一種創建甘藍型油菜突變體的方法
【專利摘要】本發明是一種創建甘藍型油菜突變體的方法，包括如下步驟：有性雜交、幼胚搶救、快繁繼代、染色體加倍和變異篩選。本發明的方法與物理輻射誘變、化學誘變及航空誘變育種方法相比，該技術屬于環境友好型，對實驗操作人員也不會造成身體損傷，該技術準入門檻低，普通的實驗室都能夠完成，成本低廉。
【專利說明】一種創建甘藍型油菜突變體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物育種【技術領域】，具體是指一種創建甘藍型油菜突變體的方法。
【背景技術】
[0002]甘藍型油菜是世界上最重要的油料作物之一，也是十字花科植物遺傳研究的典型材料。誘變可以產生豐富的突變體，現已廣泛應用于植物遺傳育種和生物學研究。誘變技術也較早地應用在油菜育種中，空間搭載通過輻射、化學誘變、空間搭載等方法，已經獲得了生育期、長角果長、豐產、高油、花形態、抗除草劑、抗病、葉片黃化等不同類型的變異種質資源，豐富了基因庫，并應用于品種選育之中。但至今尚未發現直接利用白菜型油菜和甘藍種間雜交創建甘藍型油菜新變異的報道。
[0003]現有的誘變技術方案主要包括3種類型，分別是物理輻射誘變、化學誘變和航空誘變。物理輻射誘變、化學誘變和航空誘變技術現被廣泛應用于農作物育種，使用誘變技術能使作物產生有益變異，從而獲得與育種目標相符的性狀，據FA0/IAEA (加06)的突變品種數據庫(MVD)統計，目前在線登記突變品種2541個，其中油料作物63個，油菜占25個，突變品種的問世和突變基因的擴散促進了各國的農業生產和經濟發展。
[0004]輻射誘變和化學誘變雖然能夠創建突變體，但是所用的物理射線和化學誘變劑對環境以及人體會造成較嚴重的損傷，在使用中對實驗條件和操作技術要求非常嚴格，普通實驗室很難具備理化誘變條件，一般的實驗人員也不具備理化誘變技術，因此，這一技術在普及上有難度。同樣，空間搭載存在著成本高、門檻高等難題，導致一般實驗室也很難應用。
【發明內容】
[0005]本發明的的目的就 是為了解決上述現有技術中的不足之處，提供一種新型創建甘藍型油菜突變體的方法。
[0006]本發明所述一種新型創建甘藍型油菜突變體的方法，其方法包括如下步驟:
[0007](I)有性雜交
[0008]以白菜型油菜和甘藍為父母本，分別進行正反交，于每蕾開花前1-3天進行剝蕾去雄，去雄后立即授粉一次，次日重復授粉一次；
[0009](2)幼胚搶救
[0010]授粉10天后，每天剝開角果在體式顯微鏡下觀察胚珠發育狀態和幼胚發育進程，找準幼胚凋亡臨界期，于幼胚凋亡前2-3天取回角果用84消毒液滅菌15分鐘，再用無菌水清洗三次后將角果放于無菌濾紙上剝出幼胚種于固體培養基，培養基成分為MS基本培養基 +1.2mg/L6-BA+0.25mg/LNAA ；
[0011](3)快繁繼代
[0012]在MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA培養基進行快繁，將一顆雜種苗增殖為3個以上的拷貝，為了防止長期連續培養導致雜種苗玻璃化和老化，進行MS和MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA兩種培養基交替培養繼代；[0013](4)染色體加倍
[0014]幼嫩的小苗轉入添加有100mg/L秋水仙素的MS培養基中培養12天左右，具體時間視苗子的長勢而定，一般來說當幼苗的頂端明顯變粗時即可停止處理，將處理的幼苗連同愈傷組織一同轉入新鮮的快繁培養基中直到從愈傷組織中分化出新苗；
[0015](5)變異篩選
[0016]從創建的異源四倍體(新型的甘藍型油菜AACC)第一代開始，觀察并記錄葉型、葉色、株高、株型、花色、花瓣大小、角果長度、籽粒大小、初花期、終花期、成熟期、花粉育性、自交親和性等性狀不同世代變異情況，同時利用AFLP分子標記檢測新型甘藍型油菜基因組水平變異情況，分子水平檢測到的變異一方面可以與形態上可見變異相互印證，另一方面可以通過分子檢測發現更多的中性突變；AFLP分子標記按照Sagha1-Maroof等的CTAB法提取樣品DNA，參照Vos等報道的方法進行AFLP分析，首先利用5U EcoR I和2U Mse I限制性內切酶(反應體積為25μ L)在37 °C水浴酶切DNA，酶切片段兩端連接人工接頭E-F:5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’、E-R:5’-AATTGGT
[0017]ACGCAGTC-3’、M-F:5' -GACGATGA GTCCTG AG-3’ 和 M-R:5’-TACTCAGGACTC
[0018]ATC-3’，用預擴增引物擴增連接產物，將預擴產物稀釋后利用選擇性擴增引物進行擴增，選擴產物變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染顯影，篩選出新型甘藍油菜。
[0019]本發明首 次提出利用基因組異源多倍化的齒輪效應創建新型甘藍型油菜。本發明所用的技術是利用白菜型油菜和甘藍型油菜種間雜交，使兩個不同來源的基因組異源多倍化后，發生了多倍化齒輪效應，即隨著世代的發展，遺傳變異越來越廣泛，在后代配合著形態學以及DNA水平的變異篩選，會篩選到一系列的突變體。異源多倍化的齒輪效應的定義是將白菜型油菜(AA)和甘藍(CC)的不同基因組異源多倍化為甘藍型油菜(AACC)，其后代基因組不穩定性隨著世代的發展而加劇。
[0020]從創建的異源四倍體(新型的甘藍型油菜AACC)第一代開始，觀察并記錄葉型、葉色、株高、株型、花色、花瓣大小、角果長度、籽粒大小、初花期、終花期、成熟期、花粉育性、自交親和性等性狀不同世代變異情況。同時利用AFLP分子標記檢測新型甘藍型油菜基因組水平變異情況。分子水平檢測到的變異一方面可以與形態上可見變異相互印證，另一方面可以通過分子檢測發現更多的中性突變。中性突變的定義是生物的進化主要由中性突變決定的，這些中性突變經自然選擇保留下來，再經隔離形成新物種，某些突變不影響生物的正常代謝過程。
[0021]本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果:
[0022]該方法與物理輻射誘變、化學誘變及航空誘變相比，該技術屬于環境友好型，對實驗操作人員也不會造成身體損傷，同時，該技術準入門檻低，普通的實驗室都能夠完成，此外成本更為低廉。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1是AFLP技術檢測花色突變材料自交后代DNA變化圖。
【具體實施方式】
[0024]以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本
【發明內容】
所實現的技術均屬于本發明的范圍。
[0025]實施例1
[0026]試驗材料
[0027]A基因組供體是白菜型油菜“青海大黃油菜”，C基因組供體是甘藍類亞種“中遲花芥蘭”，均由青海省農林科學院提供。利用大黃油菜和中遲花芥蘭雜交后合成的新型甘藍型油菜自交世代被用于形態、育性、自交親和、籽粒性狀及分子水平遺傳變異分析。
[0028]試驗方法
[0029](I)有性雜交
[0030]以大黃油菜為母本，以中遲芥藍為父本進行有性雜交，于每蕾開花前1-3天進行剝蕾去雄，一般上午去雄，下午授粉，第二天上午重復授粉一次；
[0031](2)幼胚搶救
[0032]授粉10天后，每天剝開角果觀察胚珠發育狀態，幼胚發育進程，大黃油菜和中遲芥藍雜交組合授粉后20d之前未出現肉眼可見胚，而授粉25d之后絕大多數胚珠已經凋亡，褐色珠被內包裹一微小死亡幼胚，說明肉眼可見幼胚出現時間與胚珠凋亡時間相隔較短，最佳取胚時間為授粉后20-25d;幼胚在母體內可發育到的最后階段是魚雷型胚期，該時期胚珠內胚乳消失殆盡，僅剩珠被包裹著魚雷形胚，將魚雷形幼胚取出分別接種于MS和MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA的培養基上，接種于MS培養基上2_3d所有幼胚開始褐化、凋亡，而接種于分化培養基上的幼胚逐漸形成愈傷，然后在愈傷組織上分化出雜種苗，通過胚搶救獲得10株人工甘藍型油菜單倍體苗；
[0033](3)快繁
[0034]在MS+L 5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA培養基進行快繁，將一顆單倍體雜種苗增殖為3個以上的拷貝。為了防止長期連續培養導致雜種苗玻璃化或老化，進行MS和MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA兩種培養基交替培養繼代；
[0035](4)人工染色體加倍
[0036]幼嫩的小苗轉入添加有100mg/L秋水仙素的MS培養基中培養12天左右，具體時間視苗子的長勢而定，一般來說當幼苗的頂端明顯變粗時即可停止處理，將處理的幼苗連同愈傷組織一同轉入新鮮的快繁培養基中直到從愈傷組織中分化出新苗；于初花期取幼小花蕾固定于卡諾固定液，挑取花藥用lmol/L鹽酸溶液在60°C水浴中水解3分鐘，水洗后用卡寶品紅染液染色壓片，在顯微鏡下進行減數分裂觀察；
[0037](5)變異材料篩選
[0038]從人工合成甘藍型油菜第一代開始，對其植株形態、花色、花瓣大小、籽粒大小、生育期等性狀進行觀察；出現變異的植株套袋自交，獲得穩定突變材料；利用AFLP分子標記檢測人工合成甘藍型油菜形態變異植株基因組變異情況。按照Sagha1-Maroof等的CTAB法提取樣品DNA。參照Vos等報道的方法進行AFLP分析，首先利用5U EcoR I和2U MseI限制性內切酶，反應體積為25 μ L，在37°C水浴酶切DNA，酶切片段兩端連接人工接頭，E-F:5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’、E_R: 5’-AATTGGTACGCAGTC-3’ 和 M-F: 5’-GACGATGA GTCCTGAG-3’、M-R: 5’ -TACTCAGGACTCATC-3’，用預擴增引物擴增連接產物，將預擴產物稀釋后利用選擇性擴增引物進行擴增。選擴產物變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染顯影，標記如下:
[0039](A)獲得大粒材料[0040]在人工甘藍型油菜自交后代獲得大粒甘藍型油菜資源，其中獲得千粒重> 6g的資源2份，其千粒重顯著高于甘藍型油菜主栽品種青油14號和青雜2號，見表1，表1如下:
[0041]表1獲得的大粒材料
[0042]
【權利要求】
1.一種創建甘藍型油菜突變體的方法，其特征在于包括如下步驟: a.有性雜父 以白菜型油菜和甘藍為父母本，分別進行正反交，于每蕾開花前1-3天進行剝蕾去雄，去雄后授粉一次，次日重復授粉一次； b.幼胚搶救 授粉10天后，每天剝開角果在體式顯微鏡下觀察胚珠發育狀態和幼胚發育進程，找準幼胚凋亡臨界期；在幼胚凋亡前2-3天取回角果用84消毒液滅菌15分鐘，再用無菌水清洗三次后將角果放于無菌濾紙上剝出幼胚種于固體培養基，所述的固體培養基為成分為MS基本培養基 +1.2mg/L6-BA+0.25mg/LNAA ； c.快繁繼代 在上述步驟a中的固體培養基中進行快繁，將一顆雜種苗增殖為3個以上的拷貝，進行MS和MS+1.5mg/L6-BA+0.25mg/LNAA兩種培養基交替培養繼代； d.染色體加倍 將小苗轉入添加有100mg/L秋水仙素的MS培養基中培養，當幼苗的頂端明顯變粗時停止處理，將處理的幼苗連同愈傷組織一同轉入新鮮的快繁培養基中直到從愈傷組織中分化出新苗； e.變異篩選 從創建的異源四倍體新型的甘藍型油菜第一代開始，對其植株形態、花色、花瓣大小、籽粒大小、生育期觀察，找出變異植株；用AFLP分子標記檢測新型甘藍型油菜基因組水平變異情況；利用5U EcoR I和2U Mse I限制性內切酶在37°C水浴酶切DNA，酶切片段兩端連接人工接頭 E-F: 5’ -CTCGTAGACTGCGTACC-3’、E-R: 5’ -AATTGGTACGCAGTC-3’ 和M-F: 5’ -GACGATGA GTCCTG AG-3’、M-R: 5’ -TACTCAGGACTCATC-3’，用預擴增引物擴增連接產物，將預擴產物稀釋后利用選擇性擴增引物進行擴增，篩選出新型甘藍油菜突變體。
【文檔編號】A01H4/00GK103461102SQ201310408329
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月9日 優先權日:2013年9月9日
【發明者】趙志剛, 富貴, 徐亮, 星曉蓉, 唐國永, 杜德志 申請人:青海省農林科學院