PttKN1基因在碎米薺中的遺傳轉化方法

PttKN1基因在碎米薺中的遺傳轉化方法
【專利摘要】本發明涉及一種PttKN1基因在碎米薺中的遺傳轉化方法，具體包括以下步驟：(1)準備植物材料與載體；(2)采用農桿菌介導的花絮浸染法對碎米薺的轉化；(3)抗性植株篩選和表型觀察；(4)RT-PCR鑒定；(5)針對結果進行分析統計。本發明利用農桿菌介導的花序浸染法對碎米薺進行了遺傳轉化。經100mg/L卡那霉素篩選后，抗性植株表現出子葉形態改變、生長點異常、杯狀葉、缺刻葉和扁莖等形態改變。RT-PCR檢測表明，抗性植株的表型改變可能是由于PttKN1基因的異源表達所引起的。這為進一步研究該基因在復葉的形成和復葉植物發育中的功能奠定了重要基礎。
【專利說明】PttKNI基因在碎米薺中的遺傳轉化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種PttKNl基因在碎米薺中的遺傳轉化方法，屬于生物遺傳【技術領域】。
【背景技術】
[0002]同源異型盒基因(homeobox genes)編碼同源異型盒蛋白，能夠結合各自祀基因的順式調節區域，從而作為轉錄因子在生物的發育過程中扮演重要作用。從酵母、真菌到動植物，同源異型盒基因已經被大量地分離出來并進行了廣泛地研究；并且發現，同源異型盒蛋白在生物的形態建成中發揮著重要作用。
[0003]在植物中第一個被分離的同源異型盒基因是玉米中的KNOTTEDl(ZmKNl)基因，在頂端分生組織(shoot apical meristem, SAM)中發揮作用。ZmKNl獲得性功能突變體/異源表達植株的研究表明，ZmKNl抑制了葉的分化并在葉脈附近形成了瘤狀結構。而功能缺失突變體的研究則表明ZmKNl對于頂端分生組織的形成和維持是必需的。植物中存在多種同源異型盒基因，比如擬南芥中的KNOX(KNOTTEDl-like homeoboxgenes) > WOX (WUSCHEL-like homeobox genes) > BELL (BEL-1 ike homeobox genes)和HD-ZIP (homeodomain Leucine-zipper),它們的編碼蛋白都含有DNA結合的同源結構域。但KNOX基因幾乎存在于所有的單子葉和雙子葉植物中，并且能夠調節所有高等植物頂端分生組織的功能。所以，KNOX基因的作用可能是最古老和保守的分生組織調節方式。
[0004]根據KNOX基因序列的相似性和表達區域的差異性，研究者將它們分為兩類:KNOXI 和KNOXII。擬南芥 中的KNOXI 基因有SH00TMERISTEMLESS (STM) ,KNATl (KNAT =Knottedin Arabidopsis thaliana-also called BREVIPEDICELLUS ;BP)、KNAT2 和 KNAT6 ;ΚΝ0ΧΙΙ基因有KNAT3、KNAT4、KNAT5和KNAT7。其中KNOXI只在分生組織中特異性表達，而KNOXII在所有組織中都表達。雖然KNOXII基因的功能研究還缺乏必要的實驗數據，但它們在發育過程中可能扮演某種未知的功能。
[0005]KNOX基因家族編碼的蛋白是非典型的同源異型盒蛋白，所有的KNOX蛋白都有一個高度保守的非典型的HD區，典型的HD區含有60個氨基酸，而KNOX蛋白的HD區包括63個氨基酸，這就使得HD區在螺旋I與螺旋2之間有三個額外的氨基酸(P-Y-P)。因而，KNOX基因家族又隸屬于TALE (three amino acid loop extension)超基因家族。HD區位于KNOX蛋白的C-末端，參與DNA的結合和同源二聚體的形成。ELK區域位于HD區上游，其功能尚不清楚，但推測該區域參與核信號定位。KNOX蛋白的N端含有約100個氨基酸長度的保守區域,為MEINOX區；該區包含KN0X1和KN0X2兩個區域。其中KN0X1區在KNOX基因異源表達產生表型變化的過程中起重要作用，同時可能對目的基因的轉錄起抑制作用；KN0X2區對于二聚體的形成和轉基因植株異常表型的產生有重要作用。GSE區位于MEINOX和ELK區之間，參與調控蛋白的穩定性；該區域富含脯氨酸(proline, P)、谷氨酸(glutamate, E)、絲氨酸(serine, S)和蘇氨酸(threonine, T)殘基(PEST序列)，該序列可通過泛素介導的水解反應而促進蛋白的降解。[0006]在多數植物中，葉是光合作用、呼吸作用和光感受的主要器官。而萼片、花瓣、雄蕊和心皮等花器官都可以看作是修飾的葉片，因此，了解葉的發育機制對認識種子植物的發育機制至關重要。
[0007]1994年是植物葉發育研究的轉折點。在這一年,Tsukaya等對擬南芥Columbia野生型的子葉發育進行了解剖學分析，并且認定其可以作為葉形態發生研究的模式系統。自此，隨著分子生物學的發展，結合細致的形態分析和傳統的遺傳分析，葉發育調控的分子機理在一些模式植物中取得了顯著的進展。然而，真正取得突破的還是對那些影響葉原基極性尤其是背腹性的突變體和基因的研究。正是由于對這些突變體和基因的研究，使得人們將葉原基極性的建立與頂端分生組織活性緊密的聯系在一起。
[0008]隨著單個基因對葉發育影響的研究，這些基因之間的相互作用及網絡關系成為新的焦點。一批在莖頂端分生組織中通過調控形態發生模式而影響葉型的基因被分離出來。目前的主要工作是搞清楚這些在模式植物中的調控機理是否保守以及在這些機理的作用下如何產生各種各樣的葉片類型。
[0009]葉片的早期發育包括三個主要過程:葉原基的起始，葉片背腹性的建立和葉片的延展。大量的證據表明葉片的發育受到體內遺傳機制和體外環境因子的雙重調節。實驗表明，KNOXI基因對葉的發育有重要作用。在單葉植物中，KNOXI基因在葉中不表達；在復葉植物中，KNOXI基因在葉中表達。但也有例外，在單葉植物Loleracenm中，KNOXI基因就在葉原基中表達，導致了葉片邊緣形成鋸齒形缺刻。Bharathan等調查了 KNOXI基因在各種維管植物的莖頂端分生組織和葉中的表達情況，他們發現KNOXI基因在葉原基發生點被下調。在大多數單葉植物中 ，例如擬南芥、煙草、金魚草和玉米中，這些下調是永久的。然而，在大多數復葉植物中(豌豆除外)，KNOXl基因的表達在發育的葉原基中要進行重建，比如在番茄和酢漿草中就是如此。除此之外，在KNOXI基因過表達的轉基因番茄或者其自然突變體中，小葉數目增加。這就說明KNOXI基因可能通過在發育的葉原基中建立一個處于未分化狀態的環境來參與調節復葉的發育。在豌豆中，KNOXI基因在初始葉原基中的表達被永久的下調，而由FLORICAULA(FLO)/LEAFY(LFY)的同源基因UNIFOLIATA(UNI)作用來控制復葉的發育。
[0010]葉是植物進行光合作用的主要器官，是植物體最富有特征的結構部分之一。葉的組成部分一般由葉片、葉柄和托葉三部分組成。葉原基在發育過程中，其細胞逐漸由原分生組織過渡到初生分生組織。在葉原基形成幼葉的過程中，先是頂端生長，然后是邊緣生長，從而形成葉片、葉柄和托葉幾個區域。葉的發育開始于莖尖分生區的葉原基。葉原基發生于莖尖生長錐的側面，一般由表面的幾層細胞分裂形成最初的突起，接著向長、寬、厚三個方向生長。葉原基形成后，接著下部發育為托葉，上部發育為葉片和葉柄，葉片由葉原基上部經頂端生長，邊緣生長和居間生長形成。葉原基上部的細胞分裂逐漸限于頂端，通過頂端生長使這部分伸長。不久，在其兩側的細胞開始分裂，進行邊緣生長，形成具有背腹性的扁平雛形的葉片；如果是復葉，則通過邊緣生長形成多數小葉片。邊緣生長進行一段時間后，頂端生長停止。當幼葉逐漸由芽內伸出、展開時，邊緣生長停止，這個葉片進行近似平均的表面生長，又稱居間生長。居間生長伴隨著內部組織的分化成熟，隨著葉柄、托葉的形成最后成為成熟葉。
[0011]目前，分離到一些影響葉發育的基因。KNOX基因異位表達導致轉基因的葉子皺縮、產生缺刻、中脈縮短等表型。有證據表明這群基因通過調節激素水平對葉發育產生影響。無論在單葉或復葉植物中，GA是KONX基因的拮抗物。一種假說認為在分生組織中KNOX基因抑制GA的合成，從而使細胞體積不增大且處于不分化狀態。細胞和葉發育后期的細胞中，GA合成增加，導致細胞體積增大和分化。擬南芥中CUPSHAPED COTYLEDON (CUC)基因是KNOX基因的正向調節因子。cue突變體類似stm突變體，不能形成胚性分生組織，比stm突變體形成更多的子葉融合。35S::⑶C導致STM基因表達強度的增強，且形成異位分生組織。NAP(No Apical Meristem)基因家族導致莖頂端分生組織的大小改變,調節莖頂端分生組織中的細胞分裂與細胞分化之間的平衡。MGO(MAGOUN)基因使葉數量減少。TERMEINALEAR導致異常的葉起始和發育，形成不規則的葉序。PHANTASTICA基因調控葉的近軸面發育。YABBY和KANADI基因調節葉的遠軸面細胞發育，KANADI可能作為YABBY的上游基因起作用。
[0012]對于模式植物的研究表明許多基因控制著植物的生長和發育。種子植物的莖頂端分生組織維持其自身的不分化狀態，并產生葉和花器官。在莖頂端分生組織的不同發育階段都有一套基因控制著生殖生長和營養生長的不分化狀態。當器宮的原始細胞由不分化狀態轉變為分化狀態時，葉和花開始發育。通過比較發育中單葉和復葉的基因表達差異，可能找到決定葉片形狀的基因。
[0013]KNOXI基因使莖頂端分生組織處于不分化狀態。KNOXI基因的下調使分生細胞由不分化狀態轉化為分化的葉原基。功能缺失突變體，異位表達及過表達的轉基因植物證實了這一點。如擬南芥中KNOXI基因STM和玉米中KNI的功能缺失突變，導致植物不能維持其莖頂端分生組織。玉米中KNOXI基因的異位表達在葉脈上產生結節。轉基因植株過量表達KNOXI基因時通常產生卷曲、皺縮、深裂的葉片，有時能產生異位分生組織。STM的異位表達阻止了葉片細胞的分化，激活GI/S的細胞周期，同時激活了一個CyelinB::⑶S報告基因。因而，KNOXI基因 在分生組織內部及外部的表達促進了干細胞的增殖和維持。
[0014]在單葉和復葉植物的葉原基中，KNOXI基因不表達。在多數單葉植物中，如擬南芥、煙草、金魚草、玉米，這種不表達是持久的。但在多數復葉植物中，隨著葉芽的發育，KNOXI基因又有表達(豌豆除外)，如番茄和酢漿草。KNOXI基因在番茄中過量表達導致番茄的小葉數目增加。有推論說KNOXI基因在復葉的葉芽發育中建立了一個不分化的環境。
[0015]番茄PHAN基因在莖頂端分生組織表達，而PHAN基因家族的成員在單葉植物的分生組織中不表達。這表明KNOX基因和其調節因子的相互作用要遠比單葉植物復雜。
[0016]在復葉植物豌豆中，KNOXI基因在葉的原始細胞中不表達，在葉的發育過程中也沒有發現KNOXI 基因的重新表達。相反的，UNIFOLIIATA(UNI)，FLORICAULA(FLO)/LEAFY(LFY)的同源物，在豌豆中控制著復葉的發育。FL0/LFY同源物編碼一組植物特異性轉錄因子。uni突變體的也得復雜性降低。野生型豌豆葉片通常具2-3對小葉，3-4對卷須，一個終端卷須。uni突變體為單葉或三個葉片除了改變葉的形態外,豌豆uni突變體花的發育也受影響。花期延遲，若能產生花，有完整的萼片和心皮，不育。FL0/LFY在莖頂端分生組織，葉原基，花的分生組織中表達；但在單葉植物，如擬南芥和矮牽牛中，這類基因的突變體并不能引起葉片形態的改變。這表明FL0/LFY同源物在單葉植物中的作用主要在生殖發育中，并不影響葉的發育。然而FL0/LFY同源物在營養器官的莖尖表達，所以他們的作用還不能很好的解釋。
[0017]番茄的FL0/LFY同源物是FALSIFLORA (FA)。像其它被子植物一樣，番茄fa突變體花期和花序都改變。在這種突變體中，花的分生組織缺失，花被次生生長的芽代替。fa突變體葉片很小，小葉數目下降，葉的復雜性降低。在復葉植物如豌豆、番茄、葡萄、嬰粟的葉的發育過程中，FLO/LFY的表達延長伴隨葉緣的器官發生。FLO/LFY在營養和花的分生組織的發育中的作用表明復葉的發育可能使由KNOXI和FL0/LFY基因共同調節的。在豌豆中，KNOXI基因對復葉發育的調控可能被FL0/LFY同源物UNI代替。所以，FL0/LFY在調控被子植物復葉發育中所起的作用還有待進一步研究。
[0018]STAMINA PISTILLOISA(STP)也是一種花分生組織基因，在豌豆中調節復葉的發育。嚴重的stp突變體和uni突變體的表型相似:花包括萼片和心皮，葉片復雜輕度降低，及其它一些異常。輕微的stp突變體和uni突變體在豌豆中相互協作，表明這兩個基因可能共同調節同一途徑。STP和擬南芥中UNUSUAL FLORAL ORGANS(UFO)及金魚草中FIMBRIATA(FIM)基因是同源物。擬南芥中UFO的過量表達導致葉片產生缺刻，和KNOXI基因的過量表達的表型相同。
[0019]植物生長調節劑是在植物生長和發育等許多方面起調節作用的一類小分子物質。植物生長調節劑如赤霉素、細胞分裂素、生長素等在控制葉的形態方面起作用。分生組織基因如KNOXI和FL0/LFY可能調節植物激素的含量并和激素網絡相互作用。如KNOXI基因異位表達的表型和細胞分裂素過表達的表型相似。另外，KNOXI基因過量表達可以刺激細胞分裂素的合成。
[0020]同樣的，內源細胞分裂素過多導致KNOXI和STM基因表達水平升高。此外，KNOX基因過量表達也可改變其它植物生長調節劑的含量。在煙草中過量表達水稻中KNOX基因OSHI時，輕度轉基因植株中IAA含量降低，而在輕度和嚴重的轉基因植株中ABA含量都大幅度增加。KNOX基因調控細胞分裂素，生長素，ABA含量的機制還不清楚。
[0021]KNOX基因對GA含量的調控研究的較為清楚。研究表明KNOXI基因在不同植物中的異位表達導致赤霉素水平的降低。GA含量的降低與葉片形態的改變及植株矮化相關，而外源GA的施用能使這些表型逆轉。GA含量的降低和GA20氧化酶基因被抑制有關，表明KNOX基因的過量表達通過影響GA合成途徑來調節GA含量。Sakamoto et al的研究發現煙草KNOX蛋白NTH15與GA20氧化酶基因Ntcl2結合，并抑制其轉錄，GA20合成酶基因是GA合成中的重要酶。Ntcl2序列突變后不能和NTH15結合NTH15蛋白抑制了 Ntcl2::LUC在SAM中的表達，表明KNOX蛋白能直接調節GA在SAM中的合成。擬南芥和番茄中的KNOXI基因也可抑制GA20合成酶。所以KNOXI基因的一個作用是在分生組織中抑制GA的合成。
[0022]PttKNl (Populus tremulaX tremuloides KN0TTED1)基因是發明人與瑞典歌德堡大學 ol 1f ο I 1son 教授等合作,從一種雜交楊(Populus tremulaXP.tremuloides)莖的維管束形成層中分離的一個與KNI基因同源的基因。初步研究發現，PttKNl基因含有1104個核苷酸組成的開放閱讀框(ORF)，其編碼蛋白含有368個氨基酸，含有KNI家族成員所共有的5種結構域，即KN0X1、KN0X2、GSE、ELK和HD。在PttKNl同源異型結構域(HD)的兩個螺旋之間含有3個額外的氨基酸，這種HD是KNI家族基因編碼蛋白的典型特征，是DNA特異性序列的結合位點。因此，PttKNl基因屬于KNOXI基因家族，可能作為轉錄因子發揮作用。[0023]為了進一步研究PttKNl基因的生物學功能，Olssen研究小組把PttKNl基因融合在35S強啟動子后，通過遺傳轉化導入擬南芥中。這些擬南芥轉基因植株的典型特征為:葉片淺裂或深裂、葉片上形成異源的分生組織和小葉，解剖學分析發現，葉片缺少柵欄細胞，另外轉基因植株改變了葉脈的脈序，子葉，葉片，萼片和花瓣的脈序均有不同程度的改變，所有這些表型改變的程度依賴于蛋白的表達劑量。
[0024]PttKNl基因在矮牽牛中的異源表達導致了一系列的表型變化，產生葉片變小，葉面皺縮，葉緣缺刻，無葉柄，葉片上產生異位分生組織，花冠變小，花瓣扭曲，花瓣之間出現深裂，花瓣上出現瘤狀突起和刺狀突起，花瓣著色加深等表型。這些表型的變化可能是由于PttKNl基因參與到植物激素的合成與代謝中引起的。而該基因在煙草中的異源表達也導致了缺刻葉和異源分生組織的產生；并且使葉脈的脈序紊亂，這說明PttKNl基因在植株的形態發育和維管組織的形成中發揮一定的作用。
[0025]PttKNl基因表達分析表明，PttKNl基因高度表達于莖頂端分生組織，同時也表達在韌皮部，形成層和木栓形成層，及分生組織和未分化的細胞中，但不能在楊樹幼嫩和成熟葉片中檢測到。這些結果表明，PttKNl基因的功能可能涉及到莖頂端分生組織和微管形成
層的發育。

【發明內容】

[0026]本發明的目的在于提供一種PttKNl基因在碎米薺中的遺傳轉化方法，以便研究PttKNl基因在碎米薺中的遺傳轉化過程中的作用，為基因遺傳轉化提供參考依據。
[0027]為了實現上述目的，本發明的技術方案如下。
[0028]一種PttKNl基因在碎米薺中的遺傳轉化方法，具體包括:
[0029](I)準備植物材料與載體:將春化過的碎米薺種子種于蛭石:泥炭土:珍珠巖按照1:1:1的混合基質中，覆保鮮膜，兩天后光照，三天后揭膜；選取生長健壯，有較多未開放花蕾的碎米薺植株備用；培養條件:相對濕度80%，恒溫20~24°C，光照強度80~200 μ mo I/M2S, 16h 光照培養。
[0030](2)采用農桿菌介導的花絮浸染法對碎米薺的轉化:采用花序浸染法對碎米薺進行遺傳轉化；首先挑取單菌落，接種于YEB+25mg/LKm+75mg/LCb液體培養基中，于27°C、180rpm培養過夜；將菌液倒入無菌帶蓋離心管內，蓋上蓋子，用石臘膜封口，4000rpm于室溫下離心10分鐘；棄上清，用無菌1/2MS液體培養基(含5mg/L BA或/和0.01% SilwetL-77)稀釋菌體至0D_為0.3 ;在開花期，將未開放花序浸入裝有上述液體的I升塑料燒杯中，浸泡5min ;然后用黑色塑料袋套住花序保濕，24h后去袋，恢復正常光照培養；生長3~5周以后收種。
[0031](3)抗性植株篩選和表型觀察:將收取的碎米薺種子先在4°C下春化48h，再分別用70%乙醇浸泡Imin, 0.1%升萊浸泡8min,無菌蒸懼水沖洗三次；然后接種于含有IOOmg/L卡那的MS培養基上，于25°C下光照培養；45天左右，將具有卡那霉素抗性的碎米薺植株移栽到蛭石:泥炭土:珍珠巖按1:1:1的混合基質中，并覆蓋塑料薄膜以保持相對濕度，弱光生長2-3天后讓其在自然條件下生長；對各時期植株的表型仔細觀察比較，并用CanonPowershot A610相機照相，用Photoshop CS2進行處理排版。
[0032] (4)RT_PCR鑒定:稱取0.1g葉片，于液氮中充分冷凍后研磨后移入2ml離心管中，加入1ml Trizol (Invitrogen),震蕩混勻，室溫下靜置5分鐘;再加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15秒，室溫下靜置2分鐘后于4°C，12000g離心15分鐘；取上清，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫下靜置10分鐘后于4°C，12000g離心10分鐘；棄上清，加入lml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀后于4°C，7500g離心5分鐘；棄上清，室溫下吹干，加入20 μ I DEPC (焦碳酸二乙酯)水溶解沉淀，_70°C凍存。
[0033]根據KNOX基因保守區設計引物，Pl:5’~GCTGCTCGTCAAGAGTTTGG~3’和P2:5’~AATCTCAGGTAGTTCAGTCTCCC~3’，由Takara公司合成，引物間序列長度為311bp。
[0034]以Trizol法提取的總RNA為模板，利用One Step RNA PCR Kit進行PCR反應。反應體系為 25μ 1，包括 12.5μ L2XRT-PCR Buffer, 2 μ LRNA, Ρ1、Ρ2 各 I yL(10ymol/L)，0.5 μ LRT~Taq Mix, 8 μ LRNase Free ddH20。將該反應混合物短暫離心至管底，于Mastercycler gradient PCR 儀(Eppendorf)上進行反應。反應程序為 37°C反轉錄 45min,94°C預變性2min，94°C變性15s，55 °C退火30s，72 °C延伸lmin，35個循環后72 °C保溫IOmin0反應產物用1%瓊脂糖(BBI)凝膠(含0.5 μ g/mlEB)電泳，凝膠成像系統照相。
[0035](5)針對結果進行分析統計:抗性植株的篩選:待浸染過的碎米薺成熟后，收取種子。將其接種于含有100mg/L卡那霉素的篩選性培養基上。萌發后，不具有卡那抗性的植株逐漸黃化，枯萎；而具有卡那抗性的植株則仍然保持綠色，但生長緩慢。將在篩選培養基上生長一個月后仍然成活的植株移栽到蛭石:泥炭土:珍珠巖(1:1:1)的混合基質中，進行形態觀察和后續分析，針對抗性植株進行形態觀察和RT-PCR分析。
[0036]該發明的有益效果在于=PttKNl基因是從雜交楊莖的維管束形成層中分離得到的一個KNOXI基因，可能在莖頂端分生組織的形成和維持中發揮重要作用。本發明利用農桿菌介導的花序浸染法對碎米薺進行了遺傳轉化。經100mg/L卡那霉素篩選后，抗性植株表現出子葉形態改變、生長點異常、杯狀葉、缺刻葉和扁莖等形態改變。RT-PCR檢測表明，抗性植株的表型改變可能 是由于PttKNl基因的異源表達所引起的。這為進一步研究該基因在復葉的形成和復葉植物發育中的功能奠定了重要基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1是本發明實施例中轉基因植株的RT-PCR分析圖。
[0038]圖中標記說明:M-marker ;1_野生型；2_子葉缺刻；3_生長點異常；4_杯狀葉；5-缺刻葉；6_扁莖。
【具體實施方式】
[0039]下面結合實施例對本發明的【具體實施方式】進行描述，以便更好的理解本發明。
[0040]實施例
[0041]本實施例的PttKNl基因在碎米薺中的遺傳轉化方法，具體包括:
[0042](I)準備植物材料與載體:將春化過的碎米莽(Cardamine hirsuta)種子種于蛭石:泥炭土:珍珠巖(1:1:1)的混合基質中，覆保鮮膜，兩天后光照，三天后揭膜。選取生長健壯，有較多未開放花蕾的碎米薺植株備用。培養條件:相對濕度80%，恒溫20~24 0C，光照強度80~200 μ mo I/M2S, 16h光照培養。含有pPCV702質粒載體的農桿菌菌株GV3101由瑞典歌德堡大學的Olf Olsson博士惠贈。pPCV702包含一個CaMV35S啟動子和一個新霉素磷酸轉移酶基因；PttKNI基因融合在CaMV35S啟動子的下游。
[0043](2)采用農桿菌介導的花絮浸染法對碎米薺的轉化:采用花序浸染法對碎米薺進行遺傳轉化。首先挑取單菌落，接種于YEB+25mg/LKm+75mg/LCb液體培養基中，于27°C、180rpm培養過夜；將菌液倒入無菌帶蓋離心管內，蓋上蓋子，用石臘膜封口，4000rpm于室溫下離心10分鐘；棄上清，用無菌1/2MS液體培養基(含5mg/L BA或/和0.01% SilwetL-77)稀釋菌體至OD_為0.3 ;在開花期，將未開放花序浸入裝有上述液體的I升塑料燒杯中，浸泡5min ;然后用黑色塑料袋套住花序保濕，24h后去袋，恢復正常光照培養；生長3~5周以后收種。
[0044](3)抗性植株篩選和表型觀察:將收取的碎米薺種子先在4°C下春化48h，再分別用70%乙醇浸泡Imin, 0.1 %升萊浸泡8min,無菌蒸懼水沖洗三次。然后接種于含有IOOmg/L卡那的MS培養基上，于25 °C下光照培養。45天左右，將具有卡那霉素抗性的碎米薺植株移栽到蛭石:泥炭土:珍珠巖(1:1:1)的混合基質中，并覆蓋塑料薄膜以保持相對濕度，弱光生長2-3天后讓其在自然條件下生長。對各時期植株的表型仔細觀察比較，并用Canon Powershot A610相機照相，用Photoshop CS2進行處理排版。
[0045](4)RT_PCR鑒定:稱取0.1g葉片，于液氮中充分冷凍后研磨后移入2ml離心管中，加入1ml Trizol (Invitrogen),震蕩混勻，室溫下靜置5分鐘;再加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15秒，室溫下靜置2分鐘后于4°C，12000g離心15分鐘。取上清，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫下靜置10分鐘后于4°C，12000g離心10分鐘。棄上清，加入lml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀后于4°C，7500g離心5分鐘。棄上清，室溫下吹干，加入20 μ I DEPC (焦碳酸二乙酯)水溶解沉淀，_70°C凍存。
[0046]根據KNOX基因保守區設計引物，Pl:5’~GCTGCTCGTCAAGAGTTTGG~3’和P2:5’~AATCTCAGGTAGTTCAGTCTCCC~3’，由Takara公司合成，引物間序列長度為311bp。
[0047]以Trizol法提取的總RNA為模板,利用One Step RNA PCR Kit (購自于Generay公司)進行 PCR 反應。反 應體系為 25 μ 1，包括 12.5 μ L2 X RT-PCR Buffer, 2 μ LRNA, PUΡ2 各 I μ L (10 μ mol/L)，0.5 μ LRT ~Taq Mix, 8 μ LRNase Free ddH20。將該反應混合物短暫離心至管底，于Mastercycler gradient PCR儀(Eppendorf)上進行反應。反應程序為37°C反轉錄 45min，94°C預變性 2min，94°C變性 15s，55°C退火 30s，72°C延伸 lmin，35 個循環后72°C保溫lOmin。反應產物用1%瓊脂糖(BBI)凝膠(含0.5 μ g/mlEB)電泳，凝膠成像系統照相。
[0048](5)針對結果進行分析統計:
[0049](5a)抗性植株的篩選:待浸染過的碎米薺成熟后，收取種子。將其接種于含有100mg/L卡那霉素的篩選性培養基上。萌發后，不具有卡那抗性的植株逐漸黃化，枯萎；而具有卡那抗性的植株則仍然保持綠色，但生長緩慢。將在篩選培養基上生長一個月后仍然成活的植株移栽到蛭石:泥炭土:珍珠巖(1:1:1)的混合基質中，進行形態觀察和后續分析。
[0050](5b)抗性植株的形態觀察:
[0051]野生型碎米薺高15~35cm，子葉卵圓形，對生。基生葉具葉柄，有小葉2~5對，頂生小葉腎形或腎圓形，邊緣有3~5圓齒，小葉柄明顯，側生小葉卵形或圓形，較頂生的形小，基部楔形而兩側稍歪斜，邊緣有2~3圓齒。莖直立或斜升，分枝或不分枝。莖生葉具短柄，有小葉3~6對，生于莖下部的與基生葉相似，生于莖上部的頂生小葉菱狀長卵形，頂端3齒裂。總狀花序生于頂端，花小，花瓣白色，倒卵形。[0052]在抗性碎米薺植株中，子葉的形態發生了明顯的變化。包括子葉扭曲、子葉大小不對等，一片子葉明顯加厚、子葉缺刻、子葉退化和子葉數目變化等。
[0053]除此之外，部分轉基因植株的顏色也由野生型的綠色變為墨綠色、一個葉柄上著生兩個葉片、葉片頂端出現深裂、葉片變為杯狀葉。
[0054]同時，觀察到抗性植株生長點異常，由野生型的一個形成兩個生長點，或有雙胚現象，即一粒種子產生兩個植株，這兩個植株共用一個根，或形成扁莖。還有部分抗性植株的果莢由野生型的長角果線形變得更短、更扁；兩者的種子都呈橢圓形，但是轉基因植株的種子排列方式與野生型相比發生了變化，野生型種子呈I行排列，而轉基因植株的種子則呈兩行排列，顯得更為密集，但種子的數量沒有發生明顯減少。
[0055]這些形態改變主要表現為子葉形態改變、生長點異常、杯狀葉、缺刻葉和扁莖等。它們與野生型植株性狀完全不同，在野生型植株中也未觀察到相關改變。
[0056]RT-PCR 分析:
[0057]為研究上述表型變化是否由PttKNl基因的異源表達引起，分別取上述五種類型的抗性植株，進行RT-RCR分析。結果顯示，這五種類型植株的RT-RCR產物在凝膠電泳時都可以觀察到一條300bp左右的特征條帶，而在野生型植株中，無任何特異條帶出現，參見圖1o
[0058]在農桿菌浸染之后得到的碎米薺種子不僅能夠在含有卡那霉素的篩選性培養基上萌發和生長，并且在移栽后表現出不同于野生型植株的一些表型變化。諸如子葉缺刻，生長點異常，杯狀葉，缺刻葉和扁莖等。RT~PCR分析表明，這些改變可能是由于PttKNl基因的異源表達引起的。鑒于PttKNl基因在碎米薺中的表達可以引起轉基因植株的多種形態變化，我們推測，PttKNl基因可以作為轉錄因子作用調節眾多的下游基因。
[0059]在得到的諸多轉化植株中，觀察到許多有價值的表型，將其分為如下幾類:(I)子葉的變化包括形態、數目及葉序的改變，如子葉融合、缺刻、子葉大小不對等和子葉下著生異源分生組織等表型；(2)植株顏色的變化，如紅葉甜菜由野生型紅莖紅葉變為黃莖綠葉；
(3)植株形態的改變，包括莖結構、數目、形狀等的改變，如節間距縮短植株矮化、三輪葉序彩葉草的六棱柱莖、扁莖、次級莖和主莖(包括花序莖)顯著增多等；(4)真葉形態的改變，包括葉片皺縮、凹凸不平、極性消失、葉脈紊亂，成熟葉的主脈上再生葉片、葉片邊緣或頂端產生缺刻、葉片主脈一分為二葉片也隨之裂開等表型。
[0060]在這些轉基因植株中，多數表現出和KNOX I基因異源表達植株相似的性狀，如葉片相關的形態改變 、花冠缺刻、植株矮化等；這些都體現了 PttKNl基因作為KNOX I基因家族的一員所表現出來的對側生器官發育的影響。
[0061]以上所述是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種PttKNl基因在碎米薺中的遺傳轉化方法，其特征在于:具體包括以下步驟: (1)準備植物材料與載體:將春化過的碎米薺種子種于蛭石:泥炭土:珍珠巖按照1:1:1的混合基質中，覆保鮮膜，兩天后光照，三天后揭膜；選取生長健壯，有較多未開放花蕾的碎米薺植株備用；培養條件:相對濕度80%，恒溫20~24°C，光照強度80~.200 μ mo I/M2S, 16h 光照培養； (2)采用農桿菌介導的花絮浸染法對碎米薺的轉化:采用花序浸染法對碎米薺進行遺傳轉化；首先挑取單菌落，接種于YEB+25mg/LKm+75mg/LCb液體培養基中，于27°C、180rpm培養過夜；將菌液倒入無菌帶蓋離心管內，蓋上蓋子，用石蠟膜封口，4000rpm于室溫下離心10分鐘；棄上清，用無菌1/2MS 液體培養基(含5mg/L BA或/和0.01% Silwet L-77)稀釋菌體至OD6tltl為0.3 ;在開花期，將未開放花序浸入裝有上述液體的I升塑料燒杯中，浸泡5min ;然后用黑色塑料袋套住花序保濕，24h后去袋，恢復正常光照培養；生長3~5周以后收種； (3)抗性植株篩選和表型觀察:將收取的碎米薺種子先在4°C下春化48h，再分別用70%乙醇浸泡Imin, 0.1 %升萊浸泡8min,無菌蒸懼水沖洗三次；然后接種于含有100mg/L卡那的MS培養基上，于25°C下光照培養；45天左右，將具有卡那霉素抗性的碎米薺植株移栽到蛭石:泥炭土:珍珠巖按1:1:1的混合基質中，并覆蓋塑料薄膜，弱光生長2-3天后讓其在自然條件下生長；對各時期植株的表型仔細觀察比較，并用照相； (4)RT-PCR鑒定:稱取0.1g葉片，于液氮中充分冷凍后研磨后移入2ml離心管中，加入Iml Trizol (Invitrogen),震蕩混勻，室溫下靜置5分鐘;再加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15秒，室溫下靜置2分鐘后于4°C，12000g離心15分鐘；取上清，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫下靜置10分鐘后于4°C，12000g離心10分鐘；棄上清，加入lml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀后于4°C，7500g離心5分鐘；棄上清，室溫下吹干，加入20 μ IDEPC (焦碳酸二乙酯)水溶解沉淀，_70°C凍存； 根據KNOX基因保守區設計引物，Pl:5，~GCTGCTCGTCAAGAGTTTGG~3，和P2:5，~AATCTCAGGTAGTTCAGTCTCCC~3’，由Takara公司合成，引物間序列長度為311bp ； 以Trizol法提取的總RNA為模板，利用One Step RNA PCR Kit進行PCR反應；反應體系為 25 μ 1，包括 12.5 μ L2XRT-PCR Buffer, 2 μ LRNA, PU Ρ2 各 lyL(10ymol/L)，0.5yLRT~Taq Mix, 8 μ LRNase Free ddH20 ;將該反應混合物短暫離心至管底，于Mastercycler gradient PCR 儀(Eppendorf)上進行反應；反應程序為 37°C反轉錄 45min,94°C預變性2min，94°C變性15s，55 °C退火30s，72 °C延伸lmin，35個循環后72 °C保溫10min ;反應產物用1%瓊脂糖(BBI)凝膠(含0.5 μ g/mlEB)電泳，凝膠成像系統照相； (5)針對結果進行分析統計:抗性植株的篩選:待浸染過的碎米薺成熟后，收取種子；將其接種于含有100mg/L卡那霉素的篩選性培養基上；將在篩選培養基上生長一個月后仍然成活的植株移栽到蛭石:泥炭土:珍珠巖(1:1:1)的混合基質中，進行形態觀察和后續分析，針對抗性植株進行形態觀察和RT-PCR分析。
【文檔編號】A01H5/00GK103952436SQ201410098358
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年3月18日 優先權日:2014年3月18日
【發明者】徐全樂, 郭瑞軍, 胡鑫 申請人:西北農林科技大學