專利名稱：擬南芥熱激轉錄因子基因hsfa3及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
:本發明涉及植物分子生物學與轉基因相關技術領域，具體為擬南芥熱激轉錄因子(Heat Shock Transcription Factors, HSFs)基因家族成員HSFA3抗高溫新功能的驗證，以及該基因在抗高溫植物新品種培育中的應用。
背景技術：
:溫度的變化對植物生長發育具有重要的影響，適宜的溫度能夠保證或促進植物正常的生長發育，而不適宜的溫度條件則會抑制植物的生長，甚至使植物死亡。自二十世紀以來，隨著世界人口的飛速增長及工業化程度的不斷加深，溫室效應越來越嚴重，全球溫度的逐步升高已成為作物正常生長、發育和獲得高產的一個重要限制因素。現代分子生物學和基因工程相關技術的日益成熟，使人們從分子水平上探知植物對高溫脅迫的響應及高溫誘導相關信號在植物體內的傳導途徑成為現實，并且為改良作物的抗高溫性能開辟了新的途徑，在了解植物響應高溫的分子機制的基礎上，充分利用植物自身的基因資源，發掘植物抗高溫相關基因，對培育抗高溫性能提高的作物具有重要的指導意義。擬南芥(Arabidopsis thaliana)屬十字花科,蕓薹屬植物,它不僅是第一個被測定基因組序列的模式植物(Athanasios Theologis et al.,NATURE, VOL.408:816_820),而且具有基因組規模較小、植株株型矮小、生長周期短、自花授粉而又易于雜交等優點。因此以擬南芥作為分子遺傳學和基因工程研究的模式植物，從中鑒定和克隆與熱脅迫相關的基因，并結合轉基因操作技術是培育耐高溫性能增強植物的一條有效途徑。轉錄因子(Transcription factors, TFs)又稱反式作用因子，是一類和專一'I"生DNA序列特異結合并能激活或抑止相關基因轉錄的蛋白質分子。熱激轉錄因子(Heat shocktranscription factors, HSFs)是一類能夠調控不同熱激蛋白(Heat shock proteins,HSPs)基因表達的專用轉錄因子。基因組研究發現擬南芥中包含21個HSFs基因家族成員。已有研究證明HSFAls、HSFA2等亞家族成員在應答熱脅迫信號和控制生長發育等過程中起到重要作用(HSIANG-CHIN LIU, HSIU-TINGLIAO&YEE-YUNG CHARNG, Plant,Cell and Environment(2011) 34,738-751 ；Yee-yung Charng.et al, Plant Physiology,January2007，Vol.143，pp.251-262)。但至今還沒有關于HSFA3基因熱脅迫反應的報道，這就給人們理解該基因的功能增加了難度，相關的理論和技術研究也往往因此而變得無所適從。
發明內容
本發明的目的是提供一個擬南芥熱激轉錄因子(HSF)基因，以及該基因在應答熱激脅迫反應中的功能和在培育耐高溫植物中的作用。所提供的HSF 基因為 HSFA3 (AT5G03720)。上述基因具有SEQ ID N0.1的堿基序列。 上述基因編碼的蛋白質具有SEQ ID N0.2的氣基酸序列。
HSFA3基因的T-DNA插入突變體salk_011131 是從ABRC(Arabidopsis BiologicalResource Center)定購獲得。通過PCR鑒定獲得純合插入突變體，通過RT-PCR在mRNA水平上鑒定基因的敲除情況。通過上述鑒定，獲得HSFA3基因T-DNA插入突變體salk_011131的純合株系，并以之為材料進行熱激處理。然后對熱脅迫處理后的擬南芥幼苗進行耐高溫相關指標的測定，包括根長及地上部生物量測定。
:圖1顯示野生型和突變體PCR和RT-PCR檢測的電泳結果，結果表明所獲HSFA3基因突變株系salk_011131為T-DNA純合插入株系，其轉錄本被敲除。圖2顯示熱脅迫處理流程和方法。圖3顯示野生型和突變體熱脅迫10天后的表型圖片，結果表明突變體經熱脅迫處理后根長及地上部生物量均大于野生型，表現耐熱表型。
具體實施方式
:下面結合實驗方法和數據進一步闡述本發明。1.擬南芥幼苗培養:野生型和突變體種子分別用0.5%次氯酸鈉溶液浸泡消毒lOmin，消毒后的種子放入4°C冰箱春化2天后點布于含I %瓊脂的MS (Murashige and Skoog)固體培養基上,置于22°C光照培養箱中萌 發生長。2.純合突變體鑒定:DNA提取:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。取約0.5g擬南芥新鮮葉片，研磨成糊狀，加 400 μ I SDS 提取液(0.5% SDS(ff/V) ；200mMTris-HCl, pH = 8.0 ；250mM NaCl ；25mM EDTA) ;12，OOOr/min離心3min ;取上清，加等體積異丙醇輕輕搖晃，靜置30min ;13，000r/min離心5min ;棄上清,用lml95%酒精沖洗1_2次后，自然風干,加去離子水30μ 1，4°C保存備用。RNA提取:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研缽、槍頭、離心管等一應物品事先用I % DEPC水浸泡過夜后高溫高壓滅菌備用。取新鮮幼苗約Ig左右，于液氮中研磨成粉狀，加Iml TRIZOL提取液混勻，靜置IOmin ;4°C下12000r/min離心IOmin ;取上清加300 μ I氯仿混勻，靜置IOmin后4°C, 12000r/min離心15min,樣品分為3層，RNA位于上層水相中；取500 μ I上層水相轉移到新離心管中，加等體積異丙醇沉淀10-20min ； 12000r/min 離心 IOmin,棄上清；用 75%酒精洗漆 1-2 次,7000r/min 離心 2min,晾干Imin左右，加60 μ I無RNase水，輕輕震蕩使RNA溶解，置于_70°C冰箱保存備用。RT-PCR:所用反轉錄試劑盒(#kl621)購自 Fermentas。First strandcDNAsynthesis:管中加入 RNAly I, oligo (dT) 18primerl μ I, RNase-free water I μ I,65 °C 處理 5min 后迅速冰浴冷卻；然后再加 5XReaction buffer4 μ I, Ribolock RNaseinhibitor (20u/ul)I μ I,IOmM dNTP Μ χ2μ I, RevertAid H Minus M-MuLV ReverseTranscriptase (200u/μ I) I μ 1，42°C反應 60min ;70°C終止反應 5min，產物于 _20°C冰箱保存備用。
PCR檢測:所用實驗藥品均購自中科瑞泰生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。我們設計了 2對引物，I對用于T-DNA插入檢測(LPl:5' -TTTGTCGGTTACTTCCTTCCC-3' ,RPl:5/ -AGCAAGTTTGGTTGGATTGTG-3'并結合T-DNA左邊界通用引物LBbl.3:5' -ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3')，通過PCR鑒定獲得純合插入突變體。進一步設計 2 條引物:LP2:5' -ATTTCAGTACCCGTTTCGAGAC-3' ；RP2:5/ -CATCATCATCACCAGT TGGC-3 '，通過RT-PCR在mRNA水平上鑒定基因的敲除情況。PCR 反應體系如下:10X buffer buffer2 μ I, dNTP0.8 μ I, Primer LP/RP 各 Ιμ ，DNAl μ 1，dH2014 μ 1，Taq 酶 0.2 μ I。PCR 程序如下:94°C 3min ； (94°C 45sec ；58°C 45sec ；72°C 60sec) X30cycles ；72°C 5min。產物采用1% (ff/V)瓊脂糖凝膠電泳分離，恒壓100V電泳20min,用BIO-RAD凝膠成像掃描儀拍照記錄檢測結果。3.熱脅迫處理:在含1%瓊脂的固體MS培養基上生長5天的幼苗，轉移到新的培養基中，野生型和突變體各轉5-6株，排列整齊以便于觀察表型。24h后置于烘箱中熱激，熱激條件為:38°C，lh30min ;22°C，4h ；48°C, lh30min ;22°C光照培養箱中生長10天后拍照。結果表 明熱脅迫處理后突變體根長及地上部生物量積累均大于野生型，表現耐熱表型。
權利要求
1.擬南芥熱激轉錄因子基因HSFA3，其堿基序列如SEQID No. I。
2.權利要求I所述的擬南芥熱激轉錄因子基因HSFA3編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2。
3.權利要求I所述的擬南芥熱激轉錄因子基因HSFA3突變體的熱脅迫處理方法及條件。
4.權利要求I所述的擬南芥熱激轉錄因子基因HSFA3突變體在熱脅迫處理下所獲得的表型及其相關試驗數據。
5.權利要求I所述的熱激轉錄因子基因HSFA3，在制備耐熱及其它抗性轉基因植物中的應用。
全文摘要
本發明屬于植物分子生物學與轉基因相關技術領域。具體為擬南芥熱激轉錄因子基因HSFA3抗高溫功能的驗證，以及該基因在抗高溫植物新品種培育中的應用。本發明以模式植物擬南芥為材料，利用HSFA3基因T-DNA插入純合突變體株系salk_011131研究HSFA3基因在植物抗高溫方面的功能。實驗結果顯示HSFA3基因敲除突變體在熱激脅迫下表現耐熱表型，其根長和地上部生物量均顯著大于野生型；說明HSFA3基因在植物應答熱激脅迫的信號轉導途徑中具有重要的作用，預計該基因的過量表達可提高植物的耐熱性并在植物抗逆分子育種中具有較大經濟價值。
文檔編號A01H5/00GK103255145SQ201310047409
公開日2013年8月21日 申請日期2013年2月6日 優先權日2013年2月6日
發明者徐江, 徐小棟, 東方陽, 魯黎明, 王西瑤, 張少斌, 遲志海, 洪雪, 麻艷超, 趙明, 丁在松, 付金東 申請人:中國農業科學院作物科學研究所