白塊菌菌根合成方法
【專利摘要】白塊菌菌根合成方法，具體涉及國產白塊菌（攀枝花白塊菌T.panzhihuanense?sensu?lato）與華山松菌根合成方法。包括華山松種子和白塊菌菌種及其子實體的篩選、無菌樹苗的培育、菌劑制備、育苗基質配伍及其pH值的調節及其優選，菌劑濃度、接種要求，菌根苗的培養與菌根形態解剖與基因水平DNA分子檢測和確認，移栽種植等步驟，為實現國產白塊菌（攀枝花白塊菌T.panzhihuanense?sensu?lato）的人工種植提供了必備的關鍵核心技術，本方法可應用于荒山荒坡土壤修復與改良、退耕還林植樹造林及植被的修復與重建，對于開發利用石灰巖山地粘質土壤區域及偏僻山地林區具有巨大潛力，最終實現人工菌根合成及其種植白塊菌，實現稀有物種的保護和持續利用。本發明的方法操作簡易，容易廣泛應用與推廣。
【專利說明】白塊菌菌根合成方法
【技術領域】:
[0001]本發明屬于植物與微生物技術交叉領域，具體地，涉及白塊菌菌根合成方法，特別涉及國產白塊菌與華山松菌根的合成方法。
【背景技術】:
[0002]塊菌在國際貿易上被稱為“松露(truffles)”；黑色的稱為黑塊菌(黑松露)；淺色的稱為白塊菌(白松露)。白塊菌是自然界更為稀缺的生物資源，具有重大的科學研究價值和不可取代的生態價值。由于其味香特殊，價甚鉆石，被譽為“舌尖上的鉆石”、“上帝的食物”，而成為聞名遐邇的奇珍異饈，是塊菌家族中最昂貴的類群。近10多年來國際需求強勁，價格攀升，導致掠奪性采集，自然資源量銳減，白塊菌已處于極度瀕危狀態。
[0003]采用人為接種感染宿主植物無菌幼苗形成白塊菌類菌根是目前唯一的途徑，菌根合成已成為實現白塊菌菌根合成及其種植中的關鍵核心技術。
[0004]迄今，現有技術中未見有白塊菌菌根合成方法，以及白塊菌與華山松菌根合成方法的報道和記載。本發明即是為解決這一技術難題而經長期探索形成的。
【發明內容】
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[0005]本發明的目的在于提供白塊菌菌根合成方法，以及白塊菌與華山松菌根合成方法。該方法涉及一系列程序與步驟，即華山松種子和塊菌菌種子實體的篩選、宿主植物無菌樹苗的培育、菌劑制備、育苗基質PH值的調節及其配置和優選，菌劑濃度、接種要求，菌根苗的培養與菌根形態解剖與DNA分子檢測和確認，移栽種植，以最終實現人工種植白塊菌，實現保護和持續利用的目的。
[0006]為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案:`[0007]白塊菌與華山松菌根合成方法，包括下述步驟:
[0008]( I)華山松播種和無菌苗培育
[0009]A、種子篩選和消毒殺菌:取4-8°C冰箱內保藏不超過I年的華山松種子，30%H202浸泡2小時，無菌水沖洗數次，棄去漂浮的種子，再用無菌水浸泡48小時，撈出，用機械方式使種子輕微破口，復用75%酒精棉紗擦拭消毒，放培養皿中備用；
[0010]B、育苗基質制備:取未過篩蛭石與珍珠巖按體積比1:1混勻，加入水使其含水量達30%，121-126°C下高壓蒸汽滅菌I小時；或取新生產的蛭石和珍珠巖按1:1比例混均備用；
[0011]C、播種:將(I)A步驟中備好的種子，以開口端向下的方向播入基質，播種深度為
1.5-2cm，覆蓋培養；
[0012]D、育苗:播種后適時無菌水澆灌；播種后第10日開始出芽，30日種子出芽大部分完成；苗齡在1.5-3月時開始接菌劑。
[0013](2)白塊菌菌劑制備和接種，
[0014]A、菌劑制備:選國產的成熟白塊菌，顯微鏡下鑒定確認，觀察到黑褐色的孢子與未成熟黃褐色孢子的比例達95:5為成熟子囊果，成熟子囊果用自來水清洗干凈后，無菌水沖洗3遍，4-8°C冷藏10-20天后，再在_24°C冷凍保存不超過18個月備用。
[0015]菌劑制備前將冷凍子囊果取出，自然解凍，將每一子囊果切為數塊，放置于攪拌機中，加無菌水粉碎，顯微鏡下鏡檢，確定95%的子囊游離，5%的孢子從子囊分離出為止，菌劑的濃度為每克子囊果/水=lg/3-5ml ；
[0016]B、接種基質制備及pH值調整:腐殖質土 2目過篩，適量拌入水，使水分含量30%，高壓滅菌3小時后備用；腐殖質與蛭石以體積比1/1的比例混合，加入石灰粉，混勻，調整pH 為 7.6—8.3，備用； [0017]C、接種:按每株接種1.2X IO7個孢子的量折算出每株需接種的菌劑的體積，取稀釋菌劑澆入基質，拌勻；將步驟(1)所得幼苗自育苗基質中取出，剪去根末端，將幼苗的根系全部浸入步驟(2) A制備的菌劑稀釋液中沾取孢子后取出，植入步驟(2) B的制備的接種基質中培育；
[0018](3)菌根苗培育:接種的幼苗置于自然通風大棚，自來水澆灌，干濕交替培養，培養溫度10-26°C，每天太陽光照10-14小時。
[0019]華山松塊菌菌根苗培育5-6個月后，通過形態解剖及分子水平的確認塊菌菌根形成,并達到95%以上的菌根合成率，即可移植。
[0020]本發明技術方案的提出基于下述的塊菌菌根合成原理:塊菌是一類與木本植物(主要為松科Pinaceae、殼斗科Fagaceae、棒科Corylaceae、樣木科Betulaceae、楊柳科Salicaceae等)形成外生菌根的共生性地下生子囊菌類真菌，其生長發育及子實體形成都必須與這些植物的根系共生才能實現。因此采用人工配置的特定基質和育苗條件來合成菌根培育菌根樹苗，用白塊菌的組織和孢子制成塊菌菌種菌劑接種，在人為干預和控制的條件下，通過根部創傷促進幼苗產生更多的新幼根，以此滿足白塊菌孢子萌發時能夠快速感染到幼根的需求，促成菌根的形成，把合成的菌根樹苗種植栽培在適宜的山地(pH值
7.6-8.3、炭氮比C/N ^ 10)，實現珍稀物種白塊菌的有效保護和人工種植，確保持續發展。
[0021]本發明白塊菌與華山松菌根合成的方法，優化了菌根樹苗的培育、培養基質和菌齊_作及菌根合成和菌根的檢測與確認。
[0022]本發明更具體的合成步驟和技術方法如下:
[0023]1、基質制備與育苗
[0024]基質制備:蛭石與珍珠巖按體積比1/1混勻，加入自來水使其含水量達30%，121-126?下高壓蒸汽滅菌I小時后冷卻備用(若為新生產的蛭石和珍珠巖也可不必滅菌，可直接使用)。
[0025]播種與育苗:挑選成熟飽滿的種子，用75%酒精表面消毒滅菌，以機械的方法使其開裂微口，開口端向下播入上述基質。播種深度1.5-2cm為宜；要適時澆灌；播種后第10日開始出芽，30日后幾乎全部種子出芽完成，萌發率的統計從第6日至第30日；苗齡在1.5-3月時即可接種。
[0026]2.菌劑及其制備
[0027]子實體篩選與保藏:首先使用顯微鏡鏡檢鑒定白塊菌，確認塊菌子實體準確無誤，避免其它雜菌混入；從中選取成熟的白塊菌，以深黑褐色的孢子量比率達95%以上的為成熟子囊果；沖刷清洗去除泥土后，用無菌水沖洗；4_8°C冷藏箱保藏10-20天后，移入_24°C冷凍室保存備用。
[0028]菌劑制備:冷凍子囊果自然解凍，用小刀將每一子囊果切為數塊；將小切塊放置于攪拌機中，加無菌水粉碎，顯微鏡下鏡檢，以確定無肉眼可見的組織塊，使95%的子囊游離，約5%的孢子從子囊分離出為止。菌劑的濃度以每克子囊果/水=lg/3-5ml為宜。
[0029]3.接種
[0030]基質制備及pH值調整:腐殖質土過篩,適量拌入水，水分含量30%，高壓滅菌3小時備用；滅菌后的腐殖質與蛭石以體積比l/ι的比例混均，加入石灰粉，充分混勻，調整pH為7.6—8.3時即可備用。
[0031]接種與培育:根據每株接種含有1.2X IO7個孢子菌劑的劑量要求，取上述制成的菌劑原液稀釋20倍，取Iml稀釋菌液移入基質，攪拌均勻；取上述培養的幼苗剪去根端，并將整個根系浸入稀釋菌劑之后移植基質培育。接種后的幼苗置于自然通風大棚培育。
[0032]4.菌根形態及分子水平驗證:
[0033]外觀特征:菌根形成后菌根末級分枝棒狀或近圓柱狀，表面光滑，多數情況具有明顯外延菌絲，末端透明、乳白色至淡黃色，向基部顏色由淺褐色至褐色漸變，常形成深淺相間的蛇紋樣斑紋；菌套明顯，有時表面覆蓋形成外延菌絲，菌套細胞不透明。抽樣統計每株菌根數量均為700-800個，單株根系感染率可以達95%以上。
[0034]解剖特征:外菌套平面觀非膠質化，擬薄壁組織(pseudoparenchymatoustissue) M型，表面具表皮樣細胞(epidermal cells)。內菌套平面觀介于疏絲組織型(pletenchymatous tissue)與擬薄壁組織型之間,近似H型,多數部位近哈蒂氏狀(Hartignet-like),菌絲排列較緊密,粗I _ 3 μ m,薄壁,透明；外延菌絲放射狀分布，近等粗，針狀，薄壁，不分枝，無色。`
[0035]分子水平驗證:經過白塊菌制菌劑子實體和截取華山松菌根樹苗菌根總DNA的提取，采用了改進的CTAB法和真菌DNA試劑盒、PCR擴增及ITS1/ITS4和ITS4/ITS5對比分析，分別都得到100%的一致性，表明所培育合成獲得的華山松幼苗菌根是由白塊菌菌絲侵入形成的；形態特征與分子水平均確認華山松與白塊菌菌根合成是成功的。
【具體實施方式】:
[0036]為了更好地了解本發明，下面用本發明的實施例證來進一步說明本發明的內容，但本發明的內容并不局限于此。
[0037]實施例1:
[0038]白塊菌與華山松菌根苗的合成:
[0039]1、華山松育苗:
[0040]( I)備種
[0041]秋季采集成熟華山松種子，4_8°C冰箱內保藏，保藏期不超過I年。用前取出，30%H202浸泡2小時，其間攪動數次一無菌水沖洗數次一棄去漂浮的種子一無菌水浸泡48小時，撈出一用機械方式，使種子輕微破口一復用75%酒精棉紗擦拭消毒，放培養皿中備用。
[0042](2)基質
[0043]蛭石(未過篩)與珍珠巖按體積比1/1混勻，加入自來水使其含水量達30%，121-126?下高壓蒸汽滅菌I小時；若為新生產的蛭石和珍珠巖也可不滅菌直接使用。[0044](3)播種
[0045]將備好的種子，以開口端向下的方向播入基質。播種深度為1.5-2cm;容器為425 X 340 X 200mm透水塑料筐。
[0046](4)育苗
[0047]自來水澆灌；播種后第10日開始出芽，30日后幾乎全部種子出芽完成，萌發率的統計從第6日至第30日，發芽率約為80%;苗齡1.5-3月時即可接種。
[0048]2、菌劑
[0049]為了確保獲得成熟的孢子，選2-3月份國產成熟白塊菌(攀枝花白塊菌T.panzhihuanense sensu Iato 及其近緣種會東塊菌 T.huidongense、T.cf.liyuanum),不分大小；在顯微鏡下逐個鏡檢子實體孢子形態等分類學特征以確定種的正確性；孢子成熟度，即以黑褐色孢子(成熟)與黃褐色孢子(未成熟)的比例達95:5為成熟孢子。硬毛刷在自來水中洗刷去表面泥土并清洗至無泥土殘留，無菌水沖洗3遍；4-8°C冷藏10-20天后，_24°C冷凍保存；保存期不應超過18個月。
[0050]菌劑制備前將冷凍子囊果從冰箱內取出，自然解凍。解凍后用小刀將每一子囊果切為數塊；將切塊放置于PHILIPS HR2839型二合一攪拌粉碎機中，每次放子囊果約200g，加無菌水粉碎，最初加水少許，后逐漸增加水量，適量加冰塊以降溫，粉碎約3-4分鐘，顯微鏡下鏡檢，以確定無肉眼可見的組織塊，95%的子囊彼此分離，約5%以上的孢子從子囊內分離出為止。菌劑的濃度以每克子囊果/水=lg/3-5ml為宜。
[0051]孢子計數:菌劑原液充分攪勻，在容器上中下部位各取1ml，置于3個量筒內，量筒內Iml稀釋至10ml，攪勻；每一量筒上中下部各取一滴，置血球計數板；算出單位體積原液折合的孢子數目；同時，取原液IOml菌劑以無菌水稀釋20倍后置燒杯中供接種時蘸根。
`[0052]3、接種
[0053]( I)基質制備及pH值確定
[0054]腐殖質2目過篩，適量拌入自來水，使水分含量約30%，121_126°C高壓蒸汽滅菌3小時以上，高壓滅菌后的腐殖質與蛭石(滅菌或否)以體積比按1/1的比例混合后備用；
[0055]以上基質取一定質量(如100g)，分為4等份，在各等份中分別加入不同質量的熟石灰粉，充分混勻，每份各取30ml，加入150ml蒸餾水，其間攪動數次，I小時后，用精密pH試紙(5.5-9.0)測得每份基質的pH值。計算pH為7.6 — 8.3時基質與石灰的質量比。按以上比例在基質中加入石灰，充分混勻后備用。
[0056](2)接種
[0057]方法:按每株接種1.2X IO7個孢子的量折算出每株需接種的菌劑原液的體積，如菌劑原液稀釋20倍后，以量筒量取Iml菌劑后澆入基質，將菌劑與基質拌勻備用；幼苗自育苗基質中取出，用剪刀剪去根的末端以促使生出更多的側根；將根系全部浸沒入步驟2制備的稀釋菌劑后取出，容器底部1/5放入接種基質后將幼苗植入；基質占容器容積的4/5。
[0058]4、菌根苗培育
[0059]接種苗置于自然通風大棚，自來水澆灌，干、溫交替，培養溫度10-30°C，每天光照10-14小時。
[0060]5、菌根形態
[0061]接種后約需5-6個月，塊菌菌絲侵入幼苗根系形成菌根。確認菌根是否形成，需要從菌根形態及其解剖特征和分子水平(即親子鑒定)予以確認。
[0062]外觀特征:菌根系統(mycorrhizal systems) 二叉狀(dichotomous),偶簡單不分枝狀(unramified),有時近珊瑚狀(coralloid)或介于類型之間，總長2_5.2mm,具1- 4級次生分枝，有時數個具3-4級分枝的菌根沿根緊密排列形成近簇狀；末級分枝棒狀或近圓柱狀，頂端直，長0.7-4.1mm，頂端直徑(220) 300 - 450 μ m，基部粗200-300 μ m，表面光滑，有時具外延菌絲，頂端透明、乳白色至淡黃色，中部淺褐色或淺紅褐色，向基部顏色漸深，菌根老化后頂端與基部同色，常形成深淺相間的蛇紋樣；菌套明顯，有時表面覆外延菌絲，菌套細胞不透明；皮層細胞不可見；外延菌絲缺或僅限于最末一級分枝，針狀，短，透明，明顯。菌索末見。菌核末見。
[0063]解剖特征:外菌套平面觀非膠質化，擬薄壁組織(pseudoparenchymatous tissue)M型(依Agerer, 1987-2002),表面具表皮樣細胞(epidermal cells),不具菌絲網(hyphalnets),細胞薄壁，淺褐色或黃褐色，菌絲顏色透明，表面光滑無附屬物，長10 - 35 μ m，粗
2- 4 μ m，每20 μ mX 20 μ m方塊內7 - 10個細胞(包含完整的與僅部分位于樣方的細胞)。內菌套平面觀介于疏絲組織型(pletenchymatous tissue)與擬薄壁組織型之間，接近H型(依Agerer, 1987-2002),多數部位近哈蒂氏狀(Hartig net-like),菌絲排列較緊密,粗
2- 4 μ m，薄壁，無色；外延菌絲放射狀分布，近等粗，針狀，粗1- 2 μ m，薄壁，無分枝，顏色透明。鎖狀聯合缺。囊狀體和厚垣孢子缺。
[0064]分子水平驗證:經過制菌劑子實體和截取華山松菌根樹苗菌根總DNA的提取，采用了改進的CTAB法和真菌DNA試劑盒、PCR擴增及ITS1/ITS4和ITS4/ITS5對比分析，分別都得到100%的一致性，表明所培育獲得的華山松幼苗菌根是由白塊菌菌絲侵入形成的；確認華山松白塊菌菌根合成成功。
[0065]菌根數量:抽樣統`計每株菌根數量為700-800個，單株根系感染率(菌根數八不感染根尖數+菌根數)為95%。
[0066]注:此處“一個菌根”的定義為:由連續的可識別的菌套所覆蓋的區域所形成的一個單元。多分枝的菌根，若由連續的菌套所覆蓋，視為一個菌根。
[0067]與現有技術相比，本發明具備的優益性在于:
[0068]1、本發明為實現國產白塊菌的人工菌根合成及其種植提供了必備的關鍵核心技術。
[0069]2、通過本發明實現了國產白塊菌與華山松菌根的合成，利用本方法可以批量規模化合成培育白塊菌菌根樹苗，為下一步塊菌的人工種植產業化提供技術支撐與保障。
[0070]3、本發明可應用于荒山荒坡土壤修復與改良、退耕還林植樹造林及植被的修復與重建，對于開發利用石灰巖山地粘土區域及偏僻山地林區具有巨大潛力和廣闊的應用前
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[0071]4、本發明的方法操作簡易，容易廣泛應用與推廣。
[0072]5、本發明為生物學(微生物學、菌物學)與農學與林學(栽培學和林業)及其交叉學科菌根學Mycorrhizology領域的技術交叉,汲取了多個學科的多重優點，具有實用簡便的優勢。
【權利要求】
1.白塊菌菌根合成方法，包括下述步驟: (1)華山松播種和育苗， A、種子:篩選華山松飽滿種子，在4-8°C冰箱內保藏2-12個月；育苗時取出在30%H2O2浸泡2小時后，用無菌水沖洗5-6次，棄去漂浮的種子，用無菌水浸泡48小時，撈出，用破殼器機械方式使種子輕微破口，再用75%酒精棉紗擦拭消毒，置于培養皿中備用； B、基質:取未過篩蛭石與珍珠巖按體積比1:1混勻，加入水使其含水量達30%，在高溫(121~126°C )高壓(102.97~137KPa)下蒸汽滅菌至少I小時； C、播種:將(I)A步驟中備好的種子，以開口端向下的方向播入基質中，播種深度為1.5-2cm，覆蓋(I) B步驟中制備的基質，并撫平踏實； D、育苗:將上述播種好的育苗筐在育苗室育苗，室內溫度控制在16-25°C，確保通風透光，適時澆水育苗； (2)白塊菌菌劑制備和接種 A、菌劑制備:選1-2月份產的成熟白塊菌，顯微鏡下觀察孢子形態，孢子紋飾清晰，黑褐色孢子與未成熟黃褐色孢子的比例達95: 5為成熟子囊果，成熟子囊果用自來水清洗干凈后，無菌水沖洗3遍，4-8°C冷藏10-20天后，再在_24°C冷凍保存不超過18個月備用；菌劑制備前將冷凍子囊果取出，自然解凍，逐一鏡檢確認物種準確，將每一子囊果切為數塊顆粒狀，置于攪拌粉碎機中，加無菌水粉碎，顯微鏡下鏡檢，確定95 %的子囊游離，5 %的子囊孢子從子囊分離出為止，菌劑的濃度為每克子囊果/3_5ml水； B、接種基質制備:腐熟的腐殖質土過篩,適量拌入水,使水分含量30%，高溫(121~126 °C)高壓(102.97~13`7KPa)滅菌3小時備用；腐殖質、蛭石、砂、珍珠巖以體積比1:1:0.5:0.25的比例混合后，加入適量石灰粉使pH值調整為7.6 — 8.3，備用； C、接種，按每株接種1.2X107個孢子的量折算出每株需接種的菌劑的體積，取菌劑澆入步驟(2)B制備的基質中，拌勻；同時，將步驟(1)培育所獲得的幼苗自育苗基質中取出，剪去根的1/3末端以造成創傷，促進生根，將幼苗根系全部浸入步驟(2)A制備的菌劑后取出，植入步驟(2) B的已接種的基質中； (3)、菌根苗培育，已接種的幼苗置于自然通風、光照充足的育苗大棚內，自來潔凈水澆灌，干、溫交替培養，培養溫度10_26°C,太陽光照10-14小時。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于: (I)、華山松種子篩選和育苗， A、種子的篩選與消毒殺菌:選取保藏在4-8°C冰箱I年以內的華山松種子，用30%H2O2浸泡2小時，期間每15分鐘攪拌I次，之后無菌水沖洗4-5次，棄去漂浮的種子，再用無菌水浸泡48小時，撈出，用破殼器機械方式使種子輕微破口，反復用75%酒精棉紗擦拭消毒，置于培養皿中備用； B、基質的制備:取未過篩的蛭石與珍珠巖按體積比1/1的比例混勻，加入水使其含水量達30%，在121-126°C下高壓蒸汽滅菌鍋內滅菌I個小時；將制備好的基質在無菌的條件下分裝入容器為425 X 340 X 200mm透水塑料容器備用； C、播種:將(I)A步驟中備好的種子，以開口端向下的方向播入步驟(1)B制備好的基質容器內，播種深度為1.5-2cm，覆蓋培養； D、育苗:無菌水澆灌，為獲得健壯幼苗，嚴格控制澆水次數，干、濕交替，滿足通風透光要求；播種后通常第10日開始出芽，30日種子出芽大部分完成；苗齡在2-3月時開始接種。 (2)、白塊菌菌劑制備和接種， A、囷劑制備: 選取成熟的白塊菌子實體，顯微鏡下鏡檢子囊孢子確認滿足成熟條件，并逐一檢查確認無其它塊菌混入；鏡檢觀察到網紋清晰、黑褐色的子囊孢子達到95%以上子實體為成熟的子囊果；成熟子囊果用毛刷及自來水清洗干凈后，無菌水沖洗3-5遍，置4-8°C冷藏冰箱內冷藏10-20天后，移入_24°C冷 凍保藏箱內保藏備用；冷凍保藏時間不超過18個月； 菌劑制備前將冷凍子囊果取出，常溫下自然解凍，將每一子囊果切為數塊，置于粉碎機中，加無菌水粉碎；顯微鏡下鏡檢，確定95%以上的子囊游離，5%的子囊孢子從子囊中分離出為止；菌劑的濃度為每克子囊果用水3-5ml稀釋為宜，制成菌劑原液備用；使用時可再稀釋20倍； B、接種基質制備及pH值調整:腐殖質土過篩，適量拌入水，使水分含量達30%(即輕握成團，一觸即散)，高溫(121~126°C)高壓(102.97~137KPa)滅菌3小時；滅菌后的腐殖質與蛭石、砂、珍珠巖以體積比1:1:0.5:0.25的比例混合后，加入適量石灰粉，混勻調整pH值為7.6-8.3，備用； C、接種，按每株需接種1.2X107個孢子的量折算出每株需接種的菌劑的體積，取菌劑原液稀釋后澆入上述滅菌后的基質內，充分拌勻；將步驟(1)所得無菌幼苗自育苗基質中取出，剪去根1/3末端，將幼苗根系全部浸入步驟(2)A制備的菌劑稀釋夜中以沾取孢子菌劑后取出，植入步驟(2)B制備的接種基質中育苗培養；(3)、菌根幼苗的培育與管理:接種幼苗置于自然通風、光照充足的塑料大棚內，自來水澆灌，干、濕交替培養，培養溫度為10-26°C，每天光照10-14小時；華山松印度菌根苗培育5-6個月后，通過菌根苗菌根的確認后即可移植。
3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中菌根苗菌根的確認是從菌根形態及其解剖特征和分子水平予以確認: 外觀特征:菌根系統(mycorrhizal systems) 二叉狀(dichotomous),偶簡單不分枝狀(unramified),有時近珊瑚狀(coralloid)或介于類型之間，總長2_5.2mm,具1-4級次生分枝，有時數個具3-4級分枝的菌根沿根緊密排列形成近簇狀；末級分枝棒狀或近圓柱狀，頂端直，長0.7-4.1臟，頂端直徑(220)300 - 450 μ m，基部粗200-300 μ m，表面光滑，有時具外延菌絲，頂端透明、乳白色至淡黃色，中部淺褐色或淺紅褐色，向基部顏色漸深，菌根老化后頂端與基部同色，常形成深淺相間的蛇紋樣；菌套明顯，有時表面覆外延菌絲，菌套細胞不透明；皮層細胞不可見；外延菌絲缺或僅限于最末一級分枝，針狀，短，透明，明顯。菌索末見，菌核末見； 解剖特征:外菌套平面觀非膠質化，擬薄壁組織(pseudoparenchymatous tissue) M型(依Agerer, 1987-2002),表面具表皮樣細胞(epidermal cells),不具菌絲網(hyphalnets),細胞薄壁，淺褐色或黃褐色，菌絲顏色透明，表面光滑無附屬物，長10 - 35 μ m，粗2- 4 μ m，每20 μ mX 20 μ m方塊內7 - 10個細胞(包含完整的與僅部分位于樣方的細胞)，內菌套平面觀介于疏絲組織型(pletenchymatous tissue)與擬薄壁組織型之間，接近H型(依Agerer, 1987-2002),多數部位近哈蒂氏狀(Hartig net-like),菌絲排列較緊密,粗2- 4 μ m，薄壁，無色；外延菌絲放射狀分布，近等粗，針狀，粗1- 2 μ m，薄壁，無分枝，顏色透明，鎖狀聯合缺，囊狀體和厚垣孢子缺； 分子水平驗證: 經過制菌劑子實體和截取華山松菌根樹苗菌根總DNA的提取，采用了改進的CTAB法和真菌DNA試劑盒、PCR擴增及ITS1/ITS4和ITS4/ITS5對比分析。
【文檔編號】A01G1/04GK103548575SQ201310560468
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月12日 優先權日:2013年11月12日
【發明者】劉培貴, 王向華, 于富強, 萬山平, 鄧曉娟, 喬鵬, 趙文青 申請人:中國科學院昆明植物研究所