專利名稱：一種擬南芥轉錄因子在培育抗旱性水稻中的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及ー個擬南芥轉錄因子DNA片段(基因)的分離克隆、轉化、功能驗證及在水稻中的應用。特別涉及利用該基因增強水稻抗旱等抗逆性的應用及方法。
背景技術：
干旱問題是影響當今世界農業生產與生態環境的主要的逆境因子，對世界糧食生產造成巨大的損失。如何高效地利用有限的淡水資源進行最大限度的農業生產，這是國際和國內生物科學技術迫切需要解決的重大課題之一。水稻是世界農業生產中用水最多的作物，其節水抗旱性對我國乃至全世界的糧食、水、以及生態安全具有重要的意義。培育抗旱品種是利用旱地的一種經濟而有效的方法，傳統的方法培育耐旱品種受到育種時間和優良
性狀選育的限制，利用轉基因技術提高作物的抗旱能力具有重要的理論與經濟意義。隨著植物抗旱分子機制研究的不斷深入和轉基因技術的日趨完善，為培育高效抗旱作物新品種開辟了一條嶄新的途徑。轉基因技術是指將外源基因通過生物、物理或化學手段導入其它生物基因組，以獲得外源基因穩定遺傳和表達的遺傳改良體。基因轉化的方法可分為兩類一是由載體介導的轉化，主要的方法為農桿菌介導法；另ー類是直接的基因轉化，包括基因槍法、電擊法、PEG法、脂質體轉化法和花粉管通道法等。近年來，應用較多的為農桿菌介導法和基因槍法。但是，基困槍法具有價格昂貴、轉化效率偏低、導入的外源基因拷貝數高、在后代中容易丟失或基因沉默、對片段大的基因難以導入且嵌合體不易排除等缺點，需要進一歩改進；農桿菌介導法在水稻轉基因種基因型依賴性小，可以很大程度上減少上述不足。目前已發表的抗旱相關的基因及其蛋白越來越多，反式轉錄調節因子包括所有的具有調節基因轉錄功能的蛋白分子，它們在植物生長發育和抗逆性方面發揮著巨大的作用。利用擬南芥抗旱相關轉錄因子及轉基因技術可以高效的培育出抗旱的高品質水稻等農作物。
發明內容
為了解決培育耐旱水稻品種受到育種時間和優良性狀選育的限制問題，本發明提供一種擬南芥轉錄因子在培育抗旱性水稻中的用途。本發明的目的是針對高效培育抗旱水稻品種的不足，利用農桿菌介導法轉基因技木，提供了分離克隆ー個包含有抗逆轉錄因子AT5G17460的完整編碼區段的DNA片段、編碼蛋白、以水稻Actinl為啟動子構建的AT5G17460表達載體及宿主，所述宿主為水稻。本發明所述擬南芥轉錄因子來源于NCBI (http://www. ncbi. nih. gov/)在NCBI中Gene ID:831612，在擬南芥資源中心，其位點為AT5G17460以及序列信息以以下網站為準(http://www. arabidopsis. org/servlets/TairObject id=132381&type=locus),分離克隆所用的DNA模板是cDNA，按照其位點信息AT5G17460，將其簡寫為A460。本發明從擬南芥的幼苗及根中分離得到ー種包含AT5G17460的DNA片段，通過轉化該片段賦予植物干旱等逆境條件下，增強耐受能力。其中，所述AT5G17460是下列核苷酸序列之一
1)序列表SEQID NO. I中第929-1858位所示DNA序列，或與SEQ ID NO. I中第929-1858位所示的高度同源DNA序列；
2)其它能編碼與序列表SEQID NO. 2中的蛋白質相同的DNA序列；
3)其功能相當于SEQID NO. I中第929-1858位所示DNA序列或與SEQ ID NO. I中第929-1858位所示的高度同源DNA序列所包含的亞片段。可以采用已經克隆的AT5G17460作為探針，從cDNA或基因組文庫中篩選得到本發明的基因或同源基因，也可以采用PCR(Ploymerase Chain Reaction)技術，從基因組DNA、mRNA和cDNA中擴增得到本發明的AT5G17460基因以及任何感興趣的一段DNA或其同源的一段 DNA。采用上述技術，可以分離得到包含AT5G17460的序列，將這ー序列與任何ー種可以引導外源基因在植物中表達的表達載體植株，可獲得抗旱、抗鹽及耐高鹽脅迫的耐受性增強的轉基因植株，本發明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前加上任何ー種強啟動子或誘導型啟動子，也可以使用增強子區域是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等的增強子，且與編碼序列閱讀框相同，以確保整個序列的翻譯。本發明基因是受逆境誘導表達的，因此可將本發明的基因與任何感興趣的逆境誘導啟動子結合后連入合適的表達載體，轉化植物宿主，在逆境條件下可誘導表達基因，提高植物在逆境條件下(干早)的存活率和生長速度。下面結合附圖及具體實施例對本發明做進ー步詳細說明。
序列表SEQ ID NO. I顯示的是本發明分離克隆的包含有AT5G17460編碼區和啟動子區得DNA片段序列。序列表SEQ ID NO. 2顯示的是本發明AT5G17460編碼的蛋白質序列。圖I為AT5G17460基因的PCR擴增與克隆 從擬南芥種莢中擴出AT5G17460，很淺的帯，經大量擴增后再回收克隆的，經反轉錄后獲得cDNA，再用Pfu高保真Taq酶以這些cDNA為模板進行PCR擴增。圖中M代表Marker，擴增出來的條帶為8個陽性克隆，沒有條帶的為陰性克隆。圖2為AT5G17460基因陽性克隆的篩選 將擴增出的目的片段用低熔點膠回收后，用平端連接的方法連到中間載體中。該載體中有ー個Sma I酶切位點，兩端分別是AttLl和AttL2，用于重組克隆用的序列。先將載體用Sma I酶切開，形成平端，然后用堿性磷酸酶CIP進行去磷酸化處理防止自連接產生陰性克隆。由于高保真酶不能產生帶有磷酸的末端，用T4 Polynucleotide Kinase在PCR產物末端加磷酸。將該片段純化后，放到一起用T4連接酶連接，轉入大腸桿菌，篩選陽性克隆。圖2是AT5G17460的PCR擴增的篩選圖，7個擴增出來的條帶均為陽性克隆，所用引物為 A4600FP 和 A4600RP。圖3為轉基因所用的pCAB水稻表達載體圖。圖4為轉基因水稻AT5G17460基因逆境脅迫誘導的熒光定量表達 轉基因水稻植株分別在干旱(失水)、冷脅迫(2°C)、200mM NaCl脅迫及ΙΟΟμΜ脫落酸(ABA)中誘導后提取葉中RNA并反轉錄后，采用SYBR Green I染料進行熒光定量PCR分析目的基因表達情況。圖5為轉基因水稻的過量表達圖；圖中5、13、14、19號為過量表達植株。圖6為T2代轉基因株系的干旱脅迫表型圖。圖7為T2代轉基因株系的干旱脅迫下的存活率 干旱脅迫下，T2代過表達轉基因株系存活率比WT 植株高約50% (WT，11. 3% ；0ΕΧ-5,54. 9% ；0EX-13,75. 8% ；0ΕΧ-19,68. 2%)。圖8為T1代轉基因株系的干旱脅迫下的表型圖。圖9為T1代轉基因株系的干旱脅迫下失水率 干旱脅迫下，T1代轉基因植株失水率WT植株低。圖10為T1代轉基因株系的干旱脅迫下綠葉百分比 干旱脅迫下，T1代轉基因植株綠葉百分比比WT的高出約40% (WT，23. 1% ；ACT:LWTl-6,67. 8% ；ACT:LWT1-102,65. 8% ；ACT:LWTl-78,57. 3%)。圖11為甘露醇脅迫下過量表達轉基因株系的表型圖。圖12為甘露醇脅迫下過量表達轉基因株系相對莖長 IOOmM甘露醇脅迫下，過量表達轉基因株系相對莖長比WT長2cm左右，200mM甘露醇脅迫下，過量表達轉基因株系相對莖長比WT長Icm左右。
具體實施例以下實施例定義了本發明，并描述了分離和克隆包含有AT5G17460編碼區和啟動子區得到DNA片段序列，水稻表達載體的構建以及驗證AT5G17460基因功能的驗證方法。根據以下的描述及具體實施方法，本領域技術人員可以確定本發明的基本特征，并在不偏離本分明精神和范圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其使用于合適的物種及用途。實施例一、水稻愈傷組織誘導
O將水稻七八分成熟的種子去殼，仔細剔除有霉點籽粒，取飽滿清亮籽粒先用70%乙醇浸泡(表面消毒)1-1. 5min，再用含2%的活性氯含量的NaClO溶液(加1_3滴TWeen20)，放入搖床120rpm搖45min,接著用無菌蒸懼水漂洗處理過的種子4_5次；
2)將滅菌后的種子放在30mL含有2.Omg/L 2，4_D的NBtl固體愈傷組織誘導培養基的表面(培養基成分見后);
3)將平皿用封ロ膜包好放有種子和培養基的平皿后，25±1°C暗培養；
4)暗培養10天左右，誘導出初生愈傷組織，將其剝離，再在相同的新鮮愈傷組織誘導培養基中繼代培養1-2次，直到得到生長旺盛的淺黃色易碎的胚形成的愈傷組織。將上述未成熟胚誘導的愈傷組織用干與農桿菌的共培養轉化。實施例ニ、分離及克隆AT5G17460
本發明所設計的序列來源于NCBI (http://www. ncbi. nih. gov/)在NCBI中Gene ID:831612，在擬南芥資源中心，其位點(AT5G17460)及序列信息以以下網站為準(http://www. arabidopsis. org/servlets/TairObject id=132381&type=locus),所用的模板是擬南芥的幼苗及根的cDNA，按照其位點信息AT5G17460，將其簡寫為A460 ;在進行PCR時，在50 μ L體系中加入IOng的擬南芥種子的cDNA作為為模板，上述引物各20 pmole進行反應。反應條件為94°C(I min)預變性；然后進行 94°C (30 sec)、58°C (30 sec)、72°C(I min)共35個循環；最后72°C延伸10 min,所用Taq酶為高保真的PfuTaq酶。所用引物為 A460FP AGGATGTTCGCGCGAAGACTCTCCTC,A460RP GAGCTTTTACCGCTTCTTCGCTTTCC 將擴增出的目的片段，用平端連接的方法連到中間載體PDGOl中。該中間載體是構建的ー個載體pDGOl，在pDGOl載體中有一個酶切位點(Sma I為平端酶)，兩端分別是AttLl和AttL2，可用于通過Gateway系統的方法重組克隆到終載體中；將pDGOl載體用Sma I酶切開，形成平端，然后用NEB公司的小牛腸堿性磷酸酶CIP進行去磷酸化處理防止自連接產生假陽性克隆。方法是用Sma I酶切pDGOl質粒后，在反應體系中加入WL NEB的小牛腸堿性磷酸酶CIP，37°C下溫浴I小時，用低熔點膠回收后備用;用丁4 Polynucleotide Kinase在PCR產物末端加磷酸=PCR產物用こ醇沉淀后，經70%こ醇洗鹽后加入ddH20溶解，加入I倍反應Buffer、dATP和T4 Polynucleotide Kinase后在37°C下溫浴I小時，用低熔點膠回收后備
用；將去磷酸的Sma I酶切過的pDGOl載體和加磷酸的pfu酶擴增的片段放到一起,并用T4連接酶連接，轉入大腸桿菌，篩選陽性克隆獲得PDGA460。經測序鑒定正確(序列表SEQ IDNO. I )，再進行下面實驗。實施例三、水稻表達載體的構建及其遺傳轉化
得到中間質粒后，通過ー個重組的LR反應，再經PCR篩選后克隆到水稻表達載體pCAB中，該水稻載體所用的啟動子為水稻的Actinl啟動子。在細菌中是卡那霉素抗性，在水稻中是抗除草劑PPT即Bar抗性。具體方法如下在反應體系中加入75 ng左右pCAB載體質粒 DNA, 150ng 左右 pDGA460 中間載體質粒 DNA, I μ L invitrogen LR Clonase II,并加入TE Buffer, pH 8. O補足至5 μ 1，在25で反應I小時。反應產物用熱激法轉入大腸桿菌感受態細胞，通過篩選獲得陽性克隆PCBA460。通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法將上述載體pCBA460導入到水稻品種皖粳97 (由安徽省農業科學院提供)中，經愈傷組織誘導、侵染、共培養、篩選具有Bar抗性的愈傷，再分化、生根、壯苗、移栽得到轉基因植株，具體方法見下面步驟。實施例四、農桿菌的培養及其與水稻愈傷組織的共培養
O挑取活化含有目的基因的單個農桿菌(AGL1)菌落，在28°C于4mL含相應抗生素(卡那霉素，50mg/mL)的LB培養基中震蕩過夜，第2天按1/100 (V/V)接種量在LB液體培養基中培養，直到OD6tltl約為0. 6-0. 8 ；
2)離心回收新鮮培養的農桿菌，并重懸于約1/2-1/3體積的AAM液體培養基(加1%的100 400Mmol/l 的 As)中，至 OD6tltl 約為 0. 8-1. O ；
3)將愈傷組織切下，立即投入含農桿菌的AAM重懸液中，浸泡15-20分鐘。并不時搖動；可將浸泡在農桿菌液體中的愈傷組織在真空抽濾5分鐘左右；
4)將感染后的愈傷組織置于無菌濾紙上吸干多余的菌液，轉入共培養基上，25±1°C暗培養2. 5-3. O天。實施例五、抗性愈傷組織的篩選及其再生
O經共培養后的愈傷組織，切去胚芽等，置無菌濾紙上吸干農桿菌菌液；
2)轉入篩選培養基上于25± I °C暗培養條件下篩選培養2周；
3)新鮮長出的抗性愈傷組織或不遏化的愈傷組織轉入篩選培養基上，繼續篩選培養2次，每次2周；
4)將抗性愈傷組織轉入分化培養基上處理2周，其中先在暗條件下培養7天，然后轉入光條件下培養7天；
5)經預分化上的愈傷組織轉入分化培養基上分化再生，在光下培養(光照12h/d)，約I個月左右；
6)再生的小苗在1/2MS培養基上生根壯苗，約I個月左右；移入大田種植。 上述培養基組分及其配方
(1)試劑和溶液縮寫本發明中培養基所用到的植物激素及抗生素的縮寫表示如下
6-BA (6-BenzyIaminoPurine, 6-節氨基腺嘌呤)
Kan (Kanamycin,卡那霉素)
Amp (Ampicillin,氨節青霉素)
KT (Kinetin,激動素)
NAA (Napthalene acetic acid,蔡こ酸)
IAA (Indole-3-acetic acid, Π引哚こ酸)
2 , 4-D (2 , 4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2, 4 ニ氯苯氧こ酸)
AS (Acetosringone,こ酸丁香酮)
CH (CaseinEnzymatic Hydrolysate ,水解酪蛋白)
Bar (Bialaphos,除草劑)
DMSO (Dimethyl Sulfoxide, ニ 甲基亞諷)
(2)基本培養基
LB 10g/L 蛋白胨、5g/L 酵母粉、10g/L NaCl、pH7.0
N6 N6大量元素、N6微量元素、N6有機成分
NB。 N6大量元素、B5微量元素(B5-M1、B5-M2)和B5有機成分
MS MS大量元素、MS微量元素和MS有機成分
AAM AA大量元素和微量元素、MS有機成分
(3)農桿菌介導轉化水稻所用培養基
愈傷誘導培養基=NBtl培養基、300mg/L水解酪蛋白、500mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖、2. 5g/L 植物凝膠、2. O mg/L 2，4_D、pH5. 8
侵染培養基:AAM培養基、500mg/L水解酪蛋白、68. 5 g/L蔗糖、36 g/L葡萄糖、100Mmol/L こ酰丁香酮、pH5. 2
共培養培養基=N6培養基、lg/L水解酪蛋白、30g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、2. 5g/L植物凝月交、2. O mg/L 2，4-D、ρΗ5· 8
抗性愈傷篩選培養基=NBtl培養基、300mg/L水解酪蛋白、500mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖、
2.5g/L 植物凝膠、2. O mg/L 2，4_D、250mg/L Cef、200mg/L Amp、4mg/L Bar、pH5.8
組織分化培養基=NBtl培養基、300mg/L水解酪蛋白、500mg/L脯氨酸、30g/L蔗糖、2. 5g/L 植物凝膠、2. O mg/L 2, 4-D,2. Omg/L 6-BAU. Omg/L IAAU. Omg/L NAAU. Omg/L KT、4mg/L Bar,PH5. 8
壯苗培養基1/2MS培養基、30g/L蔗糖、2. 5g/L植物凝膠、4mg/L Bar、PH5. 8。實施例六、轉基因水稻的DNA分子水平及轉錄水平的鑒定取抗性植株幼嫩葉片，小量葉片用CTAB法提取DNA，并用引物A460FP及A460RP進行PCR擴增鑒定，如圖2所示，在IKb左右附近有條帶的均為陽性植株；用Trizol法提取陽性轉基因植株的RNA，使用反轉錄試劑盒對RNA進行反轉錄合成第一鏈cDNA，并使用同樣的引物在轉錄水平上進行過量表達鑒定，見圖5。實施例七、AT5G17460轉基因過量表達T1代及T2代在干旱脅迫下的生長狀況
本發明選取了 3個AT5G17460基因過量表達的T1代及T2代轉基因株系實驗。具體步驟如下將過量表達的轉基因株系T1代種子與野生型対照的種子去殼消毒后的種子播種到1/2MS培養基上，2-3天后挑選發芽好且長勢 一致的種子轉移到新的1/2MS培養基上，在光照培養室生長10天后，將幼苗移入裝有泥土的方形托盤中，試驗用的泥土為水稻田中直接取用的泥土，等幼苗生長至減數分裂期后，對植株進行斷水干旱脅迫7天，然后澆水恢復9天，拍照并調查植株的存活率。試驗表明，本實施例與野生型對照相比，AT5G17460過量表達轉基因T1代株系表現為干旱耐受，見圖8、圖9、圖10 ;為了進一步驗證AT5G17460過量表達轉基因株系的干旱耐受功能，接下來選用AT5G17460基因過量表達轉基因T2代株系做了進ー步的干旱實驗驗證，將過量表達的轉基因株系T2代種子與野生型対照的種子去殼消毒后的種子播種到1/2MS培養基上，2-3天后挑選發芽好且長勢一致的種子轉移到新的1/2MS培養基上，在光照培養室生長10天后，將幼苗移入裝有泥土圓形小花盆中，試驗用的泥土為水稻田中直接取用的泥土，等幼苗生長至4葉期時，對植株進行斷水干旱脅迫5-7天，然后澆水恢復5-7天，拍照并調查植株的存活率。試驗表明，本實施例與野生型對照相比，AT5G17460基因過量表達轉基因T2代株系也表現為干旱耐受；以上實驗表明，本實例與野生型對照相比，表現出干旱耐受表型，見圖6、圖7。實施例八、甘露醇脅迫實驗
本發明選取了 3個AT5G17460基因過量表達的1\轉基因株系進行了甘露醇脅迫實驗。具體步驟如下將過量表達轉基因株系種子去殼消毒后，分別與野生型對照同時播種到100mmol/L、200 mmol/L的甘露醇1/2MS培養基上，在光照培養室生長14天后觀察表型和測量植株的株高及鮮重。每個家系的每種處理不少于20棵植株，實驗設置3次重復。結果表明AT5G17460過量表達的轉基因植株的生長在正常條件下與野生型對照無明顯差異，但在逆境脅迫處理后生長要顯著優于野生型對照，說明本發明的AT5G17460基因的表達可以緩解甘露醇脅迫造成的植株生長發育受阻，增強了轉基因植物對非生物逆境的抗性，見圖
11、圖 12。序列表I SEQ ID No. I
(Nucleotide Sequence, Sequence Length (bp) :2251)
ggaaacaaga aagauauuaa aaaaacucau augauucguc ucuauaaaag auccaacucu60
cacaaaucaa acaaaucaca uuuccacucu ccuugaaucu gauuucucca caaaaaaacu 120 acaucgauca ucgauaauag aucguacuac aauacuauau ucucaaaacg augguguuuc 180 cggcgugugu acagugcgga acaagacaaa accccugucg gugcaaagug guuggaccaa 240 cuuuaggguu cguggcuuuu cugauaaccg gaaucaucga guggccaguu ggugcggugg 300 uguauaucuu uaaacacgcc aagggucguc guauaauggg ucauccggcc agaaaaguuu 360 aucccaaagu cucucgaucu auucccauuu gacuuucuug ucauuaauua uaaucaugcu 420 uuguauuugc uugacaaaua augauuccac uuuuuagaua uaugugauca cauaagguau 480
權利要求
1.一種擬南芥轉錄因子在培育抗旱性水稻中的用途，該擬南芥轉錄因子的核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示；其編碼的蛋白序列為SEQ ID No. 2所示，其特征在于符合下列條件之一 1)序列表SEQ ID NO. I中第929-1858位所示DNA序列，或與SEQ ID NO. I中第929-1858位所示的高度同源DNA序列；2)其它能編碼與序列表SEQ ID NO. 2中的蛋白質相同的DNA序列；3)其功能相當于SEQ ID NO. I中第929-1858位所示DNA序列或與SEQ IDNO. I中第929-1858位所示的高度同源DNA序列所包含的亞片段，在培育抗旱性水稻中的應用。
2.根據權利要求I所述的一種擬南芥轉錄因子在培育抗旱性水稻中的用途，其特征在于包含擬南芥轉錄因子AT5G17460的轉化中間載體pDGA460和以水稻Actinl為啟動子所構建的表達載體PCBA460。
3.根據權利要求I所述的一種擬南芥轉錄因子在培育抗旱性水稻中的用途，其特征在于所述應用是通過篩選AT5G17460過量表達而得到抗旱性水稻。
全文摘要
本發明涉及一種擬南芥轉錄因子在培育抗旱性水稻中的用途，擬南芥轉錄因子AT5G17460的核苷酸序列為SEQIDNO.1所示；其編碼的蛋白序列為SEQIDNo.2所示；符合下列條件之一1)序列表SEQIDNO.1中第929-1858位所示DNA序列，或與SEQIDNO.1中第929-1858位所示的高度同源DNA序列；2)其它能編碼與序列表SEQIDNO.2中的蛋白質相同的DNA序列；3)其功能相當于SEQIDNO.1中第929-1858位所示DNA序列或與SEQIDNO.1中第929-1858位所示的高度同源DNA序列所包含的亞片段，在培育抗旱性水稻中的應用。通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化方法將載體pCBA460導入到水稻品種中，經愈傷組織誘導、侵染、共培養、篩選具有Bar抗性的愈傷，再分化、生根、壯苗、移栽得到轉基因植株。
文檔編號A01H5/00GK102816772SQ20121025984
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月24日 優先權日2011年7月27日
發明者陳學平, 汪洋, 郭家明, 曹樹青, 李敏, 張銀萍 申請人:中國科學技術大學