專利名稱：Ssr和est-ssr標記在小麥中的應用的制作方法
技術領域：
SSR和EST-SSR標記在小麥中的應用屬于小麥種質資源研究的重要領域。
背景技術：
大多數小麥SSR標記都是基因組專化性的，只在小麥A、B或D基因組含有一個SSR 的特定位點擴增，與其它的分子標記相比，信息量高而且利用更方便。所以SSR已替代RFLP 進行小麥的遺傳作圖。
發明內容
1、構建遺傳學圖譜 大多數小麥SSR標記都是基因組專化性的，只在小麥A、B或D基因組含有一個SSR 的特定位點擴增，與其它的分子標記相比，信息量高而且利用更方便。所以SSR已替代RFLP 進行小麥的遺傳作圖。 李衛華等以小麥京771和Pm97034及其173個后代重組自交系(RIL)為作圖群 體，利用從906對引物篩選出的270對多態性引物對該群體進行分析，共檢測到184個多 態性標記位點，利用其中的129個標記構建小麥分子的遺傳連鎖圖譜。用M即maker3. 0和 M即drawV2. 1軟件將129個SSR位點繪在小麥遺傳連鎖圖上，該圖譜覆蓋小麥基因組全長 2106. 2cM，標記間的平均遺傳距離為16. 32cM。 陳海梅等利用普通小麥EST數據庫(GenBank/dbEST)中最新的151， 695條EST序 列進行了微衛星序列篩選，共發現微衛星序列2， 038個。根據這些序列設計并合成249個 引物對，PCR擴增結果表明，166對可以作為小麥和相關物種新的EST-SSR標記。利用RIL 群體將43對EST-SSR位點繪制到遺傳圖譜11條染色體上。
2、遺傳多樣性的研究 在DNA標記中，SSR的普遍存在性、高度變異性和信息量的高多態性，使得它在鑒 定小麥遺傳多樣性的作用，在其應用于小麥研究中的一開始就得到證明。而EST-SSR反映 的是生物基因表達的轉錄部分，所以這兩種標記都廣泛用于小麥遺傳多樣性研究和核心種 質的構建。 傅體華等選用小麥染色體上的60個SSR標記，對來自四川3個不同單位近30年 育成的47個普通小麥品種的遺傳多樣性進行了分析。60個SSR位點中共檢測到118個等 位變異，每個位點的等位變異范圍為1-5個，平均1. 08個。品種的遺傳相似系數從1980年 以來有逐漸升高的趨勢。王珊珊等利用SSR標記研究了"矮孟牛"及其衍生品種(系)共 計91份小麥材料的遺傳多樣性。20對SSR引物檢測到120個多態性位點，每對引物多態性 位點數平均為6. 0個。91份小麥材料的遺傳距離變幅為0. 411-0. 961，遺傳差異較大。
王林海等利用79對SSR引物對河南省審定的46個小麥品種進行了分析。結果表 明，79對引物共檢測到298個等位變異，每個引物檢測到的等位變異數目2-7個，平均3. 77 個。品種間的遺傳距離為0.33-0. 84，平均為5.0。聚類分析把這些品種分為6大類和8個亞類。李宏偉等采用35對小麥EST-SSR標記檢測了 96份小麥材料的遺傳多樣性，共檢測 到129個等位變異位點，其中有87.6%有多態性。
3、基因標記與作圖 尋找與目標性狀緊密連鎖的分子標記是進行分子輔助選擇育種的基礎。與其它分 子標記相比，基于PCR反應的SSR和EST-SSR標記具有操作簡單，廉價，適合自動化檢測，具 有高重復性，而且大部分具有共顯性和染色體專化的性質，是適合于分子輔助選擇的理想 標記。 李俊等將川麥47與高感條銹小麥品種臺長29雜交，獲得雜交^和F2群體；對F2 群體(355株)進行條銹病抗性鑒定和遺傳分析，結果表明，川麥47攜帶一個顯性抗條銹病 基因；利用SSR標記和&分離群體分組分析法研究表明，該抗條銹病基因位于小麥1B染色 體上，與微衛星標記Xgwmll/Xgwml8、Xgwm273和Xgwm498緊密連鎖，遺傳距離為2. 2、4. 5和 3.9cM。川麥47可用于分子標記輔助育種[23]。程穎等對貴農21攜帶的條銹病抗性基因進 行了鑒定和遺傳分析，明確了貴農21攜帶一個抗條銹病顯性單基因YrGn21。采用&代抗病 分離群體和集群分離分析法(BSA)建立了與該基因連鎖的11個微衛星標記。并將YrGn21 定位與IBS染色體的近著絲粒區域，與位于IBS染色體的Yr26具有等位性關系。
張娜等用定位于2A染色體的59對SSR、 EST-SSR引物對小麥抗葉銹病基因Lr45 進行分子標記。用152株&抗感群體對篩選出的ll對多態性引物進一步檢測，得到四個 與Lr45共分離的標記。其中將Xgwm95的抗感差異帶和Xgwm47的抗性片段進行克隆測序 發現，其中含有微衛星序列，且為二核苷酸重復。Xgwm372和Xgwml22經瓊脂糖凝膠電泳發 現，與Lr45供體黑麥有共同的標記片段，可直接用于分子標記輔助選擇。伊靜等利用3個 不同的D51F2群體進行抗病反應型鑒定，證明小麥突變體D51的抗稈銹性受一對顯性基因 控制。利用675對小麥SSR引物和186株F2分離群體將該基因定位在5DS上。
此外，趙軍等利用SSR標記證明小麥品種Grandin的抗白粉病基因即為位于5DS 上的Pm基因。馬強等以感白粉病小麥品種MYll與抗白粉病小麥新材料YU25雜交回交的 F2、 BC^、 B(y^群體，對YU25的抗白粉病性進行遺傳分析，結果表明兩個抗白粉病基因 PmE (免疫)和PmYU25 (高抗)都是顯性基因，并且利用SSR標記，分別將它們定位在7BS和 2DL上。迄今已有決定許多重要小麥性狀的近百個主效基因和一些QTL獲得不同類型的分 子標記。 4、其他方面 微衛星標記和EST-SSR標記還在DNA指紋和品種鑒定、鑒別小麥細胞遺傳學材料、 譜系分析和標記輔助選擇等諸多方面有著廣泛的應用。在水稻中，已經證明SSR標記能夠 十分穩定和可靠地在系譜中追溯目的單基因或數量性狀基因座流。在小麥方面，景蕊蓮和 昌小平對平遙小白麥、螞蚱麥及其衍生品種的系譜親緣材料進行了 SSR分析，聚類分析結 果與系譜親緣關系的遠近是基本一致的。
權利要求
構建遺傳學圖譜大多數小麥SSR標記都是基因組專化性的，只在小麥A、B或D基因組含有一個SSR的特定位點擴增，與其它的分子標記相比，信息量高而且利用更方便，所以SSR已替代RFLP進行小麥的遺傳作圖，李衛華等以小麥京771和Pm97034及其173個后代重組自交系(RIL)為作圖群體，利用從906對引物篩選出的270對多態性引物對該群體進行分析，共檢測到184個多態性標記位點，利用其中的129個標記構建小麥分子的遺傳連鎖圖譜，用Mapmaker3.0和Mapdraw V2.1軟件將129個SSR位點繪在小麥遺傳連鎖圖上，該圖譜覆蓋小麥基因組全長2106.2cM，標記間的平均遺傳距離為16.32cM，陳海梅等利用普通小麥EST數據庫(GenBank/dbEST)中最新的151,695條EST序列進行了微衛星序列篩選，共發現微衛星序列2,038個，根據這些序列設計并合成249個引物對，PCR擴增結果表明，166對可以作為小麥和相關物種新的EST-SSR標記，利用RIL群體將43對EST-SSR位點繪制到遺傳圖譜11條染色體上。
2. 遺傳多樣性的研究在DNA標記中，SSR的普遍存在性、高度變異性和信息量的高多態性，使得它在鑒定小 麥遺傳多樣性的作用，在其應用于小麥研究中的一開始就得到證明，而EST-SSR反映的是 生物基因表達的轉錄部分，所以這兩種標記都廣泛用于小麥遺傳多樣性研究和核心種質的 構建，傅體華等選用小麥染色體上的60個SSR標記，對來自四川3個不同單位近30年育成 的47個普通小麥品種的遺傳多樣性進行了分析，60個SSR位點中共檢測到118個等位變 異，每個位點的等位變異范圍為l-5個，平均1.08個，品種的遺傳相似系數從1980年以來 有逐漸升高的趨勢。王珊珊等利用SSR標記研究了 "矮孟牛"及其衍生品種(系)共計91 份小麥材料的遺傳多樣性。20對SSR引物檢測到120個多態性位點，每對引物多態性位點 數平均為6. 0個，91份小麥材料的遺傳距離變幅為0. 411-0. 961，遺傳差異較大，王林海等利用79對SSR引物對河南省審定的46個小麥品種進行了分析。結果表明， 79對引物共檢測到298個等位變異，每個引物檢測到的等位變異數目2-7個，平均3. 77個。 品種間的遺傳距離為0. 33-0. 84，平均為5. 0。聚類分析把這些品種分為6大類和8個亞 類。李宏偉等采用35對小麥EST-SSR標記檢測了 96份小麥材料的遺傳多樣性，共檢測到 129個等位變異位點，其中有87. 6%有多態性。
3. 基因標記與作圖尋找與目標性狀緊密連鎖的分子標記是進行分子輔助選擇育種的基礎。與其它分子標 記相比，基于PCR反應的SSR和EST-SSR標記具有操作簡單，廉價，適合自動化檢測，具有高 重復性，而且大部分具有共顯性和染色體專化的性質，是適合于分子輔助選擇的理想標記。李俊等將川麥47與高感條銹小麥品種臺長29雜交，獲得雜交巳和F2群體；對F2群 體(355株)進行條銹病抗性鑒定和遺傳分析，結果表明，川麥47攜帶一個顯性抗條銹病基 因；利用SSR標記和&分離群體分組分析法研究表明，該抗條銹病基因位于小麥1B染色體 上，與微衛星標記Xgwmll/Xgwm18、 Xgwm273和Xgwm498緊密連鎖，遺傳距離為2. 2、4. 5和 3. 9cM。川麥47可用于分子標記輔助育種，程穎等對貴農21攜帶的條銹病抗性基因進行了 鑒定和遺傳分析，明確了貴農21攜帶一個抗條銹病顯性單基因YrGn21，采用F2代抗病分離 群體和集群分離分析法(BSA)建立了與該基因連鎖的11個微衛星標記，并將YrGn21定位與IBS染色體的近著絲粒區域，與位于IBS染色體的Yr26具有等位性關系，張娜等用定位于2A染色體的59對SSR、 EST-SSR引物對小麥抗葉銹病基因Lr45進行分子標記，用152株&抗感群體對篩選出的ll對多態性引物進一步檢測，得到四個與Lr45共分離的標記，其中將Xgwm95的抗感差異帶和Xgwm47的抗性片段進行克隆測序發現，其中含有微衛星序列，且為二核苷酸重復，Xgwm372和Xgwml22經瓊脂糖凝膠電泳發現，與Lr45供體黑麥有共同的標記片段，可直接用于分子標記輔助選擇，伊靜等利用3個不同的D51F2群體進行抗病反應型鑒定，證明小麥突變體D51的抗稈銹性受一對顯性基因控制，利用675對小麥SSR引物和186株F2分離群體將該基因定位在5DS上，此外，趙軍等利用SSR標記證明小麥品種Grandin的抗白粉病基因即為位于5DS上的Pm基因，馬強等以感白粉病小麥品種MYll與抗白粉病小麥新材料YU25雜交回交的F"&、BC^、BC^群體，對YU25的抗白粉病性進行遺傳分析，結果表明兩個抗白粉病基因PmE (免疫)和PmYU25 (高抗)都是顯性基因，并且利用SSR標記，分別將它們定位在7BS和2DL上，迄今已有決定許多重要小麥性狀的近百個主效基因和一些QTL獲得不同類型的分子標記。
全文摘要
尋找與目標性狀緊密連鎖的分子標記是進行分子輔助選擇育種的基礎。與其它分子標記相比，基于PCR反應的SSR和EST-SSR標記具有操作簡單，廉價，適合自動化檢測，具有高重復性，而且大部分具有共顯性和染色體轉化的性質，是適合于分子輔助選擇的理想標記。
文檔編號C12Q1/68GK101760537SQ20081023858
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月19日 優先權日2008年12月19日
發明者李祥 申請人:李祥