一種潮霉素選擇標記載體及應用該載體培育抗紋枯病的水稻的方法
【專利摘要】本發明涉及一種潮霉素選擇標記載體及應用該載體培育抗紋枯病的水稻的方法，將重寄生真菌粉紅聚端孢(Trichothecium?roseum)中幾丁質酶基因sdTrchi1導入粳稻中花11號品種，提高水稻對紋枯病的抗性。通過RT-PCR獲得幾丁質酶基因sdTrchi1，構建表達重組質粒pU1301/sdtrchi1，電擊法轉化農桿菌菌株EHA105，利用農桿菌介導法將該表達載體轉入粳稻中花11號品種中。本發明獲得的水稻對水稻紋枯病具有較高抗性，為植物病害抗病育種提供抗性基因資源奠定基礎。
【專利說明】一種潮霉素選擇標記載體及應用該載體培育抗紋枯病的水稻的方法
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及植物生物【技術領域】，具體涉及一種重寄生真菌粉紅聚端孢(Trichothecium.roseum)幾丁質酶基因sdtrchil的DNA片段的分離克隆,利用強啟動子驅動的轉基因技術，將重組表達載體pU1301/Sdtrchil通過農桿菌介導法轉化水稻中花11號品種。該重組表達載體由幾丁質酶基因sdtrchil插入到含潮霉素抗性篩選標記的pU1301載體的BamH I位點得到。本發明獲得的水稻對紋枯病的抗性得到明顯提高。
(二)【背景技術】
[0002]幾丁質酶是一種催化幾丁質水解生成N-乙酰葡糖胺反應的酶，幾丁質是構成大多數真菌細胞壁的主要成分。重寄生真菌產生的幾丁質酶不僅可以抑制真菌菌絲生長、孢子萌發、芽管伸長，降解成熟菌絲頂端，還能降解由幾丁質組成的真菌細胞壁。菌寄生真菌幾丁質酶作為重要的生防資源，有巨大的應用價值。幾丁質酶被認為在植物抗病性尤其是抗真菌性病害中起著重要作用[4]。將外源幾丁質酶基因導入植物是抗真菌病害育種的有效手段，可以顯著提高抗病性。
[0003]水稻是世界上最主要的糧食作物之一，全球約一半以上的人口以稻米作為主食。水稻紋枯病是水稻生產上普遍發生的一種世界性真菌病害，由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起，是水稻的三大病害之一。長期以來，水稻沒有較好的紋枯病抗源，用常規育種方法獲得抗紋枯病的水稻品種可能性較小。轉基因技術的發展為水稻品種改良提供了新途徑。
(三)
【發明內容】
[0004]本發明以粉紅聚端孢(Trichothecium.roseum)為材料獲得一種幾丁質酶基因，命名為8(11'1'(*丨1，全長00嫩為152%?，包含一個含有信號肽的由1278bp構成的開放閱讀框，編碼425個氨基酸。
[0005]構建重組表達質粒載體pU1301/sdtrchil，利用電擊法轉化農桿菌EHA105，在含有Kan+Rif/Str的YEP培養基上培養，經過PCR鑒定篩選陽性轉化子。獲得工程菌株pU1301/sdtrchil-SD。利用農桿菌介導法轉化水稻愈傷組織，獲得的轉基因水稻對水稻紋枯病的抗性提高。
(四)【專利附圖】
【附圖說明】
[0006]圖1植物表達載體pU1301/sdtrchil重組質粒圖譜
[0007]圖2T。部分再生植株PCR產物電泳圖譜
[0008]泳道M:Marker-DL5000
[0009]泳道1-7 =Ttl部分轉化植株
[0010]泳道WT:野生型植株[0011]圖3T。轉基因植株RT-PCR檢測
[0012]泳道M:Marker-DL2000
[0013]泳道T-2、T-3、T-14、T-15:轉基因陽性植株cDNA為模板
[0014]泳道WT:野生型植株cDNA為模板
[0015]圖4轉基因陽性植株與野生型對照植株的幾丁質酶活對比
[0016]圖5轉基因陽性植株與野生型對照植株抗病性對比
[0017]圖6水稻紋枯病抗性檢測
(五)【具體實施方式】 [0018]實施例1:幾丁質酶基因sdTrchil的克隆
[0019](I)粉紅聚端孢總RNA的提取:取幾丁質酶誘導培養基上的菌絲，參照Trizol試劑盒說明。
[0020](2)cDNA 第一條鏈的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0試劑盒說明書進行:取I~2 ii g總RNA，加RNase Free ddH20至9.5 y L，將RNA樣品在75°C變性5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分:10mmol/L dNTP Mixture2 u L, 10XRT Buffer (Mg2+) 2 y L，25mmol/L MgCl24 u L, Oligod (T) -Adaptor Primerl U L, RNase Inhibiter0.5 U L, AMV Reverse Transcriptase IuL(Final Volume 20 ii L),將反應液混合后，室溫下放IOmin,然后42°C溫育60min,再煮沸5min以滅活反轉錄酶。加入180 ii L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 y L，混勻，稍微離心，保存于-20°C，備用。
[0021](3)基因片段的分離:根據已知序列設計特異性引物。上有引物為 5 ' -CACTCCCTTCCTTTCTATAACAATC-3 '，下游引物為:5' -CCTCCTTTCATCATCATATTCGT-3'。
[0022](4)基因克隆:取0.5 ill PCR回收產物與pMD18_T載體進行連接，操作步驟按照TaKaRa公司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌DH5 a菌株，在表面涂有X_gal和IPTG的含氨卞青霉素(100 u g/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培
養基中培養過夜。
[0023](5 )質粒DNA的提取:堿法提取質粒DNA。
[0024](6)序列測定:DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進行，序列引物為Ml3啟動子引物。
[0025]實施例2:植物表達載體的構建
[0026](I)根據分離出的sdTrchil基因的核苷酸序列設計表達引物，在引物的5’
[0027]端分別引入BamH I酶切位點:
[0028]上游引物:5'-CGGGATCCCACTCCCTTCCTTTCTATAACAATC-3'
[0029]下游引物:5'-CGCGGATCCCCTCCTTTCATCATCATATTCGT-3'
[0030](2光0?反應(251^):。0嫩2111，10XBuffer2.5 u L, IOmmoI/L dNTP2 u L, 25mmol/L ]\%(:1221^，上、下游引物各11^，Taq DNA 聚合酶 0.5 ii L (5U/ii L)，ddH2014 ii L。反應條件為 95°C 5min 預變性；94°C lmin, 59°C 50s, 72°C 90s,共 32 個循環，72°C延伸 lOmin，10°C保存。[0031](3)基因克隆:取0.5yL PCR產物與pMD18-T載體進行連接，獲得重組質粒pMD18-T/sdtrchil，操作步驟按TaKaRa公司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，在涂有X-gal和IPTG的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。[0032](4 )質粒DNA提取:堿法提取質粒DNA。
[0033](5)用BamH I對重組質粒pMD18_T/sdtrchil產物進行單酶切，同時用BamH I單酶切表達質粒pU1301，DNA膠回收試劑盒回收純化Trchil基因及載體pU1301片斷。然后進行體外連接，獲得重組質粒pU1301/sdtrchil,重組質粒轉化大腸桿菌JM109,在含Km的LB轉化平板上挑選單菌落，提取質粒DNA，進行PCR和酶切鑒定，測序確認重組質粒的讀碼框正確。
[0034]實施例3:電擊法農桿菌感受態細胞的制備
[0035](I)挑單菌落于 5mL YEP 液體培養基(含 Rif50mg/L，含 Str50mg/L)中 28°C、200r/min過夜活化。
[0036](2)取2mL過夜培養的菌液接種于不含抗生素50mL YEP培養基中28°C生長至0D_約等于0.6左右(5h)。
[0037](3)培養物冰浴30min。
[0038](4) 4°C、5000r/min 離心 8min,用 dd H2O 懸浮細胞。
[0039](5)重復步驟(4), 4°C、5000r/min離心5min,懸浮細胞于ImL冰預冷的10%甘油中。
[0040](6)分裝100 μ L/管，儲存于_80°C待用。
[0041 ] 實施例4:重組表達質粒電擊法轉化農桿菌及重組農桿菌鑒定
[0042](I)取I支感受態細胞，冰浴融化。
[0043](2)加約0.5 μ g質粒DNA于100 μ L感受態細胞中，冰浴30min。
[0044](3)取出細胞與質粒的混合物轉入預冷的電擊杯中，細胞與質粒的混合物應沿電擊杯杯壁慢慢加入電擊杯中，避免產生氣泡；電擊前擦干電擊杯外側。在1800V高壓下電擊5_6s0
[0045](4)取出電擊杯，加入500mL預冷的YEP培養液(不含抗生素)，輕輕吹打混勻，吸出菌液轉入1.5mL離心管中。
[0046](5)28°C、200r/min 震蕩培養 2_4h。
[0047](6)離心lmin，懸浮細胞于100 μ L YEP培養基中。
[0048](7)涂板，28°C 培養 2_3d。
[0049](8)挑取單菌落，接種于含相應抗生素(Kan+Rif/Str)的LB液體培養基中，28°C振蕩培養過夜。菌落PCR鑒定及質粒酶切鑒定。
[0050]實施例5:農桿菌介導法轉化水稻
[0051]I愈傷誘導
[0052]I)成熟種子脫殼后70%酒精滅菌lmin，0.15%HgCl2處理15min ；
[0053]2)滅菌單蒸水洗5-7次；
[0054]3)將種子接種到誘導培養基上，每瓶接6-8粒；
[0055]4)置黑暗中26±1°C處理約4-7周。[0056]2愈傷繼代
[0057]挑取淺黃、致密且相對較干的胚性愈傷接種到繼代培養基上26土1°C處理2周，不可接太多。
[0058]3預培養
[0059]挑取致密且相對較干的胚性愈傷接種到預培養基上置黑暗中3至4天。
[0060]4農桿菌準備
[0061]準備浸染的農桿菌擴大培養。在相應抗性平皿中涂菌，28度培養箱中培養2-3天
[0062]5農桿菌懸浮培養準備
[0063]將農桿菌轉移到懸浮培養基中28°C搖瓶培養30-60min。一般100ml培養基用接種環刮入3至4環。
[0064]6農桿菌侵染(共培養)
[0065]I)經過預培養的愈傷轉移到一個滅菌的三角瓶中；
[0066]2)調整農桿菌懸浮液的OD6tltl值到0.8-1.0之間；
[0067]3)用農桿菌懸浮液浸泡愈傷20_30min ；
[0068]4)倒去菌液，將三角瓶倒立于含濾紙的滅菌小皿中約15min ；
[0069]5)愈傷放在滅菌`的濾紙上晾干后，轉移到共培養培養基上去。培養物19_20°C黑暗處理2天。
[0070]7水洗和篩選
[0071]I)經過共培養的愈傷轉移到一個滅菌的三角瓶中；
[0072]2)用滅菌單蒸水洗5至7次愈傷；
[0073]3)用含有400ppm Cn (羧節青霉素二鈉)的滅菌水浸泡愈傷30min (封好口后,可于 28 度，180 至 200RPM 搖 20_30min)；
[0074]4)倒去含抗生素的滅菌水，將三角瓶倒立于含濾紙的滅菌小皿中約15min ；
[0075]5)在滅菌的濾紙上晾干愈傷；
[0076]6)轉移愈傷到相應抗性的篩選培養基篩選2-3個循環(每個循環約2周)
[0077]8預分化與分化
[0078]I)經過篩選得到的抗性愈傷轉到帶抗性的預分化培養基的培養皿中，黑暗處理5-7 天；
[0079]2)經過預分化的愈傷轉移到100ml三角瓶里的分化培養基中，每瓶3粒愈傷，只選亮黃色的抗性愈傷，不必接入太多。；
[0080]3) 26°C光照處理，約需40-60天。
[0081]9 生根
[0082]I)從分化瓶中挑出要做生根的苗子，同一塊愈傷所得的苗子只選一棵；
[0083]2)剪掉所有原有的根，注意不要剪掉分生組織；
[0084]3)將苗子轉入生根培養基，28°C光照處理7至10天。
[0085]10 移栽
[0086]移去生根管的封口膜，倒入約Icm深的自來水，在光照培養室煉苗3-4天，移栽至準備好的栽種處。
[0087]實施例6:轉基因水稻分子生物學檢測[0088](I)PCR檢測:采用CTAB法提取轉基因水稻株系的基因組DNA，利用特異性引物進行PCR擴增反應，反應結束后取10 μ L擴增產物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測。
[0089](2)RT_PCR檢測:采用Trizol法提取葉片總RNA，然后以mRNA反轉錄出的cDNA為模板，利用特異性引物進行PCR擴增。
[0090](3)轉基因陽性植株幾丁質酶活性測定:取Ig轉基因水稻葉片，在液氮中研成粉末，轉移至離心管中，加3mL0.05M pH6.5磷酸緩沖液混勻,4°C、13000r/min離心20min。收集上清液做為酶溶液，用于幾丁質酶活性的測定，參考Boller等的方法提取酶液并測定酶活。
[0091](4)轉基因陽性植株抗病性檢測:將火柴棍截成0.5cm左右小段，滅菌后，加少量PDB培養基使之剛浸沒火柴棍。接種紋枯病病菌，26°C下培養3天。然后以此帶菌小棍做接種，在轉基因水稻分蘗盛期或孕穗期接種水稻紋枯病。接種方法參照Pan等報道，小心將倒三葉鞘擠開，迅速嵌入接種體，松開葉鞘使之恢復自然抱合狀態，接種后用塑料膜保濕，并作好記號。接種后第4天、9天、1 8天分別調查病情，并記錄每分蘗的病斑長度。
【權利要求】
1.重寄生真菌粉紅聚端孢(Trichothecium roseum)中幾丁質酶基因sdTrchil導入粳稻中花11號獲得轉基因植株，其特征在于該技術通過RT-PCR從粉紅聚端孢(Trichothecium roseum)獲得幾丁質酶基因sdTrchil,將該基因克隆到植物表達載體PU1301，獲得表達重組質粒pU1301/sdtrchil，轉化農桿菌菌株EHA105，利用農桿菌介導法轉化水稻愈傷組織，獲得轉基`因植株對紋枯病的抗性明顯提高。
【文檔編號】A01H5/00GK103525862SQ201310409663
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】李多川, 賀焜 申請人:山東農業大學