專利名稱：一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法
技術領域：
本發明涉及雜交鵝掌楸遺傳轉化方法，具體涉及一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法。
背景技術：
雜交鵝掌楸又名鵝掌楸(馬褂木)，它是由南京林業大學葉培忠教授等首次通過人工雜交的方法，將分布在亞洲的中國雜交鵝掌楸與分布在北美洲的北美雜交鵝掌楸采用人工控制授粉方法育成的雜交樹種。雜交鵝掌楸葉形奇特，花色艷麗，是優良的庭院栽培和園林觀賞樹種。同時，其樹體高大，主干圓滿通直，木材結構細致均勻，色淺，易干燥，易加工，纖維較長，是優良的制漿造紙、人造板及家具用材樹種，社會需求量極大。但是雜交鵝掌楸生長周期長，應用常規手段育種具有較大的困難。因此必須依靠現代生物技術并與常規育種相結合，進而縮短育種周期，加速育種進程，營造優質人工林，緩解木材供需矛盾。基因工程是生物技術的核心，為林木遺傳改良開辟了一條新的途徑。林木基因工程是通過適合的基因轉移技術，導入有用的外源基因，獲得轉基因植株，進行林木遺傳改良或有關的研究。近年來，林木基因工程取得了較大的進展。目前，已有幾百種植物得到遺傳改良，在豐產，抗病，抗寒等領域廣泛應用。農桿菌介導的遺傳轉化是外源DNA進入植物細胞最成功和應用最為廣泛的方法，自1976年D.Cleene和D.Ley (1976)首次報導根癌農桿菌菌株B6 (LMG18)也能感染裸子植物受傷組織并產生冠癭瘤(Crown gall)后，許多學者開始利用農桿菌進行木本植物的基因轉移。在農桿菌介導的遺傳轉化過 程中，成功的基因轉化首先依賴于良好的植物受體系統的建立。所謂植物基因轉化受體系統，是指用于轉化的外植體通過組織培養途徑或其他非組織培養途徑，能高效、穩定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉化選擇抗生素敏感的再生系統。目前，以植物體胚發生體系或體胚作為受體系統越來越受到重視。該系統的主要特點有四點:其一、組成胚狀體的胚性細胞接受外源DNA能力很強，是理想的基因轉化感受態細胞，而且這些細胞繁殖量大，同步性好，因此轉化率很高；其二、胚狀體個體間遺傳背景一致，無性系變異小，成苗快，數量多，而且還可以制成人工種子，有利于轉基因植株的生產和推廣；其三、胚狀體多為單細胞起源，轉化獲得的轉基因植株嵌合體少；其四、胚狀體具有兩極，在發育過程中同時可分化出芽和根，形成完整的植株，減少了不定芽發育過程中生根困難的難題。
發明內容
發明目的:針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，以建立穩定高效的雜交鵝掌楸遺傳轉化體系。技術方案:為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下:
一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，包括以下步驟:(O雜交鵝掌楸轉化受體的建立:取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細胞，接入含有M13雜交鵝掌楸液體培養基的三角瓶中，230C，95r/min的恒溫搖床振蕩培養；每7天繼代一次，繼代3次后建立出懸浮細胞系，即為雜交鵝掌楸轉化受體；
(2)農桿菌制備:先活化EHA105單菌落，在含有卡那霉素50mg/L、鏈霉素30mg/L的LB液體培養基中，28°C，280r/min振蕩培養至0D_為0.6-0.8，4°C離心收集菌體，用雜交鵝掌楸液體繼代培養基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右；
(3)侵染:取3ml菌液加到雜交鵝掌楸轉化受體中，并加入乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L。靜置l-3min后，置于23°C、95r/min的恒溫搖床中，繼續振蕩培養16 40h ；
(4)脫菌培養:將雜交鵝掌楸懸浮細胞經400目及150目的篩子過篩，用雜交鵝掌楸單細胞培養基將400目的篩子上的單細胞懸浮，置于23°C、95r/min的恒溫搖床，振蕩培養培養36h后，再用400目的篩子過篩一次，并用加有頭孢霉素500mg/L的雜交鵝掌楸單細胞培養基將400目篩子上的單細胞收集。并將單細胞以2mL每皿的濃度鋪平板，培養基為加有頭孢霉素500mg/L，約21天繼代一次；繼代一次后，可以觀察到子葉胚；
(5)篩選培養:待子葉胚成熟，并長到2cm左右，將其挑出，轉到MS基本培養基上生長，其中加有頭孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。步驟(1)中，取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細胞5mL，將其接種到250mL的三角瓶中，并在瓶壁輕輕敲散；量取50mL雜交鵝掌楸Ml3液體培養基加入三角瓶中，將材料置于23°C,95r/min的恒溫搖床振蕩培養。步驟(2)中，農桿菌制備，具體操作為:
1)將_70°C保存的EHA105菌液在冰上融化，用接種環蘸取少量菌液，接種到含有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB培養基上，將其置于28°C恒溫培養箱中培養；
2)待其長出單菌落后，用接種環挑取單菌落，接種到含有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB培養基上,再活化一次,然后將其置于28°C恒溫培養箱中培養；
3)待其長出單菌落后，用滅過菌的槍頭挑取單菌落接種到含有IOmL加有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB液體培養基的三角瓶中，28°C、220r/min振蕩培養；
4)約20h后，吸取2mL菌液，接種到含有50mL加有適量抗生素的LB液體培養基的三角瓶中，28°C、280r/min 振蕩培養至 OD600 為 0.6-0.8 ；
5)待農桿菌培養到OD6tltl為0.6-0.8時，取25mL菌液于50mL離心管中，于5000r/min，4°C離心IOmin,去除上清,收集菌體；
6)用雜交鵝掌楸液體繼代培養基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右。步驟(3 )中，共培養36 40h。所述的EHA105帶有35S:⑶S基因和NPT-1I基因。步驟(5 )中，每21天繼代一次，繼代2次后，就可用于移栽。有益效果:與現有技術相比，本發明以雜交鵝掌楸懸浮培養的單細胞作為遺傳轉化受體系統，通過農桿菌介導的方法，以GUS基因為報告基因，通過細胞學方法檢測GUS基因的瞬間表達、長期表達、通過分子生物學方法檢測等確定外源基因的高效轉化。本發明采用雜交鵝掌楸單細胞起源的體細胞胚胎發生體系， 有利于外源基因的導入，并降低了嵌合體的產生，具有很好的實用性。
圖1是雜交鵝掌楸的懸浮細胞系的顯微照片 圖2是雜交鵝掌楸體胚苗的顯微照片 圖3是PCR檢測轉化結果圖；圖中，泳道M為maker，泳道CK+為質粒pBI 121，泳道CK_為未經過轉化的馬褂木植株，泳道H2O為水，泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9為隨機選取的⑶S細胞學檢測為陽性的馬褂木轉基因植株；
圖4是RT-PCR檢測轉化結果圖；圖中，泳道M為maker，泳道CK+為質粒pBI 121，泳道CK_為未經過轉化的馬褂木植株，泳道1，2，3，4，5為隨機選取的PCR檢測及⑶S細胞學檢測顯示陽性的植株。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。以下實施例中，所使用到的培養基配方如下，未特別列出的，為常規培養基。MS 基本培養基配方:1650mg/L NH4NO3,1900mg/L KNO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4.7H20,440mg/L CaCl2, 27.8mg/L FeSO4.7H20, 37.3mg/L Na2EDTA, 22.3mg/LMnSO4.H20,8.6mg/L ZnSO4.7H20,6.2mg/L H3BO3,0.83mg/L KI,0.25mg/L Na2MoO4.2H20,
0.025mg/L CuS04.5H20，0.025mg/L CoCl2.6H20，100 mg/L MyO-1nositol, 2.0 mg/LGlycine,0.4 mg/L Thiamine *HCI,0.5 mg/L Nictinic acid,0.5 mg/L Pyridoxine *HCL.
雜交鵝掌楸單細胞培養基配方:3/4MS，附加0.2 mg/L ΝΑΑ,Ο.5 mg/L KT, 0.2 mg/L BA，5 g/L VC,0.5 g/L CH, 50 g/L 蔗糖。雜交鵝掌楸M13液體培養基配方:3/4MS，附加2.0 mg/L 2，4_D，0.2 mg/L 6_BA，0.5 g/L CH, 30 g/L 蔗糖。雜交鵝掌楸體胚誘導培養基配方:3/4MS，附加2 mg/L ABA, 5 g/L VC, 0.2 g/L LH,
2g/L AC,40 g/L 鹿糖，1.15 g/L Gel。LB 培養基配方:5 g/L Yeast extract, 10 g/L Tryptone, 5 g/L NaCl。實施例1雜交鵝掌楸轉化受體的建立。 成功的基因轉化首先依賴于良好的植物受體系統的建立。所謂植物基因轉化受體系統，是指用于轉化的外植體通過組織培養途徑或其他非組織培養途徑，能高效、穩定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對轉化選擇抗生素敏感的再生系統。20世紀70年代以來，對植物基因轉化受體系統的研究已經進行了大量的工作，先后建立了多種有效的受體系統，適應于不同轉化方法的要求和不同的轉化目的。本實施例采用雜交鵝掌楸懸浮細胞系為受體材料。懸浮細胞系的建立與一些物理因素有關，如細胞起始密度，振蕩培養時搖床的轉速等。本實施例利用基于固體培養條件下建立的雜交鵝掌楸的胚性愈傷培養物，建立一個穩定性、同步性和可重復性好，細胞活力旺盛的胚性細胞懸浮體系。相關研究報道，一個良好的懸浮細胞培養體系必須滿足以下基本條件:一，懸浮培養物分散性良好，細胞團較小，一般在30 50個細胞以下；二，均勻性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同，培養液清澈透亮，細胞色澤鮮艷；三，細胞生長迅速。因此為建立良好的雜交鵝掌楸的懸浮細胞系，選用繼代2周后的愈傷材料。具體步驟如下:
I)取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細胞約5mL，將其接種到250mL的三角瓶中，并在瓶壁輕輕敲散。2)量取50mL雜交鵝掌楸Ml3液體培養基加入三角瓶中，將材料置于23°C，95r/min的恒溫搖床振蕩培養。3)每7天繼代一次。繼代3次后可用于轉化，所建立的懸浮細胞系如圖1所示。實施例2農桿菌制備。農桿菌的培養、生長狀態及純度對轉化具有重要作用。如果農桿菌本身生長不良，則其侵染能力大大下降。如果農桿菌中的目的基因已經丟失，則無法用于轉化。因此制備純度高、生長旺盛、侵染能力強的農桿菌侵染液是轉化的關鍵。這種侵染菌液也稱為工程菌液。農桿菌的培養可分為固體平板培養和液體振蕩培養固體培養一般需要2 3天，液體培養生長更快，一般需要I 2天。農桿菌接種在液體培養基后，并不立即開始增殖。一般需I 2小時才開始分裂。當生長開始后，細菌數目以一恒定的指數速率倍增，直至培養基成分改變和供養缺乏時才停止增殖。當細菌增長速率達到對數指數時稱之為對數生長狀態。研究表明，處于對數生長狀態的農桿菌侵染能力最強。具體步驟如下:
I)將-70°C保存的帶有35S:GUS基因(用于轉化檢測)和NPT-1I基因(用于篩選)EHA105菌液在冰上融化，用接種環蘸取少量菌液，接種到含有適量抗生素(卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L)的LB培養基上，將其置于28°C恒溫培養箱中培養。2)待其長出單菌落后，用接種環挑取單菌落，接種到含有適量抗生素的LB培養基上，再活化一次，然后將其置于28°C恒溫培養箱中培養。
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3)待其長出單菌落后，用滅過菌的槍頭挑取單菌落接種到含有IOmL加有適量抗生素的LB液體培養基的三角瓶中，28°C、220r/min振蕩培養。4)約20h后，吸取2mL菌液，接種到含有50mL加有適量抗生素的LB液體培養基的三角瓶中，28°C、280r/min振蕩培養至OD6tltl為0.6-0.8。5)待農桿菌培養到OD6tltl為0.6-0.8時，取25mL菌液于50mL離心管中，于5000r/min,4°C離心IOmin,去除上清,收集菌體。6)用雜交鵝掌楸Ml3液體繼代培養基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右。實施例3侵染。所謂侵染就是把工程菌接種到受體材料表面，方法就是將制備好的農桿菌菌液加入受體材料培養液中，浸泡一定時間后，進行共培養。在侵染過程中要掌握侵染時間，有助于減少后期培養過程中可能造成的污染，并可減輕細菌對植物的毒害作用。浸染時間太短，不能使足夠多的農桿菌附著于外植體傷口處，從而降低遺傳轉化的頻率。浸染時間過長，容易引起外植體的過敏反應，同時在后繼培養過程中可能造成農桿菌污染，最終導致外植體褐化死亡。具體操作如下:
將菌液(實施例2)搖勻，吸取3mL菌液加到繼代3天的雜交鵝掌楸懸浮細胞(實施例1)中，并加入乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L。靜置l-3min后,置于23°C,95r/min的恒溫搖床繼續振蕩培養，即共培養。接種菌體后的外植體在細胞分裂、生長的同時，農桿菌在外植體切口面也增殖生長，該兩者共同培養的過程稱為共培養。農桿菌和外植體共培養是整個轉化過程中非常重要的環節，因為農桿菌附著，T-DNA的轉移及整合都在這共培養時期內完成，因此共培養技術條件的掌握是轉化的關鍵。研究表明，農桿菌轉化時，并不“侵入”到植物細胞中去，而是把T-DNA轉移到植物細胞。農桿菌附著后不能立即轉化，只有在創傷部位生存16h之后的菌株才能誘發腫瘤，這一段時間稱為“細胞調節期”。因此，共培養時間必須長于16h。共培養時間太長，由于農桿菌的過度生長，植物細胞因受到毒害而死亡。實施例4脫菌培養。與農桿菌共培 養一段時間后的外植體表面及淺層組織中共生有大量的農桿菌，為殺死和抑制農桿菌的生長必須進行脫菌培養，使外植體更好地生長發育。所謂脫菌培養即把共培養后的植物材料轉移到含有抗生素的培養基上。常用的抗生素有羧芐青霉素、頭孢霉素及羧噻吩青霉素。具體操作如下:
I)將實施例3共培養約36h后的雜交鵝掌楸懸浮細胞經400目及150目的篩子過篩，待液體漏完，用50mL Z36雜交鵝掌楸單細胞培養基將400目的篩子上的單細胞反沖到250mL三角瓶中，置于23°C，95r/min的恒溫搖床振蕩培養。2)單細胞培養36h后，再用400目的篩子過篩一次，并用50mL加有頭孢霉素500mg/L的雜交鵝掌楸單細胞培養基將篩子上的單細胞反沖回三角瓶中。并將單細胞以2mL每皿的濃度鋪平板，培養基為加有頭孢霉素500mg/L。約21天繼代一次。3)繼代一次后，可以觀察到子葉胚。實施例5篩選培養。(I)待體子葉胚成熟，并長到2cm左右，將其挑出，轉到MS基本培養基上生長，其中加有頭孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。(2)約21天后更換一次培養基。一般繼代2次后，就可以用于移栽。選擇轉化的細胞也是轉化過程中的一個重要環節。選擇抗生素加入選擇培養基后，對細胞的生長產生一種選擇作用，稱之為選擇壓。本實驗中選擇標記基因用的是NPT-1I (新霉素磷酸轉移酶)。表達NPT-1I基因的細胞表現出對抗生素卡那霉素的抗性。因此本實施例中用卡那霉素作為選擇壓。按照選擇壓加入的時期不同，可以分為三種，即前期選擇、延遲選擇和后期選擇。前期選擇是外植體共培養后，在轉入愈傷組織或不定芽誘導的一開始就加入選擇壓，即先選擇后再生；后期選擇即先再生后選擇。由于未轉化的細胞在含選擇壓的培養基上不能生長，轉化細胞生長能力太弱亦難于生長形成轉化體；而在無選擇壓培養基中非轉化細胞同樣能生長，并對轉化細胞有滋養作用，從而有利于轉化細胞的生長，因此本實驗選用后期選擇。實施例6⑶S細胞學檢測
⑶S基因存在于某些細菌體內，編碼β -葡萄糖苷酸酶(β -glucuronidase,⑶S)，該酶是一種水解酶，能催化許多β_葡萄糖苷酯類物質的水解。絕大多數植物細胞內不存在內源的GUS活性，因而GUS基因被廣泛用作轉基因植物的報告基因。使用細胞學檢測⑶S基因是通過X-Gluc為底物，通過顯色反應直接觀察到組織器官中GUS基因的活性。該方法不用將酶從組織中提取出來，而是使底物進入被測的植物組織、細胞或原生質體之中。將被檢測的材料浸泡在含有底物的緩沖液中保溫，若材料成功發生了⑶S基因轉化，表達出⑶S，在適宜條件下該酶可將X-Gluc水解生成藍色物質，可用肉眼或在顯微鏡下觀察到。
取植株長約2cm的體胚苗為GUS染色材料。將準備好的體胚苗浸泡在染液中，于37°C保溫2h至過夜。⑶S染液配方:
Cl) 50mmol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH7.0):A液:稱取NaH2PO4.2H20 3.12g溶于無菌水，定容至100ml。B液:稱取NaH2PO4.12H20 7.17g溶于無菌水，定容至100ml。取39ml A液與61ml B液混合。(2)染色液:7.1ml 50mmol/L 憐酸鈉緩沖溶液,0.2ml 10mmol/T, Na2EDTA,0.2ml5mmol/L K4 [Fe (CN)6], 0.2ml K3 [Fe (CN)6]，0.05ml 0.05% (v/v)Triton-100, 2ml 20% 甲酉享,0.25ml 0.5mg/ml X-Gluc0 配制 IOmlGUS 染液備用。以⑶S基因為報告基因，通過細胞學方法檢測⑶S基因的瞬間表達、長期表達、通過分子生物學方法檢測等確定外源基因的高效轉化。肉眼或顯微鏡下觀察，材料中的藍色即為⑶S表達位點。如圖2所示，左圖是對照樣，右圖是⑶S轉化體胚苗。可見，外源基因已被高效轉化。實施例7
通過CTAB法，分別提取未經轉化的雜交鵝掌楸植株DNA、經帶有GUS標記基因侵染的雜交鵝掌楸植株DNA、根癌農桿菌質粒DNA，用質粒DNA作為正對照，未經轉化的植株DNA作為負對照，用無菌水代替模板DNA為陰性對照，對轉基因植株進行PCR檢測。從PCR結果的電泳圖譜上可以看出，泳道I為Marker,泳道2為質粒DNA,泳道3為未經轉化植株DNA,泳道4為水，泳道5至泳道34為經農桿菌侵染植株DNA。由圖3顯示，泳道9、12、13、16、18、19、20、21、22、23、24、25、28、29、30、32、33、34都出現了目的條帶，即初步檢測60%的經農桿菌侵染的植株中可以檢測到GUS基因，研究結果進一步表明GUS基因整合進轉化植株的基因組。按常規方法提取帶有GUS標記基因侵染的雜交鵝掌楸植株的RNA，反轉錄成cDNA后，利用⑶S基因的特異引物進行PC R反應，檢測上述基因組PCR反應陽性的植株中⑶S基因的表達情況，RT-PCR的結果表明(圖4)，⑶S基因不僅成功整合進基因組、并且在轉錄水平進行了表達。由以上細胞學和分子生物學的研究結果可以看出，以胚性細胞為受體、通過體細胞胚胎發生方式實現植株再生的雜交鵝掌楸遺傳轉化體系已經建立起來。
權利要求
1.一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)雜交鵝掌楸轉化受體的建立:取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細胞，接入含有雜交鵝掌楸M13液體培養基的三角瓶中，23°C，95r/min的恒溫搖床振蕩培養；每7天繼代一次，繼代3次后建立出懸浮細胞系，即為雜交鵝掌楸轉化受體； (2)農桿菌制備:先活化EHA105單菌落，在含有卡那霉素50mg/L、鏈霉素30mg/L的LB液體培養基中，28°C，280r/min振蕩培養至0D_為0.6-0.8，4°C離心收集菌體，用雜交鵝掌楸M13液體繼代培養基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右； (3)侵染:取3ml菌液加到雜交鵝掌楸轉化受體中，并加入乙酰丁香酮lOOymol/L； 靜置l_3min后，置于23°C、95r/min的恒溫搖床中，繼續振蕩培養16 40h ； (4)脫菌培養:將雜交鵝掌楸懸浮細胞經400目及150目的篩子過篩，用Z36雜交鵝掌楸單細胞培養基將400目 的篩子上的單細胞懸浮，置于23°C、95r/min的恒溫搖床，振蕩培養36h后，再用400目的篩子過篩一次，并用加有頭孢霉素500mg/L的Z36雜交鵝掌楸單細胞培養基將400目篩子上的單細胞收集；并將單細胞以2mL每皿的濃度鋪平板，培養基加頭孢霉素500mg/L，約21天繼代一次；繼代一次后，可以觀察到子葉胚； (5)篩選培養:待子葉胚成熟，長到2cm左右，將其挑出，轉到MS基本培養基上生長，其中加有頭孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。
2.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，其特征在于:步驟(I)中，取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細胞5mL，將其接種到250mL的三角瓶中，并在瓶壁輕輕敲散；量取50mL雜交鵝掌楸M13液體培養基加入三角瓶中，將材料置于23°C，95r/min的恒溫搖床振蕩培養。
3.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，其特征在于:步驟(2)中，農桿菌制備，具體操作為: 1)將_70°C保存的EHA105菌液在冰上融化，用接種環蘸取少量菌液，接種到含有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB培養基上，將其置于28°C恒溫培養箱中培養； 2)待其長出單菌落后，用接種環挑取單菌落，接種到含有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB培養基上,再活化一次,然后將其置于28°C恒溫培養箱中培養； 3)待其長出單菌落后，用滅過菌的槍頭挑取單菌落接種到含有IOmL加有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB液體培養基的三角瓶中，28°C、220r/min振蕩培養； 4)約20h后，吸取2mL菌液，接種到含有50mL加有適量抗生素的LB液體培養基的三角瓶中，28°C、280r/min 振蕩培養至 OD600 為 0.6-0.8 ； 5)待農桿菌培養到OD6tltl為0.6-0.8時，取25mL菌液于50mL離心管中，于5000r/min，4°C離心IOmin,去除上清,收集菌體； 6)用雜交鵝掌楸液體繼代培養基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0D_為0.5。
4.根據權利要求1或3所述的雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，其特征在于:所述的EHA105帶有35S KUS基因和NPT-1I基因。
5.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，其特征在于:步驟(3)中，共培養36 40h。
6.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，其特征在于:步驟(5)中，每21天繼代一次，繼代2次后，就可用于移栽。
全文摘要
本發明公開了一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉化方法，包括雜交鵝掌楸轉化受體的建立、農桿菌制備、侵染、脫菌培養和篩選培養。本發明以雜交鵝掌楸懸浮培養的單細胞作為遺傳轉化受體系統，通過農桿菌介導的方法，以GUS基因為報告基因，通過細胞學方法檢測GUS基因的瞬間表達、長期表達、通過分子生物學方法檢測等確定外源基因的高效轉化。本發明采用雜交鵝掌楸單細胞起源的體細胞胚胎發生體系，有利于外源基因的導入，并降低了嵌合體的產生。
文檔編號A01H5/00GK103088059SQ201310037010
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月31日 優先權日2013年1月31日
發明者陳金慧, 王丹, 施季森, 成鐵龍, 王鵬凱 申請人:南京林業大學