專利名稱：內生真菌菌株rr21及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種野生稻內生的真菌菌株的突變體RR21，以及其在植物生長調節和/或使植物致病上的用途，屬于微生物及微生物應用領域。
背景技術：
內生真菌(endophytic fungi)即至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物組織中，宿主無明顯病癥的一類真菌(Petrini，1991 ;Wilson，1995)，與菌根真菌只存在于植物根系不同，內生真菌在植株的地下和地上部分的任何組織器官都能存在(Faeth &Fagan, 2002)。內生真菌通常與寄主植物形成互惠共生關系，一方面內生真菌從寄主植物中獲取生長所需的養分，另一方面內生真菌可以促進植物生長，增強寄主植物的抗生物和非生物脅迫的能力。目前研究較多的是根瘤共生體和菌根共生體，內生真菌與植物的共生體是高等植物與微生物共生關系的又一種表現形式。內生真菌與植物的互作研究已日益受到研究者的關注，并成為內生真菌研究領域的國際熱點。內生真菌一植物共生是雙方相互適應的結果，兩者處在一種動態平衡中。在內生真菌一植物共生互作中，內生真菌和植物的基因表達譜發生明顯的變化，而且其表達譜依賴于所接種的內生真菌種類；基因表達的改變表明內生真菌和植物之間存在著信息的交流(Bailey et al., 2006)。 活性氧(reactive oxygen species, R0S)是植物和微生物互作中一種非常重要的信號傳導機制。NADPH氧化酶(NADPH oxidase, Nox)將NADPH的電子轉移到電子受體上，導致活性氧的形成。隨著Nox家族成員的發現，認識到活性氧的產生過程是一個普遍存在的控制各種分化過程的信號途徑，其中包括細胞的繁殖、凋亡、激素反應、程序化死亡、根毛生長、孢子萌發等過程。在系統性種子垂直傳播的麥角菌類內生真菌羊茅香柱菌(Epichlogfestucae)和多年生黑麥草(Lolium perenne)的共生關系中，內生真菌菌絲呈高度局限性生長模式，定殖在寄主植物地上部分的細胞間隙中，沿平行于葉軸的方向生長，幾乎不分枝。羊茅香柱菌NoxA突變體與寄主植物形成敵對互作關系，突變體在植物體內生物量顯著增加，菌絲形態發生變化，并呈輻射狀生長；接種突變體的植株喪失頂端優勢、生長嚴重鈍化、早熟衰老，最后死亡。另一個Nox基因一NoxB對羊茅香柱菌的定殖和共生關系的建立沒有影響。當Nox復合體(包括N0XA、N0XR和RacA)產生的活性氧紊亂時，共生互作關系瓦解，植物與內生真菌的關系將會由互惠共生變為敵對。因此，內生真菌NoxA產生的活性氧對其在植物體內的生長與生物量的變化具有調節作用，并對共生關系的維持起到至關重要的作用。(Tanaka et al., 2006; Eaton et al., 2011)。另外，許多微生物能利用非核糖體肽合成酶(Nonribosomal peptidesynthetase, NRPS)合成結構復雜、種類繁多的生物活性肽，被用作抗生素、免疫抑制劑、抗癌和抗病毒因子、鐵載體及生物表面活性劑等。在黑麥草內生真菌中克隆到一個編碼NRPS的基因sidN，該基因參與合成鐵載體；sidN的突變體導致不能正常合成鐵載體，內生真菌分泌鐵載體能力的缺失改變了共生體鐵離子的動態平衡，導致細胞間隙游離鐵離子增加，通過芬頓反應(Fenton reaction)引起活性氧水平的增加,最終共生關系由互惠性向拮抗性轉化，導致植物的病變壞死(Eaton et al.，2011)。另一個重要的信號轉導途徑是由環境脅迫引起的促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases, MAP 激酶，MAPK)途徑。MAPK 途徑對許多致病真菌的毒力具有重要的作用。羊茅香柱菌sakA基因編碼MAPK，并在植物-內生真菌共生關系中展現出必不可少的作用。sakA基因的缺失決定真菌與寄主植物之間的互作關系由共生變為致病。將sakA缺失突變體接種到植物上，植物表現出頂端優勢的喪失、早熟衰老以及植株發展過程中的巨大變化，包括分蘗基部類似鱗莖結構的形成與花青素的喪失(Eatonet al., 2008)o內生真菌還通過誘導寄主植物產生誘導抗性，從而提高植物抗生物(病原菌、食草動物等)和非生物(鹽、干旱、高溫等)脅迫的能力。病程相關基因非表達子UNonexpressorof pathogenesis-related genes I, NPRl)是系統獲得性抗性(systemic acquiredresistance, SAR)途徑中的關鍵調控基因,其功能定位在SAR信號轉導級聯反應中的水楊酸(salicylic acid, SA)積累和隨后的SAR基因表達之間。NPRl基因最早從模式植物擬南芥中克隆得到。NPRl本身沒有抑菌活性，但它能誘發植物體內的多種防衛反應，且對病原菌沒有嚴格的種屬專一丨I"生。印度梨形孢(Piriformospora indica)誘導擬南芥的系統抗性需要茉莉酸信號傳遞及在細胞質中的NPRl。植物一內生真菌共生體是繼豆科植物一根瘤共生體、菌根共生體后發現的高等植物與微生物共生關系的又一種表現形式。但從研究的深度和廣度來看，與豆科植物一根瘤共生體、菌根共生體相比，植物一內生真菌共生體的研究才剛處于基礎探索階段。目前植物一內生真菌的互作研究已日益受到研究者的關注，并成為內生真菌研究領域的國際熱點。內生真菌一寄主植物共生是雙方`相互適應的結果，兩者處在一種動態平衡中。在印度梨形孢與擬南芥共生體系中，擬南芥根部細胞內質網中存在的￠-葡萄糖苷酶(PYKlO)能限制內生真菌印度梨形孢的侵入定殖，從而抑制過強的防御反應，有利于兩者的互惠共生(Sherameti et al.，2008b);在印度梨形孢與大麥共生體系中，內生真菌侵染根系后能削弱HvB1-1基因的表達，HvB1-1基因的過表達反而能限制菌絲的侵染強度。HvB1-1基因在真核生物中很保守，能抑制細胞程序性死亡，這表明內生真菌菌絲在寄主體內的生長和繁殖需要植物組織細胞一定程度的死亡(Deshmukh et al.，2006)，最終兩者達到平衡狀態。另外在植物一病原真菌互作研究中，已經發現病原真菌菌絲的程序性死亡(programmed cell death)或自曬(autophagy)對于其成功侵染組織是必需的(Veneault-Fourrey et al., 2006),但在內生真菌-植物互作中，內生真菌中是否也存在著類似的反應機制到目前為止還沒有涉及。植物根瘤菌(RN)與菌根真菌(AM)共生體系是植物-內生菌共生體系中普遍存在且最為突出的模式體系，為研究植物-暗色有隔內生真菌互作的分子機制提供基礎模型。在豆科植物白脈根和苜蓿共生體中發現了大量共生必須的基因。目前已從各種共生突變體中克隆得到26個基因，這些基因參與根瘤菌的識別、早期的共生信號級聯反應、根部侵染與定殖、根瘤的形成以及固氮調節。這些發現為更好地了解植物-暗色有隔內生真菌共生的分子機制和進化提供重要的線索(Johnson et al., 2008)。CSP(common symbiosispathway公共共生途徑)普遍存在于共生系統中。Ca離子信號途徑是建立內共生體系的重要途徑。CSP參與Ca離子信號的編碼與解碼，從而影響AM共生體系的建立。目前，有7個基因 SYMRK、CAST0R、P0LLUX、NUP133、NUP85、CCaMK 和 CYCLOPS 已經被報道為 CSP 基因。目前已證實水稻有三個CSP直系同源基因:0sCAST0R、0sP0LLUX和OsCCaMK。其中，OsPOLLUX和OsCCaMK是水稻AM共生體必不可少的調控因子。在AM和RN共生系統中，OsCASTOR和OsCCaMK是維持CSP功能的分子基礎。SYMRK和富含亮氨酸的重復區域(LRR)共同編碼蛋白激酶(Johnson et al.，2008)。另外，SYMRK還可以通過激活由磷酸化調控的蛋白激酶參與Ca離子信號的形成，調節共生系統中的信號傳導。OsCASTOR與OsPOLLUX是跨膜通道蛋白(Deshmukh et al.，2006)，在共生體中對信號轉導也發揮作用。在信號途徑初期，許多定位在細胞核上的蛋白，比如核孔蛋白NUP85、NUP133，參與Ca離子信號誘導因子的運輸與定位。 CCaMK (鈣/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶)可能是Ca離子信號的解碼器，影響菌根真菌的侵染。CYCL0PS/IPD3也是Ca離子信號途徑的下游調控蛋白，與CCaMK協同作用。當CCaMK引起磷酸化時，CYCLOPS激活Ca離子信號途徑下游基因，從而使菌根真菌和根瘤菌成功侵染寄主。研究證明，水稻擁有所有CSP直系同源基因。其中，水稻0sCAST0R、0sCCaMK、OsCYCLOPS、OsPOLLUX和OsCCaMK在水稻AM共生體中也起到至關重要的調控作用。用SYMRK/DMI2激酶篩選互作因子，結果從苜蓿中得到HMGR1，從白脈根中得到SIP。HMGRl編碼甲瓦龍酸酯合成酶，而該酶參與異戊二烯化合物的合成。因此，HMGRl被認為參與根瘤菌的侵染與根瘤的形成。SIP是一類新的具有ARID(AT-rich domain)的DNA結合蛋白，專門結合NIN的啟動子。在GRAS區域，翻譯因子NSPl和NSP2在豆科植物RN共生體中是必須和專化的。除NSPl和NSP2外，翻譯因子NIN，對根瘤菌侵染根表皮以及根皮層根瘤的形成有重要作用。在水稻中也找到了與NSP1、NSP2同源的0sNSPl、0sNSP2。在共生表型喪失的白脈根(模式豆科植物)NSP1-2缺失的突變體中，水稻OsNSPl、0sNSP2能夠完全修復RN共生表型的缺失。CASTOR、POLLUX、CCaMK和CYCLOPS在水稻中仍能找到同源物，在進化上相當保守并且在共生關系中具有無可替代的作用。許多編碼GRAS蛋白的基因在AM共生體中上調。90年代初期，根瘤菌共生信號分子(NFs，Nod facters)的發現具有重大突破性，為隨后更好地闡述Nod基因功能提供基礎。NF受體擁有相同的結構，該結構是由胞外賴氨酸感應區域(LysM)的單通道跨 膜區和胞內激酶區域共同組成。LysM參與肽聚糖或類似結構分子的綁定，例如幾丁質低聚糖。在LysM功能缺失的突變體中，植物對根瘤菌和NFs的侵入不產生任何反應(Hiroshi et al.，2010)。在白脈根中，NFRl和NFR5形成受體復合體，對根瘤菌分泌的NFs具有專化識別性。由于NFR5胞內區域缺少激酶活性，所以在將胞內信號傳導給信號途徑下游的過程中NFRl起到至關重要的作用。而且NFRl的激酶活性在激活下游共生信號途徑中必不可少(T.Nakagawa,unpublished result)。全基因組序列分析表明:LysM_RK(LysM receptor-like kinases)基因家族可以通過基因串聯和部分復制呈現多元化。這樣就增加了由多個LysM-RK基因組成的復合體調節NF的感應和胞內信號傳導的可能性，而不僅僅局限于NFRl和NFR5復合體。所以寄主植物識別NFs的確切機制有待進一步研究。目前，在水稻基因組中發現了 6個LysM-RK基因。擬南芥中存在的幾丁質受體CERK1，能夠引起植物先天免疫力對抗真菌病原菌。CERKl也屬于LysM-RK，尤其是在胞內激酶區域方面，CERKl與NFRl有高度相似性。基于結構上的相似性，NFRl也具有短暫激活抗性相關基因的作用(T.Nakagawa, unpublishedresults)。白脈根中來自根瘤菌的共生信號分子的感應是由兩個LysM激酶NFRl和NFR5調節的。這兩個激酶在根瘤菌的侵染與根瘤的形成過程中必不可少。在內生羊茅香柱菌與寄主植物多年生黑麥草共生體中，菌絲呈高度局限性生長模式，定殖在寄主植物地上部分的細胞間隙中，沿平行于葉軸的方向生長，幾乎不分枝。這種嚴格控制內生菌生長的現象說明寄主與共生體之間存在信號傳導。在共生體中，內生真菌在促進植物的生長和生物量提高的過程中，激素類物質起到非常重要的作用。其中，一類由植物根部分泌的新型內源植物激素-獨角金萌發素內酯(Strigolactones),可以促進真菌的代謝、分枝和孢子的萌發,改變真菌的生理機能和線粒體活性。同樣地，真菌也釋放信號分子，引起植物根部的共生專化型反應。植物根部的
葡萄糖苷酸酶報告基因在真菌菌絲接近時被激活。微生物(例如內生真菌、內生細菌、根瘤菌等)通過誘導植物激素的產生或干擾植物激素合成途徑，促進植物的生長和生物量的增加。尤其是細菌ACC脫羧酶通過調節植物體內的乙烯水平從而干涉寄主植物的生理功能。TAKAKAZU(2010)等從栽培稻莖部分離得到內生細菌，固氮螺菌Azospirillum sp.。通過對該細菌全基因組核苷酸序列分析，發現了 2個激素相關基因。acdS基因，編碼ACC脫羧酶。acdR基因，調節acdS的表達。固氮螺菌產生ACC脫羧酶，降低植物體內的乙烯含量，促進植物的生長，減弱環境脅迫的信號。acdS在以前的研究中從未報道過。通過研究內生真菌突變體的功能，從而尋找相關關鍵基因，對研究內生真菌與植物的共生體系具有重大意義。水稻是我國最重要的糧食植物，內生真菌與水稻的共生體系，內生真菌突變體對水稻的致病力的研究，能夠開發具有相應抗病性防御機制生物制劑，對提高栽培水稻生長，增加生物量，提高其在逆境中的生存能力方面的研究與利用具有重要的意義。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種內生真菌的突變體菌株RR21及其用途。為了解決上述技術問題，本發明提供一種內生真菌菌株RR21，為稻鏈狀瓶霉(Harpophora oryzae) R5-6-1- RR21，其保藏號為:CCTCC NO: M 2012313。本發明還同時提供了上述內生真菌菌株RR21的用途:用于侵染植物，使植物致病。作為本發明的內生真菌菌株的用途RR21的改進:所述植物為水稻或大麥。本發明的菌株為Harpophora oryzae R5-6-1-RR21,保藏單位:中國典型培養物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學，保藏編號:CCTCC N0:M 2012313，保藏時間2012年8月27日。菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR21來源于水稻的內生真菌稻鐮狀瓶霉的突變體，屬于真菌界，子囊菌門，糞殼綱，有絲分裂真菌巨座殼科，瓶霉屬。該菌株在植物上有致病作用。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。
圖1:菌株(稻鐮狀瓶霉突變體菌株)Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在CM培養基上25°C暗培養5d后的菌落形態；與野生型R5-6-1相比，R5-6-1-SS1氣生菌絲更為稠密，菌落深灰色，菌落邊緣不整齊并呈輻射狀延伸，黑色素沉淀也明顯增加。圖2:菌株Harpophora oryzae R5-6-1-SS1對水稻的致死作用:對照組I為空白對照，即沒有接種的水稻苗，對照組2為接種R5-6-1的水稻苗，處理組為接種Harpophoraoryzae R5-6_1_SS1的水稻苗。接種R5-6-1-SS1的處理組植株地上部組織枯萎死亡，而對照組I和2的植株長勢良好；圖3:突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在根部的定殖情況及對根系生長發育的影響；A代表根毛區熒光顯微鏡圖，B代表根毛區光學顯微鏡圖，C代表根毛區橫切面；
圖4:Harpophora oryzae R5-6-1-SS1 侵染大麥致病性實驗；圖5:顯微鏡下觀察接種Harpophora oryzae R5-6-1-SS1的大麥葉片的侵染定殖情況；圖6:顯微鏡下觀察接種Harpophora oryzae R5-6-1-SS1的大麥葉片橫切面的侵染定殖情況；圖7:菌株Harpophora oryzae R5-6-1-S22在CM培養基上25°C暗培養5d后的菌落形態；與野生型菌株R5-6-1相比，氣生菌絲更為稀少，菌落白色，菌落邊緣整齊并呈輻射狀延伸，黑色素沉淀也明顯減少，幾乎沒有；圖8:稻鐮狀瓶霉突變體菌株Harpophora oryzae R5-6-1-S22對水稻的促生作用:對照組I為空白對照，即沒有接種的水稻苗，對照組2為接種R5-6-1的水稻苗，處理組為接種Harpophora oryzae R5-6_1_S22的水稻苗,結果顯示處理組植株地上部組織生長旺盛，葉片寬度增加，葉綠素含量增加，比對照組I和2的植株長勢好。圖9:突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-S22在根部的定殖情況及對根系生長發育的影響；A代表根毛區突光顯微鏡圖，B代表根毛區光學顯微鏡圖，C代表根毛區橫切面；圖10:菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在CM培養基上的菌落形態。圖11:稻鐮狀瓶霉突變體菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19對水稻的致死作用:對照組I為空白對照，即沒有接種的水稻苗，對照組2為接種R5-6-1的水稻苗，處理組為接種 Harpophora oryzae R5-6-1-RR19 的水稻苗。圖12:突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在根部的定殖情況及對根系生長發育的影響；A代表根毛區突光顯微鏡圖，B代表根毛區光學顯微鏡圖，C代表根毛區橫切面；圖13:Harpophora oryzae R5-6-1-RR19 侵染大麥致病性實驗；
圖14:顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-RR19的侵染定殖情況；A代表大麥葉片橫切面的熒光顯微鏡圖，B代表侵染大麥葉片后的突光顯微鏡圖；圖15 ;菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR21在CM培養基上的菌落形態；圖16:稻鐮狀瓶霉突變體菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR21對水稻的致死作用:對照組I為空白對照，即沒有接種的水稻苗，對照組2為接種R5-6-1的水稻苗，處理組為接種 Harpophora oryzae R5-6-1-RR21 的水稻苗。圖17:突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-RR21在根部的定殖情況及對根系生長發育的影響；圖18:Harpophora oryzae R5-6-1-RR21 侵染大麥致病性實驗；圖19:顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-RR21的侵染定殖情況。A代表大麥葉片橫切面的熒光顯微鏡圖，B代表侵染大麥葉片后的突光顯微鏡圖。
具體實施例方式參照上述附圖，對本發明的具體實施方式
進行詳細說明。備注說明:下述所有的培養基使用前均需要按照常規方式進行高溫高壓的滅菌處理(121°C、0.24 MPa、20 分鐘)。實施例1、內生真菌突變體菌株的獲得:野生型稻鐮狀瓶霉菌株編號為R5-6-1，分離自2007年野生稻根系。R5_6_l菌株保存在荷蘭國際真菌保藏中心(編號:CBS125863)和中國普通微生物保藏中心(編號:CGMCC 2737)。農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株 AGLl 及質粒 pCAMBIA1300 等常規物均為本實驗室保存。農桿菌一般在28°C黑暗培養，生長的基本培養基為LB液體培養基，在4%的甘油中-70°C下保存。CM(Complete Medium)培養基:20 X Nitrate salts 50ml, IOOOXTrace Elementslml, D-glucose (葡萄糖)IOg, Peptone (蛋白胨)2g, Yeast extract (酵母提取物)lg,Casamino acid (酪蛋白氨基酸)lg, IOOOXVitamin solution lml,用 lmol/L NaOH 調 pH值至6.5,加蒸懼水至1L。CM固體培養基為上述CM (Complete Medium)培養基的基礎上加入瓊脂粉12g。20 X Nitrate salts (1000ml)的配置:NaN03 120g, KCl 10.4g, MgSO4.7H20
10.4g，KH2PO4 30.4g，水定容至 1L。IOOOXTrace Elements (100ml)的配置:ZnS04.7H20 2.2g, H3BO3 1.lg, MnCl2.4H20 0.5g, FeSO4.7H20 0.5g, CoCl2.6H20 0.17g, CuSO4.5H20 0.16g, Na2MoO4.5H200.15g, Na4EDTA 5g，水定容至 100ml。IOOOXVitamin solution (100ml)的配置:Biotin 0.0lg, Pyridoxin 0.0lg,Thiamine 0.0lg, Riboflavin 0.0lg, PABA (p-aminobenzonic acid) 0.0lg, Nicotinicacid 0.0lg,水定容至 100ml。水瓊脂培養基:蒸餾水加1.5%瓊脂粉(即瓊脂粉與蒸餾水的質量比為1.5:98.5)，高壓滅菌，用于單孢分離。DCM (Defined Complex Medium)培養基:用于轉化子 SUR 抗性篩選，Yeastnitrogen base without amino acids (Difco) 1.7g,Asparagines 2g,NH4NO3 Ig , Glucose10g，定容至 1L，用 Na2HPO4 調 pH 至 6.0。LB 液體培養基(Luria-Bertani):Tryptone (膜蛋白腺)10g、Yeast extract (酵母提取物)5g、NaCl (氯化鈉)IOg,加去離子水至1000ml,用NaOH溶液調至pH7.5,高壓滅菌。LB 固體培養基:Tryptone (胰蛋白胨)10g、Yeast extract (酵母提取物)5g、NaCl(氯化鈉)10g、瓊脂粉12g，加去離子水至1000ml，用NaOH溶液調至pH7.5，高壓滅菌。農桿菌誘導培養基AIM 配方:0.8 ml 1.25 K-Phosphate-buffer pH 4.8 (用KH2PO4 和 K2HPO4 配制)，20 ml MN-buffer (30 g/1 MgSO4*7H20, 15 g/1 NaCl, IL H2O2),I ml 1% CaCl2*2H20 (w/v) , 10 ml 0.01 % FeSO4 (w/v), 5 ml spore elements (100 mg/1ZnSO4*7H20, 100 mg/1 CuSO4*5H20, 100 mg/1 H3BO3, 100 mg/1 Na2MoO4*2H20, IL H2O2)(過濾滅菌)，2.5 ml 20% NH4NO3 (w/v), 10 ml 50% glycerol (v/v), 40 ml I M MES pH 5.5(用NaOH溶液調pH值)，20% glucose (w/v):液體培養基中加10 ml，固體培養基加5 ml,加水至1L，固體培養基加1.5%瓊脂粉，(200 mM AS-用二甲基亞砜DMSO配制)。上述所有的培養基均需要進行高溫高壓的滅菌處理(121°C、0.24 MPa、20分鐘)。在實驗室條件下，按照農桿菌AGLl的凍融法轉化方法即可獲得本發明的內生真菌突變體菌株，即稻鐮狀瓶霉突變體菌株。具體如下:首先，農桿菌感受態制備:將構建好的熒光融合蛋白表達載體PKD6-GFP以及PKD5-RED (Li et al.2012)通過凍融法轉化到農桿菌菌株AGLl。將農桿菌菌株在LB平板上活化，然后轉到5mL LB液體培養基中28°C振蕩過夜培養；轉移2mL此培養液到裝有50mL LB液體培養基的三角瓶中28°C振蕩培養至0D6000.5 1.0 ;冰上放置停止生長，4°C 3000g離心5min ;沉淀用ImL預冷的20 mM CaCl2溶液懸浮，分裝到預冷卻的Eppendorf離心管中，每管0.1mL ；加I ii g的載體(熒光融合蛋白表達載體PKD6-GFP或pKD5_RED)質粒DNA到上述離心管中，液氮中冷凍；37°C水浴5min解凍；加入ImLLB液體培養基，28°C輕搖培養2_4h ；將培養好的菌液涂于含有卡那霉素(含50 u g/ml)的LB平板上，正面放置30min，待菌液完全被培養基吸收后，倒置培養皿，28 0C培養2-4d。其次，稻鐮狀瓶霉的T-DNA轉化:從上述培養的LB平板(含50 U g/ml卡那霉素)上挑選農桿菌單菌落接種于5ml LB液體培養基(含50ii g/ml卡那霉素)，200rpm/min，28°C過夜培養；第二天將200-400 U I培養液轉移到5ml含50 y g/ml卡那霉素的誘導液體培養基(AM)中，OD值約0.15，28°C培養5 6個小時使0D600達到0.5 0.6 ;用IOml滅菌蒸餾水從培養大約10天的CM平板上洗下稻鐮狀瓶霉野生型分生孢子，三層擦鏡紙過濾后用血球計數板計數，并用無 菌水稀釋孢子濃度為IO6個/ml ;取100 u I培養好的農桿菌AGL-1 (含載體)菌液和IOOul稀釋好的稻鐮狀瓶霉分生孢子懸浮液混合，混合液(200Ul)均勻涂于AM平板上的硝酸纖維素膜表面，AM平板含200 UM乙酰丁香酮(AS，acetosyringone)或不含AS作為對照,22°C共培養48小時；然后將硝酸纖維素膜轉移到含氯嘧磺隆與抗生素的DCM選擇平板上，選擇性培養基中含300 u g/ml氯嘧磺隆(SUR)、400U g/ml 頭孢霉素(cefotaxime)、60 u g/ml 鏈霉素(streptomycin),將平皿置于 28°C下培養到轉化子出現。本發明一共獲得轉化子87個，將其中4個(與野生型稻鐮狀瓶霉菌株編號為R5-6-1明顯不同)進行保藏，具體如下:菌株編號為Harpophora oryzae R5-6-1-SS1,保藏單位:中國典型培養物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學，保藏編號:CCTCC N0:M 2012314，保藏時間2012年8月27日。菌株編號為Harpophora oryzae R5-6-1-S22,保藏單位:中國典型培養物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學，保藏編號:CCTCC N0:M 2012315，保藏時間2012年8月27日。菌株編號為Harpophora oryzae R5-6-1-RR19,保藏單位:中國典型培養物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學，保藏編號:CCTCC N0:M 2012312，保藏時間2012年8月27日。菌株編號為Harpophora oryzae R5-6-1-RR21,保藏單位:中國典型培養物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學，保藏編號:CCTCC N0:M 2012313，保藏時間2012年8月27日。實施例2、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzae R5-6_1_SS1 (CCTCC NO:M
2012314)的形態觀察:在CM培養基上觀察該突變體菌株的菌落形態、顏色、生長速率、產孢量和黑色素沉淀。
觀察結果(圖1)顯不:突變體菌株Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在CM培養基上25°C暗培養5d后，菌落直徑分別為5.8cm、5.5cm。與野生型菌株相比，氣生菌絲更為稠密，菌落深灰色，菌落邊緣不整齊并呈輻射狀延伸，產孢量極顯著提高，為3.92 X IO9/皿，黑色素沉淀也明顯增加。實施例3、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzae R5-6_1_SS1 (CCTCC NO:M
2012314)對水稻的致死作用:MS培養基(IL):硝酸鉀1900mg/L，硝酸銨1650 mg/L，硫酸鎂370 mg/L，磷酸二氫鉀 170 mg/L,氯化I丐 440 mg/L,硫酸猛 22.3 mg/L,硫酸鋅 8.6 mg/L,硼酸 6.2 mg/L,碘化鉀0.83 mg/L，鑰酸鈉0.25 mg/L，硫酸銅0.025 mg/L，氯化鈷0.025 mg/L，硫酸亞鐵27.8 mg/L, Na2EDTA37.3 mg/L,甘氨酸 2.0 mg/L,鹽酸硫胺素 0.1 mg/L,鹽酸吡哆醇 0.5mg/L,煙酸 0.5 mg/L,肌醇 100 mg/L，30g 鹿糖，瓊脂粉 8g，H2O 定容至 IL ;pH 值 5.8。水稻種子(C039)去殼，用75%乙醇浸泡5 min,隨后將種子放置在三角瓶中用1%的NaClO溶液表面消毒8-10 min (充分搖勻)，最后用無菌水清洗多次后備用。將上述種子均勻平鋪在預先準備的MS平板上，完畢后用Parafi Im封口膜封住平皿，在25°C恒溫培養箱培養(16h光照/8h黑暗)。5天后將相對生長一致的無菌萌發種子移入1/2 MSCMurashigeand Skoog基本培養基)培養基的平板中(13cmX 13cm),每板5棵苗，同時接入3塊預先培養的R5-6-1-SS1菌餅(直徑:0.5cm)。對照組I為不含菌株的CM瓊脂塊，對照組2為含R5-6-1菌株的CM瓊脂塊。設5個重復。共培養30天后，觀察水稻苗的長勢。肉眼觀察水稻苗的長勢(圖2),發現:接種Harpophora oryzae R5-6-1-SS1的處理組植株地上部組織枯萎死亡，而對照組I和2的植株長勢良好。突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-SS1在根部的定殖情況及對根系生長發育的影響:觀察結果(圖3)發現:突變體菌絲集中分布于根毛區，尤其是根毛基部，菌絲密集，菌絲生物量多，且菌絲由皮層進入內皮層，最終侵染定殖于根系中柱細胞及維管組織。同時，被定殖的根部根毛彎曲變形，發育受限，長度變短，并出現暗褐色的病斑。與野生型菌株只定殖于表皮與皮層的空間限制性定殖模式相比，致病型菌株能夠侵染定殖根部的維管組織，呈非限制性的激增型生長。實施例4、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzaeR5-6-l_SSl (CCTCC NO:M
2012314)對大麥葉片的侵染致病性:大麥(ZJ-8)光/暗育苗6d，剪取表面無損的第一片葉，用于接種試驗。25°C，在CM固體培養基上暗培養稻鐮狀瓶霉野生型R5-6-1及突變體菌株R5-6-1-SS1，10天后用0.8cm 口徑的打孔器打取菌餅，將菌餅接種于離體的大麥葉片上，每片葉3個菌餅，3個重復，250C，12/12h光/暗保濕培養，4d后觀察并記錄發病情況，試驗重復3次。結果(圖4)發現:R5-6-l_SSl對大麥葉片造成嚴重的危害，具有非常強的致病性，接種處產生面積較大的擴散性黑色病斑，而且病斑會快速沿著葉脈擴散至周圍的健康區域，病斑中央區域逐漸腐爛，并存在著大量的菌絲；相比之下，野生型菌株并未形成病斑，無侵染致病性。用顯微鏡檢測接種過的大麥葉片，觀察菌株的侵染定殖情況。結果發現:R5-6-1-SS1可以在葉片表面形成大量的深褐色的附著胞(圖5)，附著胞繼而形成侵染菌絲直接侵染寄主的表皮及皮下細胞，最終定殖在葉脈的維管組織中，通過葉脈擴散至周邊部位，被定殖的葉片細胞及維管束細胞死亡(圖6)。實施例5、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzaeR5-6-l_S22 ( CCTCC NO:M
2012315)的形態觀察:在CM培養基上觀察突變體菌株的菌落形態、顏色、生長速率、產孢量和黑色素沉淀。觀察結果(圖7)顯示:突變體菌株在CM培養基上25°C暗培養5d后，菌落直徑分別為
2.8cm、2.5cm。與野生型菌株相比，氣生菌絲更為稀少，菌落白色，菌落邊緣整齊并呈輻射狀延伸，產孢量極顯著提高，為3.34 X IO9/皿，黑色素沉淀也明顯減少，幾乎沒有。實施例6、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzaeR5-6-l_S22 ( CCTCC NO:M
2012315)對水稻的促生作用:方法參照實施例3。5天后將相對生長一致的無菌萌發種子移入1/2 MS (Murashige and Skoog基本培養基)培養基的平板中(13cmX 13cm)，每板5棵苗，同時接入3塊預先培養的R5-6-1-S22菌餅(直徑:0.5cm)，對照組I為不含菌株的CM瓊脂塊，對照組2為含野生型R5-6-1菌株的CM瓊脂塊。設5個重復。共培養30天后，觀察水稻苗的長勢。肉眼觀察水稻苗的長勢(圖8),發現:接種Harpophora oryzaeR5-6-l_S22的處理組植株地上部組織生長旺盛，相對于對照組1，葉片寬度增加了 39.7%，葉綠素含量增加了88.2%，相比于對照組2，葉片寬度增加了 10.5%，葉綠素含量增加了 28%。說明:HarpophoraoryzaeR5-6-l-S22比野生型菌株的促生作用更為顯著。突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzaeR5-6-l_S22在根部的定殖情況及對根系生長發育的影響:觀察結果(圖9)發現:菌絲主要均勻地分布定殖在根系表面，根毛區略多，促進根毛的生長，無致病性。絕大部分的菌絲聚集在根圍附近，只定殖于表皮層及外皮層，不侵染內皮層和中柱細胞。Harpophora oryzaeR5-6-l_S22只限于根際周圍及跟表皮和外表皮層的定殖模式，以及促進寄主生長的特性，其更類似于土壤中的菌根真菌和豆科植物的固氮類真菌，圍繞在根際周圍促進根系的營養吸收，增加吸收面積，從而利于植物的生長。實施例7、稻鍵狀瓶霉突變體菌株Harpophoraoryzae R5_6_1-RR19( CCTCC NO:M2012312)的形態觀察:在CM培養基上觀察突變體菌株的菌落形態、顏色、生長速率、產孢量和黑色素沉淀。觀察結果(圖10)顯不:突變體菌株Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在CM培養基上25°C暗培養5d后，菌落直徑分別為4.5cm、4.3cm。與野生型菌株相比，氣生菌絲更為稠密，菌落深灰色，菌落邊緣不整齊并呈輻射狀延伸，產孢量極顯著提高，為3.94X IO9/皿，黑色素沉淀也明顯增加。實施例8、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzaeR5-6_l-RR19 ( CCTCC NO:M2012312)對水稻的致死作用:方法參照實施例3。5天后將相對生長一致的無菌萌發種子移入1/2 MS (Murashige and Skoog基本培養基)培養基的平板中(13cmX 13cm)，每板5棵苗，同時接入3塊預先培養的R5-6-1-RR19菌餅(直徑:0.5cm)，對照組I為不含菌株的CM瓊脂塊，對照組2為含R5-6-1菌株的CM瓊脂塊。設5個重復。共培養30天后，觀察水稻苗的長勢。肉眼觀察水稻苗的長勢(圖1`1),發現:接種Harpophora oryzae R5-6-1-RR19的處理組植株地上部組織枯萎死亡，而對照組I和2的植株長勢良好。突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzae R5-6-1-RR19在根部的定殖情況及對根系生長發育的影響:觀察結果(圖12)發現:突變體菌絲集中分布于根毛區，尤其是根毛基部，菌絲密集，菌絲生物量多，且菌絲由皮層進入內皮層，最終侵染定殖于根系中柱細胞及維管組織。同時，被定殖的根部根毛彎曲變形，發育受限，長度變短，并出現暗褐色的病斑。與野生型菌株只定殖于表皮與皮層的空間限制性定殖模式相比，致病型菌株能夠侵染定殖根部的維管組織，呈非限制性的激增型生長。實施例9、稻鍵狀瓶霉突變體菌株Harpophoraoryzae R5_6_1-RR19( CCTCC NO:M2012312)對大麥葉片的侵染致病性:大麥(ZJ-8)光/暗育苗6d，剪取表面磨損的第一片葉，用于接種試驗。25 V ’在CM固體培養基上暗培養稻鐮狀瓶霉野生型R5-6-1及突變體菌株Harpophora oryzaeR5-6-1-RR19，10天后用0.8cm 口徑的打孔器打取菌餅，將菌餅接種于離體的大麥葉片上，每片葉3個菌餅，3個重復，25°C，12/12h光/暗保濕培養，4d后觀察并記錄發病情況，試驗重復3次。結果(圖13)發現:Harpophora oryzae R5-6-1-RR19對大麥葉片造成嚴重的危害，具有非常強的致病性，接種處產生面積較大的擴散性黑色病斑，而且病斑會快速沿著葉脈擴散至周圍的健康區域，病斑中央區域逐漸腐爛，并存在著大量的菌絲；相比之下，野生型菌株并未形成病斑，無侵染致病性。用顯微鏡檢測接種過的大麥葉片，觀察菌株的侵染定殖情況。結果發現:Harpophora oryzae R5-6-1-RR19菌絲直接從葉片傷口處侵染表皮及皮下細胞,最終定殖在葉脈的維管組織中，通過葉脈擴散至周邊部位，被定殖的葉片細胞及維管束細胞死亡(圖14)。實施例10、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzae R5-6-1-RR21 ( CCTCCN0:M 2012313)的形態觀察:在CM培養基上觀察突變體菌株的菌落形態、顏色、生長速率、產孢量和黑色素沉淀。觀察結果(圖15)顯不:Harpophora oryzae R5-6-1-RR21突變體菌株在CM培養基上25°C暗培養5d后，菌落直徑分別為5.4cm、5.4cm。與野生型菌株相比，氣生菌絲略微稠密，菌落灰白色，菌落邊緣整齊并呈輻射狀匍匐狀延伸，產孢量為3.25X 109/皿，黑色素沉淀也明顯減少。實施例11、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzae R5-6-1-RR21 ( CCTCCN0:M 2012313)對水稻的致死作用:方法參照實施例3。
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5天后將相對生長一致的無菌萌發種子移入1/2 MS (Murashige and Skoog基本培養基)培養基的平板中(13cmX 13cm)，每板5棵苗，同時接入3塊預先培養的R5-6-1-RR21菌餅(直徑:0.5cm)，對照組I為不含菌株的CM瓊脂塊，對照組2為含R5-6-1菌株的CM瓊脂塊。設5個重復。共培養30天后，觀察水稻苗的長勢。肉眼觀察水稻苗的長勢(圖16),發現:接種Harpophora oryzaeR5-6_l-RR21的處理組植株地上部組織枯萎死亡，而對照組I和2的植株長勢良好。突光顯微鏡下觀察Harpophora oryzaeR5-6_l-RR21在根部的定殖情況及對根系生長發育的影響:觀察結果(圖17)發現:突變體菌絲由皮層進入內皮層，最終侵染定殖于根系中柱細胞及維管組織。與野生型菌株只定殖于表皮與皮層的空間限制性定殖模式相t匕，致病型菌株能夠侵染定殖根部的維管組織，呈非限制性的激增型生長。實施例12、稻鍵狀瓶霉突變體菌株 Harpophora oryzae R5-6-1-RR21 ( CCTCCN0:M 2012313)對大麥葉片的侵染致病性:大麥(ZJ-8)光/暗育苗6d，剪取表面磨損的第一片葉，用于接種試驗。25°C，在CM固體培養基上暗培養稻鐮狀瓶霉野生型R5-6-1及突變體菌株R5-6-1-RR21，10天后用0.8cm 口徑的打孔器打取菌餅，將菌餅接種于離體的大麥葉片上，每片葉3個菌餅，3個重復，250C，12/12h光/暗保濕培養，4d后觀察并記錄發病情況，試驗重復3次。結果(圖18)發現:Harpophora oryzae R5-6-1-RR21對大麥葉片造成較為嚴重的危害，具有較強的致病性，接種處產生面積較大的擴散性黑色病斑，而且病斑會快速沿著葉脈擴散至周圍的健康區域，病斑中央區域逐漸腐爛，并存在著大量的菌絲；相比之下，野生型菌株并未形成病斑，無侵染致病性。用顯微鏡檢測接種過的大麥葉片，觀察菌株的侵染定殖情況。結果發現:Harpophora oryzae R5-6-1-RR21菌絲直接侵染寄主的表皮及皮下細胞,最終定殖在葉脈的維管組織中，通過葉脈擴散至周邊部位，被定殖的葉片細胞及維管束細胞死亡(圖19)。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的 所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.內生真菌菌株RR21,其特征在于:為稻鏈狀瓶霉(Harpophoraoryzae)R5-6-1-RR21，其保藏號為:CCTCC NO: M 2012313。
2.如權利要求1所述的內生真菌菌株RR21的用途，其特征在于:使植物致病。
3.根據權利要求2所述的內生真菌菌株RR21的用途，其特征在于:所述植物為水稻或大 麥。
全文摘要
本發明涉及一種野生稻內生的真菌菌株的突變體RR21，以及其在植物生長調節和/或使植物致病上的用途，屬于微生物及微生物應用領域。具體而言，本發明公開了一種內生真菌菌株RR21，為稻鏈狀瓶霉(Harpophora oryzae)R5-6-1-RR21，其保藏號為CCTCC NO: M 2012313。本發明還同時公開了上述內生真菌菌株RR21的用途，其特征在于使植物致病；植物包括水稻或大麥。
文檔編號A01P15/00GK103114044SQ20131004745
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月6日 優先權日2013年2月6日
發明者章初龍, 馮曉曉, 蘇珍珠, 林福呈 申請人:浙江大學