專利名稱：一種人工接種培育夏塊菌根苗的方法
技術領域：
本發明涉及一種菌根苗人工接種培育方法，尤其涉及一種人工接種培育夏塊菌根苗的方法。
背景技術：
塊菌通常與林木根系具有共生關系，是重要的野生食用菌，其子囊果含有較高的營養成分，商業價值為世人所矚目。法國、意大利的黑孢塊菌(Tuber melanosporum)和白塊菌(Tuber magnatum)在國際市場上價格貴如白金,并已經成為當地文化的重要組成部分。夏塊菌(拉丁學名:Tuber aestivum vitt.),子囊果呈不規則球形,基部常有凹陷,直徑3-6cm，表面具有5-6邊的角形疣凸，疣的直徑可達0.5cm,較黑孢塊菌和印度塊菌子囊要表面特征明顯。內部(孢體)蒼白色，后呈奶油色或褐黃色，內有相互交連和分枝的脈絡。
國內目前已經發現了印度塊菌、夏塊菌、白塊菌等20余種塊菌種類，主要分布于我國西南各省，出產季節為每年的10月一第2年2月，幼時白色至灰白色，成熟呈黑色或者褐色，具有清晰的乳白色菌脈，食之味美，含有豐富的蛋白質及多種維生素，尤其是維生素
A、維生素B2含量極高。由于塊菌的生長必需與合適的宿主植物根系營共生生活，否則將無法形成子囊果，這就意味著人工栽培塊菌離不開活體宿主植物，因而塊菌人工栽培比較困難，技術含量高，要實現塊菌的人工栽培必須首先突破菌根南的培育技術。國內雖然對我國的中國塊菌和印度塊菌在生理生態方面的研究較多，對其塊菌菌根首合成培育技術也有初步研究和報道。但是，技術在實驗室操作性過多，生產操作性不強，而且夏塊菌菌根苗培育技術鮮有見報道。接近的專利發明《一種塊菌與菌根合成方法》，專利申請號200810058447.9 存在問題一:《一種塊菌與菌根合成方法》供試樹種單一，塊菌菌種單一。方法中只涉
及了針葉樹種，未涉及闊葉樹種；方法中只涉及了中國塊菌，即印度塊菌，未涉及國際公認價值較高的夏塊菌、白塊菌。存在的問題二:宿主植物培育。《一種塊菌與菌根合成方法》中宿主植物基質采用滅菌I小時的珍珠巖和蛭石(1/1混合)，能夠保證苗木培育中的透水性，但不能解決苗木生長的養分營養需求問題，苗木生長緩慢，并且基質滅菌時間不夠，容易出現污染。而且宿主植物培育應該在高架相對封閉的溫室內進行培育，才能保障宿主植物培育過程中不受其它雜菌尤其是真菌的侵染。存在的問題三:《一種塊菌與菌根合成方法》中接種基質配方為腐殖質、水、蛭石1/1/1混合，PH值調整到7.0。實際上不同樹種間基質配比差異性較大，就印度塊菌的華山松菌根苗而言，過篩紅土與蛭石按1/1混合效果好得多，而土壤PH值調整應當在6.5-7.0的區間范圍內。存在的問題四:《一種塊菌與菌根合成方法》菌劑制備和接種技術苗圃操作性不強，易造成2次污染。一是塊菌子囊果取出后，未對其表面滅菌，其子囊果表面可能含有的其它真菌和泥土是不能無菌水洗掉的，可能造成菌根苗的直接污染。二是接種方式采取的是蘸根，接種液的濃度也偏小，蘸取過程中因為根系發育等不一致，將造成接種各苗之間孢子量不對稱。存在的問題五:《一種塊菌與菌根合成方法》缺乏煉苗過程。《一種塊菌與菌根合成方法》中菌根苗培育是直接放置在自然通風的大棚內進行，在苗木培育初始的15-30天，需要相對空間無菌的空間進行煉苗，塊菌菌根形成效果會更穩定，杜絕初期受外界雜菌的
競爭影響。
發明內容
本發明的目的就在于提供一種解決上述問題，針對夏塊菌菌根苗的人工接種培育方法。為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是:1.一種人工接種培育夏塊菌根苗的方法，包括如下步驟，
(1)培育宿主植物苗，詳細步驟是；
A、采集、遴選宿主植物種子；
所述宿主植物選用云南松、華山松、板栗之一種；
B、處理宿主植物種子；
將步驟A收集的種子水選去出空殼，用30%的H2O2浸泡處理40分鐘后，用蒸餾水沖洗，直至無H2O2氣味為止；
C、制備培養基；
將蛭石與泥炭土按體積比1:1混合裝入育苗框內，經高溫121% -126°C高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上，形成無菌基質育苗框；
D、培育宿主植物；
將經步驟B處理后的植物種子及時播入無菌基質育苗框內，然后放置于溫室內催芽，出芽后移入大棚育株，直至長出根苗；
(2)制備菌種的菌劑，詳細步驟是；
A、采集和保存菌種；
采集夏塊菌子實體，先用刷體輕輕洗凈表面泥土，再在75%的酒精中浸泡3min對其表面滅菌，同時再在酒精燈火焰上快速灼燒，繼續滅菌，然后置于經高溫高壓滅菌后的河沙中，于3-5°C的溫度下冷藏保存備用，所述河沙采用高溫121°C _126°C高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上；
B、制備培養基；
將自然土與蛭石按體積比1:1混合而成，且用Imm的篩網過篩，再經高溫高壓121-126°C高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上，制成無菌基質；
C、制備菌劑；
塊菌菌劑的配制方法為，先稱取一定量的塊菌，用75%的酒精中浸泡1-3分鐘對其表面滅菌，然后再在酒精燈火焰上快速灼燒，繼續滅菌，置于滅菌后的操作臺上，用酒精滅菌后的粉碎機將其粉碎成粒徑小于Imm的粉末，使菌種的孢子出殼，然后將塊菌粉末與無菌基質按體積比1:4均勻混合；
(3)人工接種， 采用孢子粉接種法，詳細步驟是；A、整理育好的宿主植物苗，減去多余的根、葉；
B、在接種杯內填入經消毒殺菌的無菌土，無菌土填裝量約占接種杯容積的1/3，再將宿主植物苗放入杯中央；
C、向宿主植物苗根部撒菌種，使之附著在根系上；
D、裝填接種培育基質，將根系覆蓋；
(4)煉苗；
將剛接種塊菌的植株先放置于溫度在15_25°C之間，基質的濕度保持在50-80%的煉苗室內育苗架上培育15-30天，使菌種在宿主上寄生成功；
(5)培育菌根苗；
將已經寄生成功的植株移出到玻璃大棚的育苗架上培育6-24個月，成為可供大田栽培的商品苗。作為優選，所述宿主植物培育的步驟C中，所述云南松、華山松種子均勻撒播在育苗框內，上覆Icm滅菌基質，而板栗采用點播在育苗框內，上覆2-3cm滅菌基質，用清水將基質澆透后放置于溫度25°C的溫室中進行催芽，待80%以上的種子發芽后再移入溫度為10-35°C的大棚中進行植株培育，同時將基質的濕度保持在50 - 80%。作為優選，所述菌劑制備步驟中，菌種的一般保存期為1-3個月；若長期保存，要置于-18°C的冷凍室內真空保存。作為優選 ，所述人工接種步驟D中，所述接種培育基質使用高溫121-126 高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上的無菌基質，根據樹種的差異，云南松采用的泥炭土與蛭石比例按體積比1:1混合；華山松和板栗采用的自然土與蛭石比例按體積比1:1混合；基質的PH值用生石灰調節，維持在7.5。作為優選，所述遴選宿主植物種子的方法是，云南松和華山松用水選去除空殼后晾干后常溫儲藏備用；板栗種子水選去除霉爛和不飽滿的種子，晾干表面水分，再與濕度為25 - 35%的潔凈河沙按體積比1:2的比例混合，并置于5°C的冰箱中保存備用。作為優選，所述人工接種的步驟C中，所述接種量2_5g /株。與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明解決了夏塊菌人工接種的難題，以華山松、板栗、云南松為宿主，將夏塊菌孢子在相對無菌的條件下，即杜絕真菌的競爭和多數霉菌侵染的條件下，足量與夏塊菌宿主樹種根部接觸，在一定時間內保持夏塊菌孢子單一的感染優勢，形成穩固和大量的夏塊菌菌根。
圖1為本發明的流程示意圖。
具體實施例方式下面將結合附圖對本發明作進一步說明。實施例:參見圖1，一種人工接種培育夏塊菌根苗的方法，包括如下步驟，
(O培育宿主植物苗，詳細步驟是；
A、采集、遴選宿主植物種子；
所述宿主植物選用云南松、華山松、板栗之一種；所述遴選宿主植物種子的方法是，云南松和華山松用水選去除空殼后晾干后常溫儲藏備用；板栗種子水選去除霉爛和不飽滿的種子，晾干表面水分，再與濕度為25 - 35%的潔凈河沙按體積比1:2的比例混合，并置于5 °C的冰箱中保存備用；
B、處理宿主植物種子；
將步驟A收集的種子水選去出空殼，用30%的H2O2浸泡處理40分鐘后，用蒸餾水沖洗，直至無H2O2氣味為止；
C、制備培養基；
將蛭石與泥炭土按體積比1:1混合裝入育苗框內，經高溫121-126 高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上，形成無菌基質育苗框；
D、培育宿主植物；
將經步驟B處理后的植物種子及時播入無菌基質育苗框內，然后放置于溫室內催芽，出芽后移入大棚育株，直至長出根苗； 所述云南松、華山松種子均勻撒播在育苗框內，上覆Icm滅菌基質，而板栗采用點播在育苗框內，上覆2-3cm滅菌基質，用清水將基質澆透后放置于溫度25°C的溫室中進行催芽，待80%以上的種子發芽后再移入溫度為10-35°C的大棚中進行植株培育，同時將基質的濕度保持在50 — 80% ;
(2)制備菌種的菌劑，詳細步驟是；
A、采集和保存菌種；
在夏塊菌成熟的季節9-12月收集成熟、個頭大、外型好、無損傷、香味相對較濃的夏塊菌子實體，采集夏塊菌子實體，先用刷體輕輕洗凈表面泥土，再在75%的酒精中浸泡3min對其表面滅菌，同時再在酒精燈火焰上快速灼燒后，通過灼燒子實體滅菌，置于經高溫高壓滅菌后的河沙中，于3-5°C的溫度下冷藏保存備用，所述河沙采用高溫121-126°C高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上；菌種的一般保存期為1-3個月；若長期保存，要置于_18°C的冷凍室內真空保存；
B、制備培養基；
將自然土與蛭石按體積比1:1混合而成，且用Imm的篩網過篩，再經高溫高壓121-126°C高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上，制成無菌基質；
C、制備菌劑；
塊菌菌劑的配制方法為，先稱取一定量的塊菌，用75%的酒精中浸泡1-3分鐘對其表面滅菌，然后再在酒精燈火焰上快速灼燒，繼續滅菌，置于滅菌后的操作臺上，用酒精滅菌后的粉碎機將其粉碎成粒徑小于Imm的粉末，使菌種的孢子出殼，然后將塊菌粉末與無菌基質按體積比1:4均勻混合，所述塊菌菌劑一般應現用現配，若配制好的塊菌菌劑未用完，可暫時存放于3 - 5°C的冰箱中備用；
(3)人工接種，采用孢子粉接種法，詳細步驟是；
采用孢子粉接種法，在接種室內安放潔凈的不銹鋼工作臺，先用75%的酒精將桌面擦干凈后，選擇長勢好，根系發達的宿主植物，用剪刀剪去部分根系和多余生長葉，放在已滅菌處理過的容器中備用，選擇一只已經使用0.5%高錳酸鉀溶液滅菌的育苗杯Φ IOX 15cm，先在杯中裝入占杯體積I / 3的滅菌土，再將植株放入杯中央，用小勺將配制好的塊菌菌劑撒在根上，最后加入接種培育基質至距育苗杯邊緣0.5cm處，塊菌菌劑的接種量為2-5g /株;
通過多次實驗，所述接種培育基質使用高溫121-126°C高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上的無菌基質，根據樹種的差異，云南松采用的泥炭土與蛭石比例按體積比1:1混合；華山松和板栗采用的自然土與蛭石比例按體積比1:1混合；基質的PH值用生石灰調節，，一般維持在7.5比較適宜，此時的滅菌效果以及接種效果成功率最佳
(4)煉苗；
將剛接種塊菌的植株先放置于溫度在15_25°C之間，基質的濕度保持在50-80%的煉苗室內育苗架上培育15-30天，使菌種在宿主上寄生成功；
(5)培育菌根苗； 將已經寄生成功的植株移出到玻璃大棚的育苗架上培育6-24個月，成為可供大田栽培的商品苗，在菌根苗培育期間，要注意大棚周邊的衛生，根據溫度和濕度的變化及時給苗木補充水分；并且注意觀察植株的養分缺失情況，通過葉面施肥適當補充養分。(6)檢測確認；
夏塊菌接種3個月后，可通過塊菌菌根苗的顯微特征，評估感染率和感染指數；接種成功的塊菌菌根在40-60倍的立體顯微鏡下可進行觀察，形態多為棒狀、二叉狀，多叉狀和珊瑚狀。菌根初期，端部呈白色或淺金黃色，之后顏色逐漸變深呈淺棕色；在顯微鏡下可清晰看到表面有半透明的金黃的菌絲，且無序地生長在菌根表面。在600倍顯微鏡下可觀察到菌根表層形成哈蒂氏網層的鞘細胞組織，夏塊菌的呈線條分明的多邊形，不同于印度塊菌與黑孢塊菌形成的不規則弧形花紋。夏塊菌菌根苗經檢測無污染，并且菌根感染率達到90%以上的可出栽。出栽時要根據苗木的生長適應范圍、土壤PH值和鈣含量選擇種植地，種植地最好選擇在棄耕地，受外生菌根真菌影響較小，土壤石礫含量適中，土層厚度大于50cm的土地。土壤PH值應在
7.0-7.5之間，若低于此標準，應采用混用石灰石的方法將PH值提高到此范圍。云南松菌根適宜在海拔1100-1700m區域內，板栗菌根苗適宜在海拔1600_2000m區域內，華山松菌根苗適宜在海拔1900-2400m區域內。本發明解決了夏塊菌人工接種的難題，以華山松、板栗、云南松為宿主，將夏塊菌孢子在相對無菌的條件下，即杜絕真菌的競爭和多數霉菌侵染的條件下，足量與夏塊菌宿主樹種根部接觸，在一定時間內保持夏塊菌孢子單一的感染優勢，形成穩固和大量的夏塊菌菌根。以上對本發明所提供的人工接種培育夏塊菌根苗的方法進行了詳盡介紹，本文中應用了具體個例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想；同時，對于本領域的一般技術人員，依據本發明的思想，在具體實施方式
及應用范圍上均會有改變之處，對本發明的變更和改進將是可能的，而不會超出附加權利要求所規定的構思和范圍，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。
權利要求
1.一種人工接種培育夏塊菌根苗的方法，其特征在于:包括如下步驟， (1)培育宿主植物苗，詳細步驟是； A、采集、遴選宿主植物種子； 所述宿主植物選用云南松、華山松、板栗之一種； B、處理宿主植物種子； 將步驟A收集的種子水選去出空殼，用30%的H2O2浸泡處理40分鐘后，用蒸餾水沖洗，直至無H2O2氣味為止； C、制備培養基； 將蛭石與泥炭土按體積比1:1混合裝入育苗框內，經高溫121-126 高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上，形成無菌基質育苗框； D、培育宿主植物； 將經步驟B處理后的植物種子及時播入無菌基質育苗框內，然后放置于溫室內催芽，出芽后移入大棚育株，直至長出根苗； (2)制備菌種的菌劑，詳細步驟是； A、采集和保存菌種； 采集夏塊菌子實體，先用刷體輕輕洗凈表面泥土，再在75%的酒精中浸泡3min對其表面滅菌，同時再在酒精燈火焰上快速灼燒，繼續滅菌，然后置于經高溫高壓滅菌后的河沙中，于3-5°C的溫度下冷藏保存備用，所述河沙采用高溫121-126°C高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上； B、制備培養基； 將自然土與蛭石按體積比1:1混合而成，且用Imm的篩網過篩，再經高溫高壓121-126°C高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上，制成無菌基質； C、制備菌劑； 塊菌菌劑的配制方法為，先稱取一定量的塊菌，用75%的酒精中浸泡1-3分鐘對其表面滅菌，然后再在酒精燈火焰上快速灼燒，繼續滅菌，置于滅菌后的操作臺上，用酒精滅菌后的粉碎機將其粉碎成粒徑小于Imm的粉末，使菌種的孢子出殼，然后將塊菌粉末與無菌基質按體積比1:4均勻混合； (3)人工接種，采用孢子粉接種法，詳細步驟是； A、整理育好的宿主植物苗，減去多余的根、葉； B、在接種杯內填入經消毒殺菌的無菌土，無菌土填裝量約占接種杯容積的1/3，再將宿主植物苗放入杯中央； C、向宿主植物苗根部撒菌種，使之附著在根系上； D、裝填接種培育基質，將根系覆蓋； (4)煉苗； 將剛接種塊菌的植株先放置于溫度在15_25°C之間，基質的濕度保持在50-80%的煉苗室內育苗架上培育15-30天，使菌種在宿主上寄生成功； (5)培育菌根苗； 將已經寄生成功的植株移出到玻璃大棚的育苗架上培育6-24個月，成為可供大田栽培的商品苗。
2.根據權利要求1所述一種人工接種培育夏塊菌根苗的方法，其特征在于:所述宿主植物培育的步驟C中，所述云南松、華山松種子均勻撒播在育苗框內，上覆Icm滅菌基質，而板栗采用點播在育苗框內，上覆2-3cm滅菌基質，用清水將基質澆透后放置于溫度25°C的溫室中進行催芽，待80%以上的種子發芽后再移入溫度為10-35°C的大棚中進行植株培育，同時將基質的濕度保持在50% — 80%。
3.根據權利要求1所述一種人工接種培育夏塊菌根苗的方法，其特征在于:所述菌劑制備步驟中，菌種的一般保存期為1-3個月；若長期保存，要置于_18°C的冷凍室內真空保存。
4.根據權利要求1所述一種人工接種培育夏塊菌根苗的方法，其特征在于:所述人工接種步驟D中，所述接種培育基質使用高溫121 °C _126°C高壓1.5kg/cm2滅菌2小時以上的無菌基質，根據樹種的差異， 云南松采用的泥炭土與蛭石比例按體積比1:1混合；華山松和板栗采用的自然土與蛭石比例按體積比1:1混合；基質的PH值用生石灰調節，維持在7.5。
5.根據權利要求1所述一種人工接種培育夏塊菌根苗的方法，其特征在于:所述遴選宿主植物種子的方法是，云南松和華山松用水選去除空殼后晾干后常溫儲藏備用；板栗種子水選去除霉爛和不飽滿的種子，晾干表面水分，再與濕度為25 - 35%的潔凈河沙按體積比1:2的比例混合，并置于5°C的冰箱中保存備用。
6.根據權利要求1所述一種人工接種培育夏塊菌根苗的方法，其特征在于:所述人工接種的步驟C中，所述接種量2-5g /株。
全文摘要
本發明公開了一種人工接種培育夏塊菌根苗的方法，通過無菌苗培育、菌種的菌劑制備、人工接種、煉苗、菌根苗培育、檢測確認步驟，攻克了夏塊菌人工接種的難題，與現有培育方法相比較，本發明以華山松、板栗、云南松為宿主，將夏塊菌孢子在相對無菌的條件下，即杜絕真菌的競爭和多數霉菌侵染的條件下，足量與夏塊菌宿主樹種根部接觸，在一定時間內保持夏塊菌孢子單一的感染優勢，形成穩固和大量的夏塊菌菌根。
文檔編號A01G1/04GK103070013SQ20131003555
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月30日 優先權日2013年1月30日
發明者韓燈, 林強, 雷徹虹, 柳成益, 李榮偉, 陳賓, 唐平, 葉光志 申請人:攀枝花市林業科學技術推廣站(攀枝花市林業工作總站)