一種大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導方法
【專利摘要】本發明涉及染色體操作技術，具體說是一種大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導方法。選擇性成熟的大菱鲆親魚，分別收集精液和卵，待用；取上述精液與卵子按體積比1:100-200比例進行授精，作為對照組；待對照組人工受精15~25min后，將上述采集的精液與卵子按體積比1:100-200比例進行授精，作為誘導組；以對照組70~80%受精卵出現第一次卵裂痕的時間作為誘導組受精卵出現第一次卵裂痕的時間，在誘導組第一次卵裂痕出現前10~20min，將誘導組受精卵置于靜水壓機加壓容器內，在60~70MPa靜水壓下進行壓力休克處理，處理6~8min后泄壓，取出受精卵，置于海水中繼續培育；而后在原腸胚期和魚苗期測定四倍體率。采用本方法得到的四倍體率最高達90%，可高效、穩定地誘導獲得大菱鲆四倍體魚苗。
【專利說明】一種大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及染色體操作技術，具體地說是一種利用靜水壓力抑制受精卵卵裂的原理，批量誘導大菱鲆四倍體魚苗的方法。
【背景技術】
[0002]大菱鲆(Scophthalmusmaximus)屬于菱鲆科(Scophthalmidae)、菱鲆屬(Scophthalmus),其生長快，目前已經成為我國北方主要的海水養殖品種,養殖工藝和產業鏈也相對完善。但是，近年來大菱鲆養殖業由于累代養殖和近親交配，造成種質嚴重退化。因此采取有效方法，對大菱鲆進行遺傳改良，從根本上解決大菱鲆養殖產業良種化問題已成當務之急。多倍體因其周期短、見效快和安全性高等特點，一直受到研究者和養殖業者的關注。其中，三倍體魚具有三套染色體，往往是不育的。不育三倍體生物將用于繁殖的能量轉化到生長方面，表現出生長快、個體大、抗逆性強的特點，具有較高的經濟價值。所以，三倍體的人工誘導和培育將會是大菱鲆良種培育不可缺少的有效途徑。但魚類三倍體人工誘導一般采用溫度休克或者靜水壓等方法抑制受精卵第二極體排放的方式獲得，且每代均需人工受精并進行誘導，操作步驟相對繁瑣；人工受精和誘導也對受精卵有刺激作用，造成受精率和孵化率偏低，從而影響了其生產推廣。而如果誘導獲得了四倍體大菱鲆，則可通過四倍體與二倍體雜交的方式，一勞永逸進行三倍體育種。因此，開展大菱鲆四倍體誘導和培育研究，對于大菱鲆良種培育及其養殖業健康可持續發展是非常必要的；同時，也可以為其他魚類四倍體人工誘導方法的優化提供有益參考。
[0003]人工誘導海水魚類四倍體常采用靜水壓或溫度休克抑制卵裂獲得，由于溫度休克特別是冷休克處理時間較長，對受精卵刺激較大，休克溫度也不易保持穩定，誘導四倍體的效率以及成活率往往較低。而靜水壓法處理時間較短，對受精卵的刺激相對較小，更容易生產應用。靜水壓法誘導的成功率主要受處理時刻(處理起始的時間)、處理壓力和處理時間(處理延續的時間)三個因素的影響，其中處理時刻是起決定作用的因素。因此，準確的確定處理時刻是魚類四倍體誘導成功與否，以及能否獲得較高誘導率的關鍵。目前，人工誘導四倍體在魚類尤其是純海水魚類中應用還幾乎沒有。鲆鰈魚類中僅在半滑舌鰨、牙鲆等中有過一些嘗試性的研究，而在大菱鲆中尚未見報道。由于不同魚種最適的處理條件往往會有很大的差別，因此，對大菱鲆四倍體誘導條件進行優化和明確是十分重要的。
【發明內容】
[0004]針對以往四倍體誘導實驗中處理時刻無法準確確定而影響誘導效率的情況，本發明目的在于提供一種大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導方法。
[0005]為實現上述目的，本發明采用技術方案為:
[0006]一種大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導方法，
[0007]I)大菱鲆人工受精:
[0008] 選擇性成熟的大菱鲆親魚，分別收集精液和卵，待用；[0009]取上述少量精液，用少許新鮮海水激活后，迅速與卵子按體積比1:100-200混合均勻，隨后補入卵子體積1-5倍量的新鮮海水進行授精，授精后將受精卵用新鮮海水沖洗干凈，置于卵子體積5-10倍量的新鮮海水中培育，培育期間再補入卵子體積10-15倍量的新鮮海水，作為對照組；
[0010]待對照組人工受精15~_25min后，將上述采集的剩余精液，用少許新鮮海水激活后，迅速與卵子按體積比1:100-200混合均勻，隨后補入卵子體積1-5倍量的新鮮海水進行授精，授精后將受精卵用新鮮海水沖洗干凈，置于卵子體積5-10倍量的新鮮海水中培育，培育期間再補入卵子體積10-15倍量的新鮮海水，作為誘導組；
[0011]2)染色體誘導加倍
[0012]以對照組70-80%受精卵出現第一次卵裂痕的時間作為誘導組受精卵出現第一次卵裂痕的時間，在誘導組第一次卵裂痕出現前10-20min，將步驟I)誘導組受精卵置于靜水壓機加壓容器內，在60-70MPa靜水壓下進行壓力休克處理，處理6_8min后泄壓，取出受精卵，置于海水中繼續培育；
[0013]3)原腸胚和魚苗四倍體率的測定:將誘導組的原腸胚進行染色體的倍性鑒定，并對孵化出的魚苗進行流式細胞儀DNA含量的倍性鑒定，獲得大菱鲆原腸胚期和魚苗期四倍體率。
[0014]所述步驟I)和步驟2)中受精時期、孵育時期以及誘導時期三個時期所用海水的溫度為13-18°C之間任意恒定的適宜大菱鲆卵生長所需水溫；其中三個時期所用的海水溫度應保持一致，且溫差在±0.1°C以內。
[0015]所述將步驟I)誘 導組受精卵置于靜水壓機加壓容器內的時間為誘導組處理前Imin左右。
[0016]本發明的優點和積極效果如下:
[0017]1.本發明改進了海水魚類現有四倍體誘導中處理時刻的確定方法。靜水壓誘導魚類四倍體是通過抑制受精卵卵裂使受精卵染色體加倍的，其處理時刻一般在第一次卵裂前，以往處理時刻的確定是根據受精時間計算的。以大菱鲆為例，其受精卵較適培育溫度為13-18°C，其中在13-14°C海水培育時，大菱鲆受精卵第一次卵裂時間為130_150min ；在15-16°C時，其第一次卵裂時間為95-110min ;在17-18 °C時，第一次卵裂時間則為60-70min。所以，在培育過程中，即使細微的水溫變化，也會使大菱鲆受精卵卵裂時間明顯提前或延后。15 ± 0.1°C海水培育時其處理時刻在受精后80-90min ;水溫下降1°C，大菱鲆受精卵第一次卵裂痕出現時間會延后IOmin以上，此時處理時刻應該是受精后90-100min，若仍按原來的處理時刻進行處理，則受精卵還未發育到預期程度就開始被處理；同理，若該期間水溫升高而處理時刻不變，則受精卵將發育超過預期程度才開始被處理，這都直接影響了誘導效率，并導致誘導組孵化率降低。本發明根據提前15_25min受精的對照組受精卵第一次卵裂痕出現時間來確定誘導組處理時刻，在誘導組受精卵第一次卵裂痕出現前10-20min開始處理，間隔時間只有10_20min，大大短于按照受精時間計算處理時刻時80-90min的間隔時間，受到水溫、氣溫等外界環境變化的影響較小。而且，受精卵的卵裂痕也很容易在解剖鏡下觀察到。
[0018]2.以往鲆鰈魚類四倍體誘導方法中，孵育水溫常是一個溫度范圍，如15_17°C，19-23°C等。如前文所述，即使細微的水溫變化也會對受精卵的發育時序造成很大的影響，如此進行誘導，則無法準確確定處理時刻，使得誘導效果不穩定，重復性較差。而本發明充分考慮到水溫會導致受精卵卵裂時間的變化，根據大菱鲆受精卵較適培育溫度(13-18°C )，將處理前的培育水溫固定在15±0.TC或其它特定的適宜溫度下，使誘導組受精卵卵裂時間基本保持一致，誘導條件更加穩定，使其誘導率具有較好的重復性。
[0019]3.不同的鲆鰈魚種中，最適的四倍體誘導條件往往會有很大的差別，以往國內外報道中，均未涉及大菱鲆四倍體誘導的相關參數。本發明首次對大菱鲆四倍體誘導的參數進行篩選優化，在保證處理時刻穩定的基礎上，對處理壓力強度和處理時間進行了優化，確定了最佳的處理參數范圍；并按照本發明的操作過程可快速穩定的，得到大批量大菱鲆四倍體魚苗，進而通過誘導獲得的四倍體大菱鲆與二倍體雜交的方式，一勞永逸的進行三倍體育種，由此得到生長快、個體大、抗逆性強等特點的苗種。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1A為本發明實施例提供的原腸胚期大菱鲆四倍體誘導效果染色體中期分裂相的檢測結果圖，其中左為二倍體，右為四倍體。
[0021]圖1B為本發明實施例提供的魚苗期大菱鲆四倍體誘導效果流式細胞儀檢測結果圖，其中左為二倍體，右為四倍體。
[0022]圖2A、B、C分別為大菱鲆四倍體批量誘導組發育情況圖，其中A為原腸胚，B為初孵仔魚和C為46天魚苗。
【具體實施方式】
[0023]本發明對目前的海水魚類四倍體人工誘導方法進行了優化，可更加準確的確定誘導的處理時刻，提高了誘導的穩定性，能夠得到高比率的大菱鲆四倍體魚苗，為生產和進一步的實驗研究提供了材料和技術支持。
[0024]下面結合實施例詳述本發明。
[0025]實施例1
[0026]本實施例受精時期、孵育時期以及誘導時期，三個時期所用海水溫度為恒定的適宜大菱鲆卵受精及孵化的水溫，即受精時期、孵育時期以及誘導時期三個時期海水溫度均為 14.5±0.10Co
[0027]I)配子的采集
[0028]選取處于產卵產精盛期待產的親魚輕輕平放在軟墊上，拭去其體表及生殖孔周圍的水和污物，然后自后向前緩緩擠壓，精卵分別擠入燒杯或者盆中備用。解剖鏡下觀察其卵呈圓球形，透明、油球集中、卵徑適中、大小均一；其精液呈乳白色，濃度適宜，顯微鏡下加適量海水激活后精子活力高、游動時間長。
[0029]2)人工受精
[0030]對照組人工受精:
[0031]取0.1mL精液，用少許海水激活后，迅速倒入IOmL卵中，輕輕攪動使其混勻，再補充約IOmL海水。受精5min后，用新鮮海水反復沖洗數次以去掉多余精液，而后將受精卵放入盛有約50mL新鮮海水的容器中待用，并在期間補充約IOOmL同溫新鮮海水。
[0032]批量誘導組人工受精:[0033]在對照組人工受精25min后，取1.5mL同批采集的精液，用少許海水激活后，迅速倒入150mL同批采集的卵中，輕輕攪動使其混勻。再補充約150mL海水，受精5min后，用新鮮海水反復沖洗數次以去掉多余精液，而后將受精卵放入盛有約800mL新鮮海水的容器中待用，并在期間補充約1500mL同溫新鮮海水。
[0034]3)處理時刻的確定
[0035]人工受精后，用解剖鏡隨時觀察對照組及誘導組的受精卵發育情況。發現對照組受精后103min時，70-80%受精卵剛剛開始出現第一次卵裂痕，記錄為誘導組的第一次卵裂痕時間，
[0036]此時批量誘導組的處理時刻為第一次卵裂痕出現前20min，即受精后83min。
[0037]4)大菱鲆四倍體的誘導
[0038]在處理前Imin (受精后82min)左右時，將大菱鲆受精卵連海水轉移至靜水壓機加壓容器內，即將達到處理時刻時迅速將壓力升至60MPa，處理Smin后泄壓，取出受精卵，置于同溫海水中繼續培育。
[0039]5)受精率、孵化率的計算及倍性鑒定
[0040]受精率為發育到囊胚期卵數占全部上浮卵數的百分數；孵化率為初孵仔魚數占全部上浮卵數的百分數。
[0041]取原腸胚進行染色體制片，計數其染色體數目，通過與二倍體對比確定是否為四倍體，大菱鲆二倍體染色體數2n=44，四倍體染色體數則為4n=88，由此計算四倍體比例；取初孵仔魚及孵化后不同發育階段的魚苗，利用流式細胞儀測定其DNA含量，通過與二倍體對比確定是否為四倍體，并計算其四倍體比例(參見圖1)。
[0042]本實施例中，批量誘導組共獲得初孵仔魚約11300尾，受精率為41.7%，孵化率為
11.3%，原腸胚期四倍體率為80%，初孵仔魚期四倍體率為74%。
[0043]實施例2
[0044]本實施例受精時期、孵育時期以及誘導時期，三個時期所用海水溫度為恒定的適宜大菱鲆卵受精及孵化的水溫，即受精時期、孵育時期以及誘導時期三個時期海水溫度均為 15.0±0.1°C。
[0045]I)配子的采集
[0046]選取處于產卵產精盛期待產的親魚輕輕平放在軟墊上，拭去其體表及生殖孔周圍的水和污物，然后自后向前緩緩擠壓，精卵分別擠入燒杯或者盆中備用。解剖鏡下觀察其卵呈圓球形、透明、油球集中、卵徑適中、大小均一；其精液呈乳白色，濃度適宜，顯微鏡下加適量海水激活后精子活力高、游動時間長。
[0047]2)人工受精
[0048]對照組人工受精:
[0049]取0.1mL精液，用少許海水激活后，迅速倒入15mL卵中，輕輕攪動使其混勻，再補充約30mL海水。受精5m in后，用新鮮海水反復沖洗數次以去掉多余精液，而后將受精卵放入盛有約IOOmL新鮮海水的容器中待用，并在期間補充約200mL同溫新鮮海水。
[0050]批量誘導組人工受精:
[0051]在對照組人工受精20min后，取與對照組同批精卵進行受精、洗卵和孵育，精卵比例和方法同對照組。[0052]3)處理時刻的確定
[0053]人工受精后，用解剖鏡隨時觀察對照組及誘導組的受精卵發育情況。發現對照組受精后95min時，70-80%受精卵剛剛開始出現第一次卵裂痕，記錄為第一次卵裂時間，
[0054]此時批量誘導組的處理時刻為第一次卵裂痕出現前15min，即受精后80min。
[0055]4)大菱鲆四倍體的誘導
[0056]在處理前Imin (受精后79min)左右時，將大菱鲆受精卵連海水轉移至靜水壓機加壓容器內，即將達到處理時刻時迅速將壓力升至67.5MPa，處理7min后泄壓，取出受精卵，置于同溫海水中繼續培育。
[0057]5)受精率、孵化率的計算及倍性鑒定
[0058]受精率為發育到囊胚期卵數占全部上浮卵數的百分數；孵化率為初孵仔魚數占全部上浮卵數的百分數。
[0059]取原腸胚進行染色體制片，計數其染色體數目，通過與二倍體對比確定是否為四倍體，大菱鲆二倍體染色體數2n=44，四倍體染色體數則為4n=88，由此計算四倍體比例；取初孵仔魚及孵化后不同發育階段的魚苗，利用流式細胞儀測定其DNA含量，通過與二倍體對比確定是否為四倍體，并計算其四倍體比例。
[0060]本實施例中，批量誘導組共獲得初孵仔魚約50700尾，受精率為65.0%，孵化率為33.8%，原腸胚期四倍體率為85%，初孵仔魚期四倍體率為88% (參見圖2)。
[0061]實施例3
[0062]本實施例受精時期、孵育時期以及誘導時期，三個時期所用海水溫度為恒定的適宜大菱鲆卵受精及孵化的水溫，即受精時期、孵育時期以及誘導時期三個時期海水溫度均為 15.5±0.1°C。
[0063]I)配子的采集
[0064]選取處于產卵產精盛期待產的親魚輕輕平放在軟墊上，拭去其體表及生殖孔周圍的水和污物，然后自后向前緩緩擠壓，精卵分別擠入燒杯或者盆中備用。解剖鏡下觀察其卵呈圓球形、透明、油球集中、卵徑適中、大小均一；其精液呈乳白色，濃度適宜，顯微鏡下加適量海水激活后精子活力高、游動時間長。
[0065]2)人工受精
[0066]對照組人工受精:
[0067]取0.15mL精液，用少許海水激活后，迅速倒入30mL卵中，輕輕攪動使其混勻，再補充約120mL海水。受精5min后，用新鮮海水反復沖洗數次以去掉多余精液，而后將受精卵放入盛有約300mL新鮮海水的容器中待用，并在期間補充約400mL同溫新鮮海水。
[0068]批量誘導組人工受精:
[0069]在對照組人工受精15min后，取與對照組同批精卵進行受精、洗卵和孵育，精卵比例和方法同對照組。
[0070] 3)處理時刻的確定
[0071]人工受精后，用解剖鏡隨時觀察對照組及誘導組的受精卵發育情況。發現對照組受精后88min時，70-80%受精卵剛剛開始出現第一次卵裂痕，記錄為第一次卵裂時間。
[0072]此時批量誘導組處理時刻為第一次卵裂痕出現前lOmin，即受精后78min。
[0073]4)大菱鲆四倍體的誘導[0074]在處理前Imin (受精后77min)左右時，將大菱鲆受精卵連海水轉移至靜水壓機加壓容器內，即將達到處理時刻時迅速將壓力升至70MPa，處理6min后泄壓，取出受精卵，置于同溫海水中繼續培育。
[0075]5)受精率、孵化率的計算及倍性鑒定
[0076]受精率為發育到囊胚期卵數占全部上浮卵數的百分數；孵化率為初孵仔魚數占全部上浮卵數的百分數。
[0077]取原腸胚進行染色體制片，計數其染色體數目，通過與二倍體對比確定是否為四倍體，大菱鲆二倍體染色體數2n=44，四倍體則為4n=88，由此計算四倍體比例；取初孵仔魚及孵化后不同發育階段的魚苗，利用流式細胞儀測定其DNA含量，通過與二倍體對比確定是否為四倍體，并計算其四倍體比例。
[0078]本實施例中，批量誘導組共獲得初孵仔魚約35000尾，受精率為60.5%，孵化率為
17.5%，原腸胚期四倍體率為90%，初孵仔魚期四倍體率為88%。
[0079]由上述結果表明，本發明操作過程簡單快速，結果穩定、重復性好，可用于大菱鲆四倍體魚苗的批量化誘導生產。進而通過誘導獲得的四倍體大菱鲆與二倍體雜交的方式，一勞永逸的進行 三倍體育種。由此得到生長快、個體大、抗逆性強等特點的苗種。
【權利要求】
1.一種大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導方法，其特征在于: 1)大菱鲆人工受精: 選擇性成熟的大菱鲆親魚，分別收集精液和卵，待用； 取上述精液與卵子按體積比1:100-200比例進行授精，作為對照組； 待對照組人工受精15~25min后，將上述采集的精液與卵子按體積比1:100-200比例進行授精，作為誘導組； 2)染色體誘導加倍 以對照組70-80%受精卵出現第一次卵裂痕的時間作為誘導組受精卵出現第一次卵裂痕的時間，在誘導組第一次卵裂痕出現前l(T20min，將步驟I)誘導組受精卵置于靜水壓機加壓容器內，在6(T70MPa靜水壓下進行壓力休克處理，處理6~8min后泄壓，取出受精卵，置于海水中繼續培育；而后在原腸胚期和魚苗期測定四倍體率。
2.按權利要求1所述的大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導方法，其特征在于:所述步驟I)和步驟2)中受精時期、孵育時期以及誘導時期三個時期所用海水的溫度為恒定的適宜大菱鲆卵生長所需水溫。
3.按權利要求2所述的大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導方法，其特征在于:所述步驟I)和步驟2)中受精時期、孵育時期以及誘導時期，三個時期之間海水溫度的溫差在±0.1°C。
4.按權利要求1所述的大菱鲆四倍體魚苗的批量誘導方法，其特征在于:所述將步驟I)誘導組受精卵置于靜水壓機加壓容器內的時間為誘導組處理前Imin左右。
【文檔編號】A01K61/00GK103960175SQ201310039710
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月31日 優先權日:2013年1月31日
【發明者】尤鋒, 吳志昊, 胡金偉, 馬得友, 譚訓剛, 張培軍 申請人:中國科學院海洋研究所