一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法

一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法
【專利摘要】本發明涉及植物快繁方法【技術領域】，公開了一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，包括以下步驟：a.環剝蘇瑪櫟獲得基部萌條；b.在基部萌條中選取帶腋芽的萌條作為外植體，經表面消毒；c.初代培養；d.增殖培養；e.壯苗培養；f.生根培養獲得生根試管苗；g.生根試管苗進行移栽。本發明提供了一種環剝蘇瑪櫟獲得基部萌條，取帶腋芽的萌條作為外植體，通過初代培養、增殖培養、壯苗培養、生根培養獲得生根試管苗、生根試管苗進行移栽，具有不受季節限制以及環境易控，減少變異植株的產生，種苗品質高，一致性好的優點，同時提高了蘇瑪櫟的年繁殖系數，降低了引種成本。
【專利說明】一種生物組織培養法繁育蘇瑪棟優株的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及植物快繁方法【技術領域】，具體為生物組織培養繁育，尤其涉及了一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法。

【背景技術】
[0002]蘇瑪櫟(Quercus shumardii)初期生長速度快,年高生長量可達Im,是美國重要的用材樹種之一，自2001年引種上海種植以來，亦表現出良好的抗逆性和園林觀賞價值。葉形奇特，具深裂，夏季葉片呈亮綠色，秋葉紅艷可愛，不僅是良好的城市園林及工業區綠化樹種，也是優美的觀葉樹種。耐水濕，比其他櫟類易移栽，因此可做為低濕地重要造林樹種和用材樹種，具有廣泛的應用前景。目前櫟類樹種采用播種繁殖，由于長期的有性繁殖，造成種群內個體所具有的遺傳基因復雜，實生苗間存在著十分顯著的變異，豐富的個體變異，為遺傳改良創造了有利條件。櫟樹體內含單寧等阻礙生根物質，屬很難生根樹種，有關櫟樹扦插組培成功的報道很少，解決櫟類樹種的無性繁殖難題是加快櫟樹優良材料推廣利用的前提條件，但多家研究機構在蘇瑪櫟扦插、嫁接試驗中，結果相似，成活率極低。有關櫟樹組培成功報道也很少，國內僅見在大葉櫟、栓皮櫟上有所報道，但增殖率、生根率以及移栽成活率普遍比較低。
[0003]本技術在單株選優的基礎上，采用直接器官發生形式，通過對培養基成分、激素配比以及培養環境因子的確定，建立了蘇瑪櫟完整的再生體系，以芽繁芽進行組培快繁生產出來的試管苗無變異發生，可以保持母本的優良性狀，使得這一昂貴的外來物種得以保存和繁育，為后期的推廣應用奠定了技術基礎和優質種苗。


【發明內容】

[0004]本發明針對現有技術中蘇瑪櫟樹體內含單寧等阻礙生根物質，很難生根，而采用扦插、嫁接，成活率極低等缺點，提供了一種環剝蘇瑪櫟獲得基部萌條，取帶腋芽的萌條作為外植體，通過初代培養、增殖培養、壯苗培養、生根培養獲得生根試管苗、生根試管苗進行移栽，具有不受季節限制以及環境易控的優點，同時提高了蘇瑪櫟的繁殖速度，降低了引種費用。
[0005]本發明中所用到的培養基及激素包括:WPM培養基(Murashing and Skoogmedium,以下簡稱WPM)，WPM配方中的藥品成分和培養基的具體配制方法為現有公知技術，在此不再贅述。1/2WPM是指WPM培養基中大量元素減半，而其余藥品成分不變。附加的植物激素為6-節基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine,簡稱為6-BA)、奈乙酸(naphthyleneacetic acid,簡稱為NAA)、卩引噪丁酸(3_Indolebutyric acid,簡稱為IBA),基本培養基中所用藥劑和各類激素可由sigma公司購得。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明通過下述技術方案得以解決:
一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，包括以下步驟:a、環剝蘇瑪櫟獲得基部萌條；b、在基部萌條中選取帶腋芽的萌條作為外植體，經表面消毒；c、初代培養、d、增殖培養；e、壯苗培養；f、生根培養獲得生根試管苗；g、生根試管苗進行移栽。
[0007]作為優選，所述的具體步驟如下:
a、在氣溫回升的春季，于優樹樹干基部進行環割，深至韌皮部，待萌芽條萌動并生長至5^20 cm時，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條；
b、在基部萌條中選擇生長健壯，無病蟲害的蘇瑪櫟帶腋芽的萌條做為起始外植體，用洗潔精擦洗表面后，流水沖洗20分鐘，再進行消毒處理；
C、將消毒處理后的外植體接種到初代培養基上，進行初代培養；
d、將初代培養的無菌苗轉入增殖培養基，誘導不定芽；
e、將誘導出的叢生芽分切后，轉移至壯苗培養基，進行壯苗培養；
f、將經壯苗培養生長到1.5cm以上的試管苗分切后，轉移至生根培養基中；
g、對所得的生根試管苗進行清洗，移至珍珠巖、草炭土的混合基質中進行栽種。
[0008]原先應該有芽的位置長出來的是定芽，如頂芽、腋芽等位置長出的；原先不可能長芽的位置長出來的是不定芽，如葉片、莖段的切口處。叢生芽是由植物器官和愈傷組織發育出來的群體叢生芽苗，大多是多細胞形成，雙極性，結構完整，可直接形成小植株，成苗率高，去分化容易，再分化中等。本專利中的不定芽主要是莖段切口處長出的芽，叢生芽是屬于不定芽中結構完整，可直接形成小植株的芽體。步驟f中的試管苗即在壯苗培養基上培養的無菌苗，壯苗培養獲得試管苗，生根試管苗指生根培養基上培養的無菌苗，生根培養獲得生根試管苗。
[0009]作為優選，所述的步驟a中，在氣溫回升的春季，于優樹樹干離地面約1(T30 cm處進行環割，環割樹干周長的1/3?4/5，環割口寬0.1cm?lcm，深至韌皮部，待萌芽條萌動并生長至5?20 cm時，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條，保濕保鮮。
[0010]作為優選，所述的步驟b中，取蘇瑪櫟包含腋芽的萌條，切取成為長度0.5^2.5cm,腋芽位于中間的莖段，切去葉片，保留兩片葉柄基部保護腋芽生長點，進行消毒處理；先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗3?4次，然后用加有0.Γθ.2%的升汞液浸泡15?30分鐘，用無菌水沖洗至無殘留，得到無菌的外植體。
[0011]作為優選，所述的步驟c中，初代培養基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-ΒΑ)
0.15?0.25mg*L k奈乙酸(NAA)0.15?0.25mg*L:+ 生物素 I?lOmg.L:+ 乙酸膽喊 I?lOmg.L:+核黃素I?lOmg.L—1+蔗糖25?358.171+瓊脂4?Ug.L—1。
[0012]作為優選，所述的步驟d中，增殖培養基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA)
0.1?2.5mg*L k 奈乙酸(NAA) 0.1?0.5 mg*L:+ 生物素 I?10mg*L 1 + 乙酸膽喊 I?10mg*L:+核黃素flOmg.!/1+蔗糖2(T40 g.!/1+瓊脂4?12 g.!/1，最佳增殖培養基為WPM +6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 1.0 mg.!/1 + 奈乙酸(NAA) 0.1 mg.!/1 + 生物素Smg.!/1 + 乙酰膽堿Smg.!/1+核黃素蔗糖30 g.L-1+瓊脂6 g.L—1，叢芽增殖率為1:2?3。
[0013]作為優選，所述的步驟d中，最佳增殖培養基為WPM +6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 1.0mg.!/1 + 奈乙酸(NAA) 0.1 mg.!/1 + 生物素 Smg.!/1 + 乙酰膽堿 Smg.!/1 + 核黃素 Smg.!/1+蔗糖30 g.L-1+瓊脂6 g.L—1，叢芽增殖率為1:2?3。
[0014]作為優選，所述的步驟e中，所述的壯苗培養基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA)
0.15?0.25mg*L k奈乙酸(NAA)0.15?0.25mg*L W 生物素 I?lOmg.L W 乙酸膽喊 I?10mg*L:+核黃素f lOmg.!/1+蔗糖25158*!/1+瓊脂rUg.!/1，培養20天苗高可以達到3?4厘米，2?4對葉片。
[0015]作為優選，所述的步驟f中，生根培養基為:1/2WPM+奈乙酸(NAA)0.5^2.Smg*^1+吲哚丁酸(IBA) 0.5?2.5 mg.L—1 +生物素I?lOmg.L—1 +乙酰膽堿I?lOmg.!/1+核黃素r1mg-Γ1+蔗糖15?358.!^+瓊脂4?所述的最佳生根培養基為1/2WPM+奈乙酸(NM)lmg.I71+卩引哚丁酸(IBA)lmg.I71+生物素 Smg.!/1 + 乙酰膽堿 Smg.!/1 + 核黃素 Smg.!/1+蔗糖20 g.L-1+瓊脂6 g.L—1，生根率為65?85%。
[0016]作為優選，所述的初代培養、增殖培養、壯苗培養和生根培養的培養條件均為無菌環境，光周期為l(Tl5h/d，光照強度150(Γ25001χ，培養溫度為室溫；初代培養的周期為22?28天，增殖培養的周期為28?32天，壯苗培養的周期為18?22天，生根培養的周期為28?32天。
[0017]作為優選，所述的步驟g中，將生根試管苗置于自然環境中6?10天，取出洗凈根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數秒，移栽到草炭土:珍珠巖=2:1的混合基質中，起始6?10天內保持苗的葉面濕潤并適當遮陽，其后按干透濕透的原則澆水，逐漸加強光照至全光照，進行栽種。
[0018]本發明由于采用了以上技術方案，具有顯著的技術效果:本發明極大加快了蘇瑪櫟的繁殖速度，一旦得到無菌苗后，可以利用無菌苗誘導增殖出大量不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生為完整植株，形成了一個良好的生產體系，年繁殖系數為1:60000，成本由原來的引種每株1000元，降低至每株5?8元。且不受季節限制，環境易控，適合全國各地，解決了蘇瑪櫟引種費用高的問題。直接器官發生的方式由于不經過愈傷組織階段，可以減少變異植株的產生，為快繁中保持種質資源的優良特性提供保障，生產得到的蘇瑪櫟種苗品質高，一致性好。

【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發明作進一步詳細描述:
實施例1
一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，包括以下步驟:a、環剝蘇瑪櫟獲得基部萌條；b、在基部萌條中選取帶腋芽的萌條作為外植體，經表面消毒；c、初代培養、d、增殖培養；e、壯苗培養；f、生根培養獲得生根試管苗；g、生根試管苗進行移栽。
[0020]具體步驟如下:
a、在氣溫回升的春季，于優樹樹干基部進行環割，深至韌皮部，待萌芽條萌動并生長至5^20 cm時，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條；
b、在基部萌條中選擇生長健壯，無病蟲害的蘇瑪櫟帶腋芽的萌條做為起始外植體，用洗潔精擦洗表面后，流水沖洗20分鐘，再進行消毒處理；
C、將消毒處理后的外植體接種到初代培養基上，進行初代培養；
d、將初代培養的無菌苗轉入增殖培養基，誘導不定芽；
e、將誘導出的叢生芽分切后，轉移至壯苗培養基，進行壯苗培養；
f、將經壯苗培養生長到1.5cm以上的試管苗分切后，轉移至生根培養基中；
g、對所得的生根試管苗進行清洗，移至珍珠巖、草炭土的混合基質中進行栽種。
[0021]步驟a中，在氣溫回升的春季，于優樹樹干離地面約1(T30 cm處進行環割，環割樹干周長的1/3?4/5，環割口寬0.1cm?lcm，深至韌皮部，待萌芽條萌動并生長至5?20 cm時，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條，保濕保鮮。
[0022]在上述方案的基礎上，步驟a中，環割方法具體為在氣溫回升的春季，于優樹樹干離地面約1(T30 cm處進行環割，環割樹干周長的1/3?4/5，環割口寬0.1cnTlcm，深至韌皮部，待萌芽條萌動并生長至5?20 cm時，選擇晴朗天氣的午后采集，保濕保鮮。具體的，離地面約1(T30 cm處進行環割，可以為10、15、20、25、30cm等范圍內的任一長度；環割樹干周長的1/3?4/5，可以為1/3、2/5、2/3、3/5、4/5等范圍內的任一長度；環割口寬0.1cm?lcm，可以為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.7,0.8,0.9、Icm等范圍內的任一長度；萌芽條生長至5?20cm，可以為5、8、10、12、15、18、20 cm等范圍內的任一長度。
[0023]步驟b中，取蘇瑪櫟包含腋芽的萌條，切取成為長度0.5?2.5cm，腋芽位于中間的莖段，切去葉片，保留兩片葉柄基部保護腋芽生長點，進行消毒處理；先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗3?4次，然后用加有0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分鐘，用無菌水沖洗至無殘留，得到無菌的外植體。
[0024]在上述方案的基礎上，步驟b中，所述的外植體修切為長度0.5^2.5cm，腋芽位于中間的莖段，可以為0.5,0.7,0.9、1、1.5,2.0,2.5cm等該范圍內的任一長度。在上述方案的基礎上，步驟b中，所述的清洗消毒處理的方法包括:取蘇瑪櫟包含腋芽的枝條，修切為長度0.5^2.5cm，腋芽位于中間的莖段，切去葉片，保留兩片葉柄基部保護腋芽生長點，進行消毒處理。先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗:Γ4次，然后用加有0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分鐘，用無菌水沖洗至無殘留，得到無菌的外植體。具體的，72%濃度酒精消毒可以為30s、40s、50s、60s，升汞液濃度可以為0.1%、0.15%、0.2%，浸泡時間可以為15、18、20、25、28、30 分鐘。
[0025]步驟c中，初代培養基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.15^0.2511^171+奈乙酸(NAA) 0.15?0.25mg*L-1+ 生物素 I?lOmg.L-1+ 乙酰膽堿 I?lOmg.L-1+ 核黃素 I?lOmg.L-1+ 鹿糖 25?358.171+ 瓊脂 rUg.L-1。
[0026]在上述方案的基礎上，步驟c中，所述初代培養基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA)
0.15?0.25mg*L ^NAA0.15?0.25mg*L:+ 生物素 I?lOmg.L:+ 乙酸膽喊 I?lOmg.L:+ 核黃素r1mg-Γ1+蔗糖25158*!/1+瓊脂具體的，在初代培養基中，6-芐基氨基嘌呤(6-BA)的激素濃度可以為0.15,0.18,0.2,0.22,0.25 mg.L'NAA的激素濃度可以為0.15、
0.18、0.2、0.22、0.25 mg.!/1，生物素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，乙酰膽堿的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，核黃素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，蔗糖的濃度可以為25、28、30、32、35 g.!/1，瓊脂的濃度可以為4、5、6、7、8、10、12 g.L'優選的初代培養基為:WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.2mg*r1+NAA0.2mg*r1+生物素Smg.!/1+乙酰膽堿5mg?L-1+核黃素Smg.!/1+鹿糖SOg.!/1+瓊脂Sg.!/1 ;在初代培養過程中，培養條件為無菌室內光周期為l(Tl5h/d，優選12h/d，光照強度150(Γ25001χ，優選20001χ，培養溫度為室溫，優選25 °C，培養周期為22?28天，優選25天。
[0027]步驟d中，最佳增殖培養基為WPM +6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 1.0 mg-Γ1 +奈乙酸(NAA) 0.1 mg.!/1 + 生物素 Smg.!/1 + 乙酰膽堿 Smg.!/1 + 核黃素 Smg.!/1+鹿糖 30 g.L-1+瓊脂6 g.!/1，叢芽增殖率為1:2?3。在上述方案的基礎上，步驟d中，所述增殖培養基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.Γ2.5mg*L_1+NAA 0.Γθ.5 mg.171+ 生物素 I?lOmg.L-1 + 乙酰膽堿I?lOmg.!/1+核黃素I?lOmg.!/1+鹿糖20?40 g.!/1+瓊脂4?12 g.L'具體的,6-BA的激素濃度可以為0.1,0.2,0.5,1.0,1.5,2.0,2.Smg^r17NAA的激素濃度可以為0.1,0.2、
0.4、0.5mg.!^，生物素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，乙酰膽堿的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，核黃素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，蔗糖的濃度可以為20、25、28、30、32、35、40 g.!/1，瓊脂的濃度可以為4、5、6、7、8、10、Ug.!/1。增殖培養基最佳的激素組合及濃度為:WPM +6-BA 1.0 mg*L 1 + NAA 0.1 mg*L 1 + 生物素 5mg*L 1 + 乙酸膽喊 5mg*L 1+核黃素Smg.!/1+鹿糖30 g.!/1+瓊脂6 g.!/1。在增殖培養過程中，培養條件為無菌室內光周期為l(Tl5h/d，優選12h/d，光照強度150(Γ25001χ，優選20001χ，培養溫度為室溫，優選25 0C，培養周期為28?32天，優選30天，由此蘇瑪櫟試管苗的月增殖系數為1:2?3。
[0028]步驟e中，所述的壯苗培養基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.15^0.奈乙酸(NAA)0.15?0.25mg*L-1+ 生物素 I?lOmg.!/1+ 乙酰膽堿 I?lOmg.!/1+核黃素 I?lOmg.!/1+蔗糖25158*!/1+瓊脂rUg.!/1，培養20天苗高可以達到3?4厘米，2?4對葉片。
[0029]在上述方案的基礎上，步驟e中，所述的壯苗培養基為WPM+6-BA0.15^0.25mg*r1+NAA0.15?0.25mg*L-1+ 生物素 I?lOmg.!/1+ 乙酰膽堿 I?lOmg.!/1+ 核黃素 I?lOmg.!/1+鹿糖25?358*!/1+瓊脂rUg.!/1。具體的，在壯苗培養基中，6-BA的激素濃度可以為0.15,0.18、
0.2,0.22,0.25 rng.L-1，NAA 的激素濃度可以為 0.15,0.18,0.2,0.22,0.25 mg.L-1，生物素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，乙酰膽堿的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，核黃素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，蔗糖的濃度可以為25、28、30、32、35 g.L—1，瓊脂的濃度可以為 4、5、6、7、8、10、12 g.L' 優選的壯苗培養基為:WPM+6-BA0.2mg*L_1+NAA0.2mg*L-1+生物素Smg.!/1+乙酰膽堿Smg.!/1+核黃素Smg.!/1+鹿糖30g.]^+瓊脂6g.]^ ;在壯苗培養過程中，培養條件為無菌室內光周期為l(Tl5h/d，優選12h/d，光照強度150(Γ25001χ，優選20001χ，培養溫度為室溫，優選25°C，培養周期為18?22天，優選20天，由此試管苗長至3^4cm高，葉片2?3對，比較整齊。
[0030]步驟f中，所述的最佳生根培養基為1/2WPM+奈乙酸(NAA) lmg.!/1+吲哚丁酸(IBA) Img1L-1+ 生物素 5mg.L-1 + 乙酰膽堿 5mg.L-1 + 核黃素 5mg.L-1+ 鹿糖 20 g.L-1+ 瓊脂6 g.!/1，生根率為65?85%。
[0031]在上述方案的基礎上，步驟f中，所述生根培養基為1/2WPM+NAA0.5^2.Smg-L^+IBA0.5?2.5 mg.!/1 +生物素I?lOmg.L-1 +乙酰膽堿I?lOmg.L-1+核黃素I?lOmg.L-1+鹿糖15?358.171+ 瓊脂 rUg.L' 具體 NAA 的激素濃度可以為 0.5,1.0,1.5,2.0,2.5π^.?ΛIBA的激素濃度可以為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg.!/1，生物素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，乙酰膽堿的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，核黃素的濃度可以為1、2、4、
6、8、10 mg.!/1，蔗糖的濃度可以為15、18、20、22、25、30、35 g.!/1，瓊脂的濃度可以為4、
5、6、7、8、10、12 g*L'所述的生根培養基最佳的激素和礦質元素及碳源組合濃度值為:I/2ffPM+NAAlmg*L-1+IBAlmg*L-1+ 生物素 Smg.!/1+ 乙酰膽堿 Smg.!/1 + 核黃素 Smg.!/1+ 鹿糖20 g.L—1+瓊脂6 g.L-1。培養條件為無菌室內光周期為l(Tl5h/d，優選12h/d，光照強度150(Γ25001χ，優選20001X，培養溫度為室溫，優選25 °C，生根培養的周期為28?32天，優選30天。由此生根率為65?85%。
[0032]初代培養、增殖培養、壯苗培養和生根培養的培養條件均為無菌環境，光周期為l(Tl5h/d，光照強度150(Γ25001χ，培養溫度為室溫；初代培養的周期為22?28天，增殖培養的周期為28?32天，壯苗培養的周期為18?22天，生根培養的周期為28?32天。
[0033]步驟g中，將生根試管苗置于自然環境中6?10天，取出洗凈根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數秒，移栽到草炭土:珍珠巖=2:1的混合基質中，起始6?10天內保持苗的葉面濕潤并適當遮陽，其后按干透濕透的原則澆水，逐漸加強光照至全光照，進行栽種。
[0034]在上述方案的基礎上，步驟g中，將生根試管苗置于自然環境中6?10天，一般為一周，取出洗凈，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數秒，移栽到草炭土、珍珠巖的混合基質中，一般草炭土:珍珠巖=2:1，起始6?10天(一般為一周)內采用噴霧保持苗的葉面濕潤，相對濕度為95%左右，并適當遮陽，其后(約二周后)按干透濕透的原則澆水，逐漸加強光照至全光照。
[0035]實施例2
一種蘇瑪櫟離體培養和快速繁殖的方法，環剝蘇瑪櫟獲得基部萌條做為外植體，經表面消毒、初代培養、增殖培養、壯苗培養和生根培養獲得試管苗，進行移栽，包括下述步驟:a:蘇瑪櫟自然條件下萌發的枝條，無論是頂芽還是帶腋芽的莖段，污染情況都非常嚴重，絕大多數為霉菌污染。并且褐變情況也十分嚴重，除了整個外植體材料完全褐變之外，基部滲出的酚類物質在培養基中也逐漸擴散，得不到無菌苗，外植體沒有萌發現象。
[0036]環割基部，萌蘗而成的枝條做外植體時，可以誘導其萌發，污染程度以及褐變情況有所減輕，得到的無菌苗可繼代培養，做為進一步擴繁培養的母本。環割方法具體為在氣溫回升的春季，于優樹樹干離地面約1(T30 cm處進行環割，環割樹干周長的1/31/5，環割口寬0.1cnTlcm，深至韌皮部。待萌芽條萌動并生長至5?20 cm時，選擇晴朗天氣的午后采集，保濕保鮮。
[0037]b:蘇瑪櫟長期生長于野外自然條件下，自身附帶的污染物較多，枝條表面有凹凸不平的紋理，表面消毒獲得無菌材料具有難度。本技術采用較溫和的洗潔精浸泡擦洗，去掉枝條表面的毛，初步降低污染后，再流水沖洗20分鐘。切取成為長度0.5^2.5cm，腋芽位于中間的莖段，切去葉片，保留兩片葉柄基部保護腋芽生長點，在超凈工作臺上，先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗3?4次，然后用0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分鐘，用無菌水沖洗至消毒液無殘留，得到無菌的外植體，平均無菌率50%。其中升汞溶液過濾后可反復加以使用，消毒效果不變，可減少對環境的破壞。
[0038]c:在步驟b中消毒所得到的無菌外植體接種到初代培養基WPM+6-BA0.15^0.25mg?L_1+NAA0.15?0.25mg*L-1+ 生物素 I?lOmg.!/1+ 乙酰膽堿 I?lOmg.!/1+核黃素 I?lOmg.!/1+鹿糖25158*!/1+瓊脂rUg*!/1上。培養基pH調為5.8左右，一個試管接種一個，避免交叉感染，于光周期為12h/d，光照強度為20001x，培養溫度為25°C的無菌室內培養25天。
[0039]無菌操作室在使用前30分鐘，打開紫外燈和超凈工作臺，紫外燈在關閉10分鐘后，才可進行接種操作；接種用具在121°C條件下高壓滅菌35分鐘，培養基在121°C條件下高壓滅菌18分鐘。
[0040]d:將初代培養獲得的健壯一致的無菌苗轉到增殖培養基WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.1?2.5mg*L:+NAA 0.1?0.5 mg*L:+ 生物素 I?lOmg.L 1 + 乙酸膽喊 I?lOmg.L:+ 核黃素I?lOmg.!/1+蔗糖20?40 g-Γ1+瓊脂4?12 g.L—1，結果表明，隨著細胞分裂素濃度的提高，增殖系數略微升高，當6-芐基氨基嘌呤(6-BA)濃度為1.0 mg.!/1，培養周期為30 d時，達到最高值2.05。有部分試管苗在培養過程中逐漸干枯死亡，一個培養周期內干枯率可達20%。當6-芐基氨基嘌呤(6-BA)濃度為2.0 mg-Γ1時，腋芽也可以萌發，但葉柄基部易產生愈傷組織，致使葉片從產生愈傷組織的地方脫落，繼續培養，在試管苗的基部也形成愈傷組織團塊，進而影響試管苗從培養基中吸收營養，致使生長變緩慢，降低了增殖系數，頂端逐漸干枯死亡率增高。添加生物素、核黃素、乙酰膽堿等有機物后，對增殖率影響不大，但卻可改善試管苗的生理狀態，葉色翠綠，有光澤，頂端干枯試管苗的數量減少，
本發明中所述的增殖培養基最佳的激素組合及濃度為=WPM +6-芐基氨基嘌呤(6-BA)
1.0 mg.!/1 + NAA 0.1 mg.!/1 + 生物素 Smg.!/1 + 乙酰膽堿 Smg.!/1 + 核黃素 Smg.!/1+鹿糖30 g.!/1+瓊脂6 g-Γ1 ;在增殖培養過程中，培養條件為無菌室內光周期優選12h/d，光照強度優選20001x，培養溫度優選25V，培養周期優選30天，蘇瑪櫟試管苗的月增殖系數為叢芽增殖率為1: 2?3。誘導出的叢生芽發育正常，葉色濃綠，長勢旺盛，可以做為蘇瑪櫟擴繁增殖的培養基。
[0041]e:在增殖培養基上，蘇瑪櫟試管苗生長高度參差不齊，將叢生芽分切后，轉移至壯苗培養基 WPM+6-BA0.15?0.25mg*r1+NAA0.15?0.25mg.!^+ 生物素 I?lOmg.!/1 + 乙酰膽堿I?lOmg.L-1+ 核黃素 I?lOmg.L-1+ 鹿糖 25?35g.L-1+ 瓊脂 4?12g.L'
[0042]本發明優選的壯苗培養基為:WPM+6-BA0.2mg*r1+NAA0.2mg*r1+生物素Smg.!/1+乙酰膽堿Smg*!/1+核黃素Smgt1蔗糖SOg*!/1+瓊脂eg.!/1 ;在壯苗培養過程中，培養條件為無菌室內光周期優選12h/d，光照強度優選20001x，培養溫度優選25°C，培養周期優選20天，試管苗長至3?4cm高，葉片2?3對，比較整齊，可以用來誘導生根。
[0043]f:本發明中生根培養基為 1/2WPM+NAA0.5?2.Smg.1^+IBA0.5?2.5 mg.!/1 + 生物素I?lOmg.!/1 +乙酰膽堿I?lOmg.!/1+核黃素I?lOmg.!/1+鹿糖15?35g.]^+瓊脂4?12g*L'當NAA、IBA濃度低于I mg.!/1時，生根率比較低；當上調至2.5 mg-Γ1時，生根率雖然可以達到100%，但是在試管苗的基部容易出現愈傷化組織，不利于后期的移栽；蔗糖含量為20g-Γ1時，也能夠提高生根率及平均生根數。蘇瑪櫟生根培養時最佳的激素和礦質元素及碳源組合濃度值為Η/^ΡΜ+ΝΑΑΙπ^Ι^+ΙΒΑΙπ^.!/1+生物素+乙酰膽堿Smg.!/1 +核黃素Smg*!/1+蔗糖20 g.!/1+瓊脂6 g.!/1，生根率為65?85% ;培養條件為無菌室內光周期優選12h/d，光照強度優選20001x，培養溫度優選25°C，生根培養的周期優選30天。
[0044]g:將蘇瑪櫟生根試管苗置于自然環境中6?10天，一般為一周，取出洗凈，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數秒，移栽到草炭土、珍珠巖的混合基質中，本發明中草炭土:珍珠巖=2:1，起始6?10天(一般為一周)內采用噴霧保持苗的葉面濕潤，相對濕度為95%左右，并適當遮陽，其后(約二周后)按干透濕透的原則澆水，逐漸加強光照至全光照。蘇瑪櫟成活率可以達到90%。
[0045]總之，以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所作的均等變化與修飾，皆應屬本發明專利的涵蓋范圍。
【權利要求】
1.一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，其特征在于，包括以下步驟:a、環剝蘇瑪櫟獲得基部萌條；b、在基部萌條中選取帶腋芽的萌條作為外植體，經表面消毒；c、初代培養、d、增殖培養；e、壯苗培養；f、生根培養獲得生根試管苗；g、生根試管苗進行移栽。
2.根據權利要求1所述的一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，其特征在于包括下列進行: a、在氣溫回升的春季，于優樹樹干基部進行環割，深至韌皮部，待萌芽條萌動并生長至5^20 cm時，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條； b、在基部萌條中選擇生長健壯，無病蟲害的蘇瑪櫟帶腋芽的萌條做為起始外植體，用洗潔精擦洗表面后，流水沖洗20分鐘，再進行消毒處理； C、將消毒處理后的外植體接種到初代培養基上，進行初代培養； d、將初代培養的無菌苗轉入增殖培養基，誘導不定芽； e、將誘導出的叢生芽分切后，轉移至壯苗培養基，進行壯苗培養； f、將經壯苗培養生長到1.5cm以上的試管苗分切后，轉移至生根培養基中； g、對所得的生根試管苗進行清洗，移至珍珠巖、草炭土的混合基質中進行栽種。
3.根據權利要求1所述的一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，其特征在于:步驟a中，在氣溫回升的春季，于優樹樹干離地面約1(T30 cm處進行環割，環割樹干周長的1/3?4/5，環割口寬0.1cm?lcm，深至韌皮部，待萌芽條萌動并生長至5?20 cm時，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條，保濕保鮮。
4.根據權利要求1所述的一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，其特征在于:步驟b中，取蘇瑪櫟包含腋芽的萌條，切取成為長度0.5^2.5cm，腋芽位于中間的莖段，切去葉片，保留兩片葉柄基部保護腋芽生長點，進行消毒處理；先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗:Γ4次，然后用加有0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分鐘，用無菌水沖洗至無殘留，得到無菌的外植體。
5.根據權利要求1所述的一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，其特征在于:步驟c中，初代培養基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.15?0.25mg*r1+奈乙酸(NAA)0.15?0.25mg*L-1+生物素I?lOmg.L-1+乙酰膽堿I?lOmg.L-1+核黃素I?lOmg.L-1+鹿糖25?358.171+瓊脂 rUg.L-1。
6.根據權利要求1所述的一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，其特征在于:步驟d中，增殖培養基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.Γ2.Smg.!/1+奈乙酸(NAA)0.1?0.5 mg.!/1+生物素I?lOmg.L-1 +乙酰膽堿I?lOmg.!/1+核黃素I?lOmg.!/1+鹿糖20?40g-L—1+瓊脂 4?12 g-L—1。
7.根據權利要求1所述的一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，其特征在于:步驟e中，所述的壯苗培養基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.15^0.奈乙酸(NAA) 0.15?0.25mg*L-1+ 生物素 I?lOmg.L-1+ 乙酰膽堿 I?lOmg.L-1+ 核黃素 I?lOmg.L-1+ 鹿糖 25?358.171+ 瓊脂 rUg.L-1。
8.根據權利要求1所述的一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，其特征在于:步驟f中，所述的生根培養基為:1/2WPM+奈乙酸(NAA) 0.5?2.5mg.L—1+吲哚丁酸(IBA)0.5?2.5 mg.!/1 +生物素I?lOmg.!/1 +乙酰膽堿I?lOmg.!/1+核黃素I?lOmg.!/1+鹿糖15?358.171+瓊脂 rUg.L-1。
9.根據權利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，其特征在于:所述的初代培養、增殖培養、壯苗培養和生根培養的培養條件均為無菌環境，光周期為l(Tl5h/d，光照強度150(Γ25001χ，培養溫度為室溫；初代培養的周期為22?28天，增殖培養的周期為28?32天，壯苗培養的周期為If 22天，生根培養的周期為28?32天。
10.根據權利要求1所述的一種生物組織培養法繁育蘇瑪櫟優株的方法，其特征在于:步驟g中，將生根試管苗置于自然環境中6?10天，取出洗凈根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數秒，移栽到草炭土:珍珠巖=2:1的混合基質中，起始6?10天內保持苗的葉面濕潤并適當遮陽，其后按干透濕透的原則澆水，逐漸加強光照至全光照，進行栽種。
【文檔編號】A01H4/00GK104221850SQ201310222753
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月6日 優先權日:2013年6月6日
【發明者】呂秀立, 施季森, 沈烈英, 張春英, 王軍 申請人:上海市園林科學研究所