏菌；泳道5為香蕉細菌性枯萎病病菌；泳道6為玉米細菌性枯萎病病菌；泳道7為白葉枯病菌；泳道8為菜豆枯萎病菌病菌； 泳道9為丁香假單胞病菌；泳道ck-為陰性對照水。圖2是本發明靈敏度的檢測結果圖，其中泳道M為DNA Marker 2000 ；泳道ck+為香蕉細菌性軟腐病菌DNA ；泳道1 9分別為 IO9, IO8, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2,10CFU/ml 的模板；泳道 ck-為陰性對照水。圖3是本發明所述方法對不同樣品的檢測結果圖，其中泳道M為DNA Marker 2000 ；泳道ck+為香蕉細菌性軟腐病菌DNA ；泳道ck-為陰性對照水；泳道1 4為(表1中樣品1、7、11、37)發病香蕉組織的DNA ；泳道5為人工接種病原菌的香蕉組織DNA;泳道6 8為(表1中樣品4、8、14)發病地塊病土樣品；泳道9為人工接種病原菌病土(取50g田土于160°C的烘箱內干燥滅菌12h，待冷卻后接種IO9CFU/ ml的香蕉細菌性軟腐病菌懸液5ml，制備病土樣品)樣品；泳道10(表1中樣品9)為病嚴重地塊的病水樣品；泳道11為健康香蕉組織的DNA。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1PCR技術檢測香蕉細菌性軟腐病的方法，其步驟是(1)細菌基因組DNA提取取凍存的香蕉細菌性軟腐病病原菌三株(Firsti^port of a sort of banana in Mainland China Caused by a Dickeya sp. (Pectobacterium chrysanthemi). Plant Dis. 2010,94(5) :640-640.)分別接種到 NA 斜面培養基(牛肉膏 3g，酵母浸膏lg，蛋白胨5g，葡萄糖10g，瓊脂20g，蒸餾水定容至1000ml)上在35°C環境中靜置培養48h，挑取單菌落接種于液體NA培養基中，27 35°C，ISOrpm搖床培養過夜，用細菌基因組DNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)分別提取香蕉細菌性軟腐病病原菌基因組DNA待用。(2)擴增香蕉細菌性軟腐病16S-23S rDNA ITS序列用已經報道的細菌通用 ITS 弓丨物(primer 1 :5，-GAAGTCGTAACAAGG-3，；primer2 :5，-CAAGGCATCCACCGT-3，) 分別對三株香蕉細菌性軟腐病病原菌基因組DNA進行擴增。反應體系為50μ1 :Taq MasterMix (Taq DNA polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTP 以及 PCR 穩定劑和增強劑組成的預混體系，濃度為2Χ)25μ 1，10μΜ的primerl和primer2各2μ 1，模板DNA 2μ 1， RNase-Free water 補足 50 μ 1。PCR 反應條件是94°C預變性 5min ；94°C變性 30s，50°C退火30s，72 °C延伸30s，35個循環；72 °C總延伸lOmin。PCR產物用(w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，檢測到大小約為440bp和600bp的兩條帶，將440bp的擴增產物割膠回收，回收片段與克隆載體PMD20-T Vector (TaKaRa寶生物工程有限公司)連接，然后轉化至大腸桿菌感受態細胞DH-5ci (TaKaRa寶生物工程有限公司)，進行藍白斑篩選，挑取陽性菌落擴大培養后，取 2μ 1 菌液用載體通用引物(M13F :5，-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3，；M13R 5 ’ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 ’)進行PCR擴增，凝膠電泳檢測，并將檢測后確認含有目的片段的陽性克隆送到上海英駿生物技術有限公司進行DNA序列測定，DNA序列測定表明分離得到的三株香蕉細菌性軟腐病病原菌的16S-23S rDNA ITS序列相同，如下所示，并保存陽性菌株。1GAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTACCGAGTAG
61AAGTGCCTGCGTGGTGTCCACACAGATTGTCTGATGATAAGAAAGAGTCAAAAGCGTCTT
121GCGAAGCTGACAAGTGATGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTTCACGGC
181GGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGCCAATGACTGACAGTGGGTGAAAGGCACG
241GTCAACGCTAACCTAAAACTGATTAGAAATAGTCAGGTTTATGTTATCTGCTCTTTAACA
301ATCCGGAACAAGCTGAATAATTTGAAACGACGGCATGTGAATGCGAATTCATGTGTTGTT
361GGAGTCTCTCAAAATACTCATATCCCGAGACACTTTCGGGTTGTGAGGTTAAGCGACTAA
421GCGTACACGGTGGATGCCTTG (3)PCR特異性引物的設計根據香蕉細菌性軟腐病病原菌ITS序列與NCBI上下載的其他種屬的細菌的ITS序列的差異，應用Premier5. 0 (加拿大I^remier公司) 設計PCR特異引物，上游引物為LF :5’ -TTCGTCTAGAGGCCCAGGAC-3’，下有引物為LR 5’ -TCAGCTTGTTCCGGATTGTT-3’，該引物擴增目的片段為171bp。引物合成由上海博尚生物技術有限公司合成。(4)引物特異性檢測將步驟(2)提取的香蕉細菌性軟腐病病原菌基因組 DNA和參試致病菌的基因組DNA進行引物特異性檢測。參試致病菌有胡蘿卜歐文氏 ^ MY21 (Erwinia carotovora subsp. carotovora Ecc，古月胃卜 @冑 1^ ft 〒@iJ J 技術的研究.華南農業大學學報，2009,30(3) 22-26)；野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris，野油菜黃單胞菌產膠基因GumD克隆與重組質粒的構建.食品科學，2006， 27(11) :182-184)，野油菜黃單胞菌為香蕉細菌性凋萎病病原菌；梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、香蕉細菌性枯萎病菌(Ralstoniasolanacearum race 2)、玉米細菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp. StewartiiPS)、白葉枯病菌(Xanthomonas oryze pv. oryze X0)、菜豆枯萎病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens CF)、丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv. syringae PSQ (香蕉細菌性枯萎病菌實時熒光PCR 檢測方法的建立.華南熱帶農業大學學報，2005，11(1) 1-5) 0其中梨火疫病菌(Erwinia amylovora) > ^^"卜 11^ ! (Erwinia carotovora subsp. carotovoraEcc) ^i^-MMM 性軟腐病菌同屬不同種，野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)、香蕉細菌性枯萎病菌 (Ralstonia solanacearum race 2)為國內外報道的香蕉細菌性病害。反應體系為 25μ 1 :Taq MasterMix (Taq DNA polymerase、PCR Buffer、Mg2+、 dNTP以及PCR穩定劑和增強劑組成的預混體系，濃度為2X) 12. 5 μ 1，10 μ M的引物LF和 LR 各 1 μ 1，模板 DNA 1 μ 1，RNase-Free water 補足 25 μ 1。PCR 反應條件是94°C 預變性 5min ；94°C 變性 20s，53°C 退火 20s，72°C 延伸 30s, 35 個循環；72°C 總延伸 IOmin0 取 8μ 1 PCR產物用(w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結果(圖1)顯示只有香蕉細菌性軟腐病菌 (Pectobacterium chrysanthemi)有171bp的條帶擴增，說明設計的檢測引物LF/LR具有良好的特異性。(5)PCR檢測香蕉細菌性軟腐病病原菌的靈敏度取32°C搖床過夜培養的香蕉細菌性軟腐病病原菌菌懸液依次以IOX的梯度稀釋直到IO9X,然后，IO4X、105X、106X、 IO7XUO8XUO9X稀釋液各取100 μ 1涂布平板，每個濃度梯度做三個重復。平板在32°C 條件下培養48小時后計算每個濃度梯度下菌落生長數。發現IO6X涂布的平板平均生長 210個菌落，IO7X有20個菌落，IO5X無法計數，由此可以判斷原菌液濃度為2X109CFU/ml。 以109CFU/ml 10CFU/ml的9個稀釋梯度為模板做PCR檢測。PCR反應條件是95°C預變性5min ；94°C變性20s，53°C退火20s，72°C延伸30s，35個循環；72°C總延伸IOmin0反應體系為 25 μ 1 :Taq MasterMix (Taq DNA polymerase、PCR Buffer, Mg2+、dNTP 以及 PCR 穩定劑和增強劑組成的預混體系，濃度為2X) 12. 5 μ 1，10 μ M的引物LF和LR各1 μ 1，模板 DNA 2 μ l,Rnase-Free water 補足 25 μ 1。反應完畢后取 8μ1 PCR 產物用 (w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果(圖2)顯示IO9 103CFU/ml模板均有相應的擴增帶，IO2 10CFU/ ml沒有擴增，這說明可以檢測到的濃度稀釋限點為103CFU/ml，即4個細菌(菌懸液原濃度為2X109CFU/ml)。該結果說明該檢測引物對香蕉細菌性軟腐病菌病原菌具有比較高的檢測靈敏度。(6)PCR檢測方法的應用當用于檢測香蕉植株組織香蕉細菌性軟腐病時用CTAB 法提取待檢測香蕉植株組織DNA，當檢測土壤中香蕉細菌性軟腐病菌時，將少量(0. 5g) 土壤樣品放入Iml無菌水中浸泡半小時，12000r/min離心lOmin，上清作為模板，當檢測病水中香蕉細菌性軟腐病菌時，用0. 22 μ m的濾膜對病水進行過濾富集，制備更高濃度的病水直接作為模板；按照如下的反應條件及體系進行PCR檢測反應條件是95°C預變性5min ； 94 °C變性20s，53 °C退火20s，72 °C延伸30s，;35個循環；72 °C總延伸lOmin。反應體系為 25 μ 1 =TaqMasterMix (Taq DNA polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTP 以及 PCR 穩定劑和增強劑組成的預混體系，濃度為2Χ)12. 5μ 1，10μΜ的引物LF和LR各1μ 1，模板DNA 2μ 1, RNase-Free water補足25 μ 1。反應完畢后取8 μ 1 PCR產物用(w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。實施例2(1)樣品采集及病原菌單胞分離鑒定2010年9月廣東省廣州市番禺區和南沙區、東莞市、中山市、珠海市、高州市、化州市、湛江市東海島和徐聞縣、廣西南寧市、福建省漳州市、海南省澄邁縣、臨高縣、樂東縣、東方市等香蕉種植地(如表1所示)，采集病株樣本，病區土樣和水樣帶回并分離病原菌。(2)香蕉細菌性軟腐病檢測①樣本的處理CTAB法提取病株假莖組織基因組DNA ；每0. 5g 土樣直接浸泡于 Iml無菌水半個小時，5000rpm離心5min，取上清待用；水樣無需處理。②PCR反應
25 μ 1反應體系中
Taq MasterMix12. 5μ 1
上游引物LF(IOyM)1 μ 1
下游引物LR(IOyM)1 μ 1
模板2μ 1
RNase-Free water 補足 25 μ 1。
PCR反應條件為
95°C預變性5min ；
94°C變性 20s，53°C退火 20s，72°C延伸 30s，;35 個循環；
72°C延伸 IOmin0
③PCR產物用(w/v)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳后用凝膠成像系統分析。
(3)檢測結果如表1所示，共檢測50分樣品，僅4份檢測結果為陰性，檢測成功率為 92%。部分電泳結果如圖3所示，病株樣本、病區土樣、水樣的陽性擴增在171bp處均有特異條帶。
(4)將分離得到的香蕉細菌性軟腐病菌單胞按照上述培養細菌的方法進行過夜培
養后稀釋至106CFU/ml，用注射器回接到健康的香蕉苗上進行致病力測定，3_5d后檢查發病情況，所有引起植株發病的單胞均與PCR檢測的陽性結果一致。通過香蕉細菌性軟腐病病害調查，海南省東方市、樂東黎族自治縣，廣東省廣州市、東莞市、中山市、珠海市，福建省漳州市發病較重，嚴重地塊發病率高達80%，海南省臨高縣、廣東省湛江市次之，海南澄邁縣和廣東茂名市稍輕，部部分地塊有零星發現。利用本發明得到的檢測結果與香蕉細菌性軟腐病害調查結果基本一致，這表明本發明所述方法具有較高的可行性，而且可對發病組織、病土、病水進行特異檢測。對檢出陽性的地塊，提醒蕉農在摘除老葉、割掉吸芽等農事操作的時候，首先對削刀進行消毒3-5分
7鐘，以防香蕉細菌性軟腐病在病株和健康植株之間交叉感染。同時可以用于我國香蕉無病種苗基地的建設，海關檢疫口岸對香蕉細菌性軟腐病菌的檢測等，具有良好的實用性。表1香蕉細菌性軟腐病采集樣品檢測結果
權利要求
1.-種香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法，其特征在于包括以下步驟(1)設計PCR引物，其中上游引物 LF :5’ -TTCGTCTAGAGGCCCAGGAC-3，下游引物 LR :5，-TCAGCTTGTTCCGGATTGTT-3，；(2)對樣本進行處理，得到樣本中的DNA；然后以樣本的DNA為模板，進行PCR反應，電泳檢測PCR產物，當PCR產物呈現171bp條帶，即樣本中含有香蕉細菌性軟腐病害病原菌。
2.根據權利要求1所述香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法，其特征在于步驟O)中所述的樣本為香蕉植株組織時，所述處理的方式為利用CTAB法抽提香蕉植株組織中的DNA。
3.根據權利要求1所述香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法，其特征在于步驟O)中所述的樣本為土壤時，所述處理的方式為用無菌水浸泡土壤，得到的上清液為模板。
4.根據權利要求3所述香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法，其特征在于所述處理的方式為每0. 5克土壤使用Iml無菌水浸泡半小時，得到的上清液為模板。
5.根據權利要求1所述香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法，其特征在于步驟( 中所述的樣本為病水時，所述處理的方式為用0. 22 μ m的濾膜對病水進行過濾富集，制備病菌濃度更高的病水作為模板。
6.根據權利要求1所述香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法，其特征在于步驟O)中所述PCR反應中的反應條件為94°C預變性5min ；94°C變性20s，53°C退火 20s，72°C延伸 30s，35 個循環；72°C總延伸 IOmin0
7.權利要求1 6任一項所述香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法應用于香蕉種苗檢疫、田間香蕉軟腐病的早期診斷以及病菌的監測和鑒定。
全文摘要
本發明公開了一種香蕉細菌性軟腐病害病原菌分子快速檢測的方法與應用。該方法為用特異性引物對樣本中含有的DNA進行PCR反應，當PCR產物呈現171bp條件，即樣本中含有香蕉細菌性軟腐病害病原菌。該方法操作簡單，耗時少，通量大。通過該方法對香蕉種苗、種植區土壤浸提液、灌溉水等進行定性檢測，得以實現我國香蕉無病種苗生產基地的建設、安全生產，同時堵截國外危險性帶病香蕉傳入的目的。
文檔編號C12Q1/04GK102154462SQ20111000351
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月10日 優先權日2011年1月10日
發明者李培謙, 林壁潤, 沈會芳, 潘群英, 蒲小明 申請人:廣東省農業科學院植物保護研究所