利用rna干擾技術誘導凡納濱對蝦血淋巴細胞發生upr的方法
【專利摘要】本發明提供了一種利用RNA干擾技術誘導凡納濱對蝦血淋巴細胞產生UPR的方法，其包括如下步驟：(1)根據凡納濱對蝦Bip基因的cDNA序列，合成序列特異性的dsLvBip；(2)稀釋dsLvBip，控制注射體積為50μL，按1μg/g對蝦的劑量向凡納濱對蝦注射dsLvBip。本發明的方法能夠簡便、快捷、高效、特異性地誘發凡納濱對蝦血淋巴細胞發生非折疊蛋白反應。
【專利說明】利用RNA干擾技術誘導凡納濱對蝦血淋巴細胞發生UPR的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學RNA干擾技術與運用領域，具體涉及利用RNA干擾技術對凡納濱對蝦Bip基因敲降誘發血淋巴細胞發生UPR的方法。
【背景技術】
[0002]海洋無脊椎動物對好屬中的對好(Litopenaeus vannamei)是我國水產養殖的重要種類。2013年，全球養殖對蝦產量達330萬噸，其中，我國養殖對蝦產量為130萬噸，為世界對好養殖第一大國。我國主要養殖凡納濱對好(Litopenaeus vannamei)、斑節對蟲下(Penaeus monodon)、中國明對蟲下(Fenneropenaeus chinensis)和日本囊對蟲下(Marsupenaeus japonicus)4種對好，其中凡納濱對蟲下是主要養殖種類，在全國沿海11個省市均有養殖，約占養殖對蝦總產量90%。
[0003]隨著養殖規模的不斷擴大及養殖環境的惡化，對蝦病害嚴重，給對蝦養殖業造成嚴重損失。其中以對蟲下白斑綜合癥(white spot syndrome, WSS)和肝胰腺壞死病(hepatopancreatic necrosis syndrome, HPNS)等所引起的損失尤為嚴重。如 1993 ?1995年間，我國90%對蝦養殖池塘發生了 WSS，導致我國養殖對蝦由1992年的22萬噸下降到1994年的5.3萬噸，年直接經濟損失超過30億元。。肝胰腺壞死病則是最近幾年來新出現的危害全球對蝦養殖業的病害，2013年這兩種蝦病的暴發使整個東南亞的養殖對蝦產量下降40%左右。
[0004]凡納濱對蝦病害發生的直接原因為病原體感染，如WSSV或副溶血弧菌的感染，然而種種跡象表明環境脅迫在這些疾病的暴發過程中扮演重要的角色。WSS在春夏、夏秋之交這些氣候環境變化較大的時期容易暴發。天氣悶熱、寒潮、連續陰天、暴雨、池中浮游藻類死亡和水質變化等均可誘發WSS的暴發。天氣劇烈變化、水質富營養化情況下對蝦免疫力下降和蝦塘水體中條件性致病細菌的迅速增殖則被認為是導致對蝦偷死病暴發的原因之一。
[0005]水體各種理化因子(包括病原生物的種類和數量)的急劇變化對對蝦而言是種脅迫，稱為環境脅迫。環境脅迫影響到對蝦的免疫系統功能，而其分子機制仍不得而知。已知環境脅迫會干擾真核生物細胞內的蛋白質折疊過程，造成未折疊的蛋白或錯誤折疊的蛋白大量滯留于內質網腔內，形成內質網應激[(endoplasmic reticulumstress, ER) -stress]，影響真核細胞的正常的生理過程。為緩解ER-stress，真核細胞會活化UPR、內質網介導的蛋白質降解(ER-associated degradat1n, ERAD)通路和媽離子通路。UPR在這一系列反應中處于核心地位。UPR包含IRE1-XBP1通路、PERK-eIF2a通路及ATF6通路這3條支路。目前對蝦中UPR三條支路的多個關鍵基因與環境脅迫間的關系已得到研宄，結果表明UPR在對蝦環境脅迫響應方面有重要功能，故其應當在凡納濱對蝦中環境脅迫響應調控免疫系統功能方面扮演重要角色。進行凡納濱對蝦UPR與免疫系統關系、UPR與病毒感染的關系、UPR與細胞周期調控的關系及UPR與物質代謝的關系等方面的研宄需要有效、快捷的凡納濱對蝦細胞UPR誘導方法，然而，至今仍未發現能在凡納濱對蝦中特異性激活UPR的方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的提供一種利用RNA干擾技術，高效、特異性地誘發凡納濱對蝦血淋巴細胞發生UPR (非折疊蛋白反應)的方法。
[0007]為實現以上目的，本發明提供了如下技術方案:
[0008]一種利用RNA干擾技術誘導凡納濱對蝦血淋巴細胞發生UPR(非折疊蛋白反應)的方法，其包括如下步驟:
[0009](I)根據凡納濱對蝦Bip基因的cDNA序列，合成序列特異性的dsLvBip ；
[0010](2)稀釋dsLvBip，控制注射體積為50yL，按I μ g/g對好的劑量向凡納濱對好注射 dsLvBip。
[0011]注射入凡納濱對蝦體內的dsLvBip誘發RNAi效應，從而特異性地降低凡納濱對蝦Bip的表達量，解除UPR的抑制狀態，而誘發血淋巴細胞產生UPR，即XBPl前體mRNA發生切害J，eIF2a磷酸化程度增強。
[0012]優選地，所述步驟(I)包括:設計合成針對dsLvBip的正向ssRNA和反向ssRNA模板的引物；通過PCR反應合成dsLvBip的正向ssRNA和反向ssRNA，然后經變性、退火形成dsLvBip。
[0013]dsLvBip的合成過程如下:設計兩對分別在正向引物或反向引物中加入T7啟動子序列(5’ GGATCCTAATACGACTCACTATAGG3’ )的特異性引物，以凡納濱對蝦cDNA為模板擴增兩份分別在5’端或是3’端帶有T7啟動子的的長度為507bp的DNA序列作為RNA合成模板。將這兩個模板分別體外反轉錄成正向ssRNA和反向ssRNA(T7 RiboMAX Express RNAiSystem, Promega, USA ；Cat.P1700)，合成的ssRNA和反向ssRNA加入到同一管子中，經高溫變性、退火形成dsLvBip。
[0014]其中，所述步驟(I)中，設計合成ssRNA和反向ssRNA的模板的兩對引物為:
[0015]DsRNA-LvBip-482-T7-Fl:
[0016]GATCCTAATACGACTCACTATAGGTGTCGGTGGTTCCACTCGTA
[0017]DsRNA-LvBip-482-Rl:CCTTGTTTCCTGTGCCCTTG
[0018]DsRNA-LvBip-482-F2:TGTCGGTGGTTCCACTCGTA
[0019]DsRNA-LvBip-482-T7-R2:
[0020]GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCCTTGTTTCCTGTGCCCTTG
[0021]其中，所述步驟(I)中，PCR反應體系加樣參數為:正反引物各I μ L，濃度為ΙΟρΜ，1Mm dNTPl μ L，10 X PCR 緩沖液 5 μ L，LA Taq 酶 I μ L，凡納濱對蝦 cDNA 模板 lOOng，以超純水補足至50 μ Lo
[0022]其中，所述步驟⑴中，PCR的運行程序參數為:94 V預變性3分鐘；然后94 °C變性30秒，58 °C退火30秒，72 V延伸30秒；重復循環35次。由此，ssRNA (DsRNA-LvBip-482-T7-Fl/DsRNA-LvBip-482-Rl)和反向 ssRNA(DsRNA-LvBip-482_F2/DsRNA-LvBip-482-T7-R2)的模板分別合成。
[0023]其中，所述步驟(I)中，正向ssRNA 和反向 ssRNA(T7 RiboMAX Express RNAiSystem)合成反應體系(20 μ L)為:Express T72XbufferlO μ L，Express T7 EnzymeMix2 μ L，DNA模板I μ g，RNase free水補足總體積至20 μ L，37°C反應4小時。
[0024]其中，所述步驟(I)中，將正向ssRNA和反向ssRNA混合，70°C水浴10分鐘，退火形成 dsLvBip。將 dsLvBip 產物用 RNAase A solut1n 及 RNase free DNase37°C水浴 30分鐘，除去反應后多余的DNA和ssRNA。將上述dsRNA產物純化，即加入4.4 μ L3M醋酸鈉(ρΗ5.2)，110 μ L無水乙醇，冰上靜置5分鐘后，16000g室溫離心10分鐘，所得沉淀即為dsLvBip,最終用100 μ L DEPC水溶解，電泳檢測并測OD值后，放置_20°C保存。
[0025]優選地，所述步驟(2)中，測量凡納濱對蝦的平均體重，稀釋合成的dsLvBip，控制注射體積為50 μ I,最終以I μ g/g對好的劑量于凡納濱對好第二腹節處刺入向血竇方向注射。
[0026]注射dsLvBip后對RNA干擾效果進行檢測:在dsRNA注射48?72小時后，分別提取注射PBS、dsGFP和dsLvBip的凡納濱對蝦的血淋巴細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA。在模板量一致的前提下，通過RT-PCR的方法擴增LvBip，并在I %的瓊脂糖凝膠上檢測對比3組樣品之間測Bip條帶的亮度，進而確定注射dsLvBip對凡納濱對好血淋巴細胞中的Bip的RNAi效果。
[0027]通過兩種方法確定敲降Bip之后凡納濱對蝦UPR狀態:⑴通過RT-PCR技術，檢測XBPl前體mRNA的檢測情況，若XBPl前體mRNA發生剪切，則說明樣品發生UPR。(2)通過western-blot技術檢測eIF2 α的磷酸化狀態，如果其發生磷酸化修飾則說明樣品發生UPR0
[0028]經檢測，本發明的方法能夠有效地誘導凡納濱對蝦血淋巴細胞發生非折疊蛋白反應。
[0029]本發明具有以下優點:
[0030](I)本發明可簡便、快捷、高效、特異性地誘發凡納濱對蝦血淋巴細胞產生UPR，所獲得的效果對后續的其他相關研宄，如凡納濱對蝦UPR對免疫系統的調控研宄提供了基礎。
[0031](2)本發明的核心是利用RNA干擾(RNAi)技術，特異性地降低凡納濱對蝦Bip基因的表達量，繼而解除其細胞中的UPR的抑制，而使得UPR被激活。可在注射dsLvBip后的48小時至72小時的時間范圍內，于凡納濱對蝦血淋巴細胞中持續誘發UPR。
[0032](3)本發明的方法可有效應用于凡納濱對蝦的環境脅迫響應研宄，為其研宄提供合適的動物模型，也用于輔助UPR與免疫系統關系、UPR與病毒感染的關系、UPR與細胞周期調控的關系及UPR與物質代謝的關系等方面的研宄。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1:注射LvBip48小時和72小時之后凡納濱對蝦血淋巴細胞中Bip基因的敲降效果。PBS組，dsGFP組為對照，每個樣品3個平行，EFl-α為內參。
[0034]圖2:注射LvBip后凡納濱對蝦血淋巴細胞中XBPl基因前體mRNA的剪切效果。dsGFP組為對照，EFl α為內參；以為注射dsLvBip的樣品利用LvXBPl引物進行擴增，出現兩條條帶即說明凡納濱對蝦XBPl的前體mRNA發生了剪切。從圖中可以看到，在注射dsLvBip后的24小時XBPl的前體mRNA即開始發生剪切，持續到注射后96小時，說明此期間UPR被激活。
[0035]圖3:注射LvBip后凡納濱對蝦血淋巴細胞中eIF2 α的磷酸化水平變化。從圖中可以看到注射dsLvBip后的48小時或72小時eIF2 α的磷酸化水平增強，說明UPR被激活。
【具體實施方式】
[0036]以下結合附圖和具體實施例，對本發明的【具體實施方式】和技術方案作進一步的詳述，應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。
[0037]實施例
[0038]首先設計合成針對dsLvBip的正向ssRNA和反向ssRNA模板的引物，通過PCR反應合成dsLvBip的ssRNA和反向ssRNA，然后經變性、退火形成dsLvBip。以I μ g/g體重的劑量于凡納濱對蝦第二腹節處注射dsLvBip。注射后的48?72小時取凡納濱對蝦血淋巴細胞樣品提取總RNA，逆轉錄為cDNA，再檢測凡納冰對蝦血淋巴細胞總Bip基因(GenBankunder access1n N0.JQ265942)干擾效果和 UPR 激活效果。
[0039]設計合成ssRNA和反向ssRNA的模板的兩對引物:
[0040]DsRNA-LvBip-482-T7-Fl:
[0041 ] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTGTCGGTGGTTCCACTCGTA
[0042]DsRNA-LvBip-482-Rl:CCTTGTTTCCTGTGCCCTTG
[0043]DsRNA-LvBip-482-F2:TGTCGGTGGTTCCACTCGTA
[0044]DsRNA-LvBip-482-T7-R2:
[0045]GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCCTTGTTTCCTGTGCCCTTG
[0046]50 μ L PCR 反應體系加樣參數:正反引物各 I μ L(1pM)，1Mm dNTPl μ L，10 X PCRbuffer5 μ L，LA Taq酶I μ L，凡納濱對蝦cDNA模板lOOng，以超純水補足至50 μ L。PCR運行程序參數:94°C預變性3分鐘；然后94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒；重復循環 35 次。ssRNA(DsRNA-LvBip-482-T7-Fl/DsRNA-LvBip-482-Rl)和反向ssRNA (DsRNA-LvBip-482-F2/DsRNA-LvBip-482-T7-R2)的模板分別合成。
[0047]SsRNA 和反向 ssRNA 合成反應體系(20 μ L)為:Express T7 2 Xbuffer 10 μ L，Express T7Enzyme Mix2 μ L，DNA 模板 I μ g，RNase free 水補足總體積至 20 μ L，37°C 反應4小時。
[0048]將正向ssRNA和反向ssRNA產物各20 μ L混合，70 °C水浴10分鐘，退火形成dsLvBip ο 于 dsLvBip 產物加入 I μ L RNAase A solut1n (1:200 稀釋)及 RNase freeDNase37°C水浴30分鐘。將上述dsRNA產物純化，即加入4.4 μ L3M醋酸鈉(pH5.2),IlOyL無水乙醇，冰上靜置5分鐘后，16000g室溫離心10分鐘，所得沉淀即為dsLvBip，最終用100 μ L DEPC水溶解，電泳檢測并測OD值后，放置_20°C保存。
[0049]DsGFP以同樣的方法合成，模板為水母綠色熒光蛋白基因，合成正向ssRNA和反向ssRNA的模板的引物為:
[0050]DsRNA-eGFP504-F:
[0051 ] GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCGACGTAAACGGCCACAAGTT
[0052]DsRNA-eGFP504-Rl:ATGGGGGTGTTCTGCTGGTAG
[0053]DsRNA-eGFP504-F2:CGACGTAAACGGCCACAAGTT
[0054]DsRNA-eGFP504-R:
[0055]GGATCCTAATACGACTCACTATAGGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAG
[0056]隨機取15條凡納濱對蝦測量實驗的凡納濱對蝦的平均體重；然后以I μ g/g對蝦的注射劑量為標準，根據好的體重適當的稀釋合成的dsLvBip，使注射體積為50 μ Lo于凡納濱對蝦第二腹節處刺入向血竇方向注射。
[0057]在dsRNA注射的不同時段分別提取注射PBS、dsGFP和dsLvBip的凡納濱對蝦的血淋巴細胞的總RNA，以等量的總RNA逆轉錄為cDNA。總RNA提取采用Rneasy Plus MiniKit (QIAGEN, Germany ；Cat.N0.74136)，RNA 逆轉錄米用 PrimeScript II 1st Strand cDNASynthesis Kit (大連寶生物，Cat.N0.D6210A)，操作過程按照產品說明書進行。
[0058]各取10ng的cDNA為模板，通過RT-PCR的方法擴增LvBip,反應體系和PCR程序如下:50yL PCR反應體系加樣參數:正反引物(SQ-LvBip-661_F:AGCCACCAGGTCAGGATTGA ；SQ-LvBip-661-R:CCTTGTTTCCTGTGCCCTTG)各 I μ L(1pM)，1Mm dNTP I μ L，10XPCRbuffer5 μ L，LA Taq酶I μ L，凡納濱對蝦cDNA模板lOOng，以超純水補足至50 μ L。PCR運行程序參數:94°C預變性3分鐘；然后94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸40秒；重復循環32次。PCR產物于1%的瓊脂糖凝膠上電泳，對比3組樣品之間測Bip條帶的亮度，檢測凡納濱對蝦血淋巴細胞中的Bip的RNAi效果(如圖1所示)。
[0059]通過兩種方法確定敲降Bip之后凡納濱對蝦UPR狀態，
[0060](I)凡納濱對蝦XBPl前體mRNA剪切情況檢測。檢測引物、PCR參數及程序如下:
[0061]檢測引物:
[0062]LvXBPu/s-F:GCCATGAATATCGGCTGTAAC
[0063]LvXBPu/s-R:TGTTGAGAGAACCATGATCCG
[0064]50 μ L PCR反應體系加樣參數:正反引物各 I μ L(1pM)，1Mm dNTP IyL, 10XPCRbuffer5 μ L，LA Taq酶I μ L，凡納濱對蝦cDNA模板lOOng，以超純水補足至50 μ L。PCR運行程序參數:94°C預變性3分鐘；然后94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸20秒；重復循環36次。PCR產物于5%的瓊脂糖凝膠上電泳，可檢測到凡納濱對蝦血淋巴細胞中的XBPl前體mRNA在dsLvBip注射24小時后開始出現兩條條帶(如圖2所示)。
[0065](2)通過 western-blot 技術利用 eIF2 α 磷酸化抗體(Phospho_eIF2a Antibody,CST，貨號:9821)檢測eIF2a的磷酸化狀態，如果其磷酸化修飾增強則說明樣品發生UPR。
[0066]凡納濱對蝦eIF2a的磷酸化狀態檢測。ImL的一次性注射器吸取300 μ L預冷的抗凝劑(lOmmol/LEDTA, 450mmol/LNaCl, 10mmol/LKCl, lOmmol/LHEPES, pH7.3)，然后插入對蝦血竇吸取血淋巴；5條凡納濱對蝦的血淋巴集于I管中，4°C 100rpm離心5分鐘收集血淋巴細胞，去除上清；以預冷PBS重懸細胞，再離心收集細胞，重復3次。之后加入200 μ L含磷酸酶抑制劑的預冷ΝΡ-40裂解液冰上裂解細胞10分鐘。之后，離心取上清，加入50 μ L5 X的蛋白質電泳上樣緩沖液，沸水浴5分鐘，然后-20°C保存備用。對照樣品同樣處理。
[0067]實驗樣品和對照樣品各取20 μ L的樣品進行SDS-PAGE電泳，分離膠濃度12% ;濕法轉膜(纖維素膜)條件為180mA，3小時。
[0068]將轉好的纖維素膜置于含5 %脫脂奶粉的TBST緩沖液(每升TBST含Tris base2.422g, Nacl8.775g，Tween200.5mL)封閉 2 小時；然后加入以含 0.1% Tween2,3% BSA 的TBST以1:1000稀釋的eIF2 α磷酸化抗體，于4°C輕柔搖動孵育過夜；之后用TBST洗滌膜3次，每次5分鐘；加入含3% BSA TBST的以1:10000稀釋的HRP偶聯二抗，室溫輕柔搖動孵育2小時；之后用TBST洗滌膜3次，每次15分鐘；然后化學發光法顯色觀察結果(如圖3所示)。如圖所示，在dsLvBip組中，磷酸化修飾增強，說明樣品發生UPR。
【權利要求】
1.一種利用RNA干擾技術誘導凡納濱對蝦血淋巴細胞產生UPR的方法，其包括如下步驟: (1)根據凡納濱對好Bip基因的cDNA序列，合成序列特異性的dsLvBip； (2)稀釋dsLvBip，控制注射體積為50μ L，按I μ g/g對好的劑量向凡納濱對好注射dsLvBip。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)包括:設計合成針對dsLvBip的正向ssRNA和反向ssRNA模板的引物；通過PCR反應合成dsLvBip的正向ssRNA和反向ssRNA，然后經變性、退火形成dsLvBip。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，設計合成ssRNA和反向ssRNA的模板的兩對引物為:
DsRNA-LvBip-482-T7-Fl:
GATCCTAATACGACTCACTATAGGTGTCGGTGGTTCCACTCGTA
DsRNA-LvBip-482-Rl:CCTTGTTTCCTGTGCCCTTG
DsRNA-LvBip-482-F2:TGTCGGTGGTTCCACTCGTA
DsRNA-LvBip-482-T7-R2:
GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCCTTGTTTCCTGTGCCCTTG。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟⑴中，PCR反應體系加樣參數為:正反引物各 I μ L，濃度為 10pM，1Mm dNTP I μ L，10 X PCR 緩沖液 5 μ L，LA Taq 酶 I μ L，凡納濱對蝦cDNA模板lOOng，以超純水補足至50 μ L。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR的運行程序參數為:94°C預變性3分鐘；然后94°C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸30秒；重復循環35次。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟⑴中，正向ssRNA和反向ssRNA(T7RiboMAX Express RNAi System)合成反應體系(20 μ L)為:Express T72Xbuffer10 μ L, Express T7Enzyme Mix 2 μ L，DNA 模板 I μ g，RNase free 水補足總體積至 20 μ L,37°C反應4小時。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，將正向ssRNA和反向ssRNA 混合，70°C水浴 10 分鐘，退火形成 dsLvBip ;將 dsLvBip 產物用 RNAase A solut1n及RNase free DNase 37°C水浴30分鐘，除去反應后多余的DNA和ssRNA ;將上述dsRNA產物純化，即加入4.4 μ L pH為5.2濃度為3M的醋酸鈉、110 μ L無水乙醇，冰上靜置5分鐘后，16000g室溫離心10分鐘，所得沉淀即為dsLvBip。
8.根據權利要求1至7任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，測量凡納濱對蝦的平均體重，稀釋合成的dsLvBip，控制注射體積為50 μ L，最終以I μ g/g對蝦的劑量于凡納濱對蝦第二腹節處刺入向血竇方向注射。
【文檔編號】C12N15/89GK104450706SQ201410756685
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月10日 優先權日:2014年12月10日
【發明者】陳義烘, 張澤芝, 翁少萍, 何建國 申請人:中山大學