一種獼猴桃自然雜交種質的發掘與新品種培育方法
【專利摘要】本發明公開了一種獼猴桃自然雜交種質的發掘與新品種培育方法，涉及植物遺傳育種和生物【技術領域】。本方法是：①調查獼猴桃屬植物自然重疊分布區物種混生居群的分布情況并采集樣本；②利用分子標記分析輔助定位雜交帶居群；③采集雜交帶的種質并在育種園中進行人工馴化；④對人工馴化獲得的優株或優系進行品評和大面積區試；⑤注冊申請新品種。本發明相比傳統的人工雜交育種可以大大縮短育種年限；縮減了目標雜交種質發掘的地理區域，可以克服傳統獼猴桃自然種質利用中的盲目性和隨機性；可以篩選馴化出傳統人工育種所不能預期得到的奇異種質；也不存在生物安全性問題。
【專利說明】一種獼猴桃自然雜交種質的發掘與新品種培育方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物遺傳育種和生物【技術領域】，尤其涉及一種獼猴桃自然雜交種質的發掘與新品種培育方法。具體涉及獼猴桃屬植物不同物種間自然重疊分布區種質資源的遺傳評價，利用分子標記技術輔助種內(間)自然雜交帶居群的定位，優異自然雜交種質的發掘和人工育種園栽培馴化，以及最后的新品種培育和發布。
【背景技術】
[0002]獼猴桃(Actinidia Lindl.)是一種20世紀初開始人工馴化栽培的水果，至今僅有100余年的歷史。獼猴桃以其獨特的風味，富含維生素C、膳食纖維、多種礦物質營養和清腸健胃等功效而得到廣泛青睞，成為新興水果的典型代表之一。自1904年新西蘭從中國引種獼猴桃并于1930年建立第一個栽培果園以來，獼猴桃人工栽培迅速擴大。20世紀70年代末，獼猴桃商業化栽培在全國展開，迄今全球栽培面積達到15.8萬公頃，年產量達180萬噸之多(Bolrose, Inc.2011.World kiwifruit review.A Publicat1n of Belrosej Inc.)。我國是世界商業獼猴桃的產銷大國，目前中國獼猴桃的栽培面積約7.0萬公頃，占世界栽培總面積的約44%，已經遠遠超過了意大利、新西蘭和智利。在全球獼猴桃的總產量中，我國年產量約50萬噸，占27.8%，成為世界最大的生產國。
[0003]盡管如此，目前我國及世界獼猴桃產業仍然存在品種單一老化、大多數品種的適應性和抗病抗逆性差和果實品質參差不齊等問題，嚴重阻礙了獼猴桃產業的健康和可持續發展，培育高產優質甚至奇異獨特的獼猴桃新品種仍然是當前獼猴桃產業發展的關鍵。
[0004]我國是獼猴桃屬植物的分布中心和野生資源大國。在獼猴桃屬植物54個物種中，除了尼泊爾獼猴桃和白背葉獼猴桃為周邊國家特有外，其他的絕大多數物種為中國特有。根據我國獼猴桃的地理分布，整體上可以劃分為六大區域:西南地區(云南、貴州、四川西部和南部、西藏)、華南地區(廣東、海南、廣西和湖南南部)、華中地區(湖北、四川東部、重慶、湖南西部、河南南部和西南部、甘肅南部、安徽和陜西南部)、華東和東南地區(江蘇、浙江、江西、福建和臺灣)、華北地區(河北、山東、山西、北京和天津)和東北地區(遼寧、吉林和黑龍江)等。其中，每一個區域中都存在不同類型獼猴桃物(變)種的廣泛自然重疊分布:例如華中地區包括了中華獼猴桃、美味獼猴桃、湖北獼猴桃、漓江獼猴桃、大花獼猴桃和毛葉硬齒獼猴桃等多個物種的重疊分布；而華南區則主要包括了毛花獼猴桃、闊葉獼猴桃、黃毛獼猴桃和安息香獼猴桃等類群的重疊分布。由于獼猴桃屬植物是典型的雌雄異株多年生植物，極易產生種間(內)雜交并形成網狀進化。因此，獼猴桃物種的自然重疊分布區提供了大量的機會供其產生自然雜交漸滲，從而極具潛力孕育出性狀特征各異且適應性強的優異獼猴桃遺傳種質。然而，迄今為止，仍然缺乏對這些獼猴桃重疊分布區的自然雜交帶進行有效識別定位的方法，從而較大程度地阻礙了對其優異雜交種質的發掘利用。
[0005]人工雜交育種技術廣泛應用于現代農業作物的遺傳育種中。相比傳統育種技術，雜交育種可充分利用雜交優勢帶來的好處，在增加農作物的產量品質和抗病抗逆性上具有不可替代的作用。對于獼猴桃，其較長的生長周期和復雜的生物學特性使得人工雜交耗時費力且往往得不到期望的結果。相反，獼猴桃自然雜交種質經過千百年的自然雜交漸滲和適應性進化，往往具有更加多樣化的農藝特征性狀和抗病抗逆性，對這些資源進行充分的發掘利用是現代獼猴桃遺傳育種的重要方向之一。雖然目前發布的部分獼猴桃栽培品種也直接或者間接來源于自然種質資源，但前期的發掘工作具有很大的隨機性和盲目性，并沒有形成系統完整的方法供后續獼猴桃遺傳育種利用，特別是對于自然雜交種質資源的發掘利用，仍缺乏方便快捷且行之有效的方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種獼猴桃自然雜交種質的發掘與新品種培育方法。
[0007]本發明的目的是這樣實現的:
[0008]一、方法
[0009]通過對不同獼猴桃自然重疊分布區種質進行居群遺傳評價和分子標記輔助雜交帶居群定位，縮小優異種質發掘的目標范圍，在此基礎上，結合傳統的育種園人工培育馴化和進一步的篩選，形成可商業化利用的獼猴桃新品種。
[0010]其技術方案包括獼猴桃屬植物自然重疊分布區物種混生居群調查和樣本采集，基于分子標記分析輔助雜交帶居群定位，雜交種質采集和育種園馴化，雜交優(株)系的品評區試和新品種發布。
[0011]具體地，本方法包括下列步驟:
[0012]①調查獼猴桃屬植物自然重疊分布區物種混生居群的分布情況并采集樣本；
[0013]②利用分子標記分析輔助定位雜交帶居群；
[0014]③采集雜交帶的種質并在育種園中進行人工馴化；
[0015]④對人工馴化獲得的優株或優系進行品評和大面積區試；
[0016]⑤注冊申請新品種。
[0017]二、應用
[0018]基于該方法的應用:篩選培育出各類獼猴桃自然雜交種質優株十多份，其中優株7-11-4，區試表明該優株果實品質綜合性狀突出，如平均果重可達75-85g、果肉黃色、肉質細嫩、風味酸甜適口等，且具有玫瑰紅色花、花期早，抗逆性強等特點，是兼具觀賞和鮮食于一體的優異自然雜交種質。在區試穩定的基礎上，對7-11-4優株進行了省級林木品種審定和農業部新品種保護。
[0019]本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果:
[0020]①相比傳統的人工雜交育種可以大大縮短育種年限；
[0021 ] ②縮減了目標雜交種質發掘的地理區域，可以克服傳統獼猴桃自然種質利用中的盲目性和隨機性；
[0022]③充分利用獼猴桃自然雜交的復雜性、隨機性和創造性，可以篩選馴化出傳統人工育種所不能預期得到的奇異種質；
[0023]④育種園人工馴化和區試僅用于鑒定優異株系相應特征性狀的穩定性，而不涉及任何人工遺傳修飾，可以最大程度地保持自然雜交種質豐富的遺傳基礎，相應的新品種發布也不存在生物安全性問題。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為本方法流程圖；
[0025]圖2為基于該方法篩選出的雜交種質優株‘7-11-4’的結果狀圖；
[0026]圖3為基于該方法篩選出的雜交種質優株‘7-11-4’的花形態圖；
[0027]圖4為基于該方法篩選出的雜交種質優株‘7-11-4’的果實剖面圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結合附圖和實施例詳細說明:
[0029]一、方法
[0030]1、如圖1步驟①調查獼猴桃屬植物自然重疊分布區物種混生居群的分布情況并采集樣本，主要是根據現有的中國獼猴桃屬植物的六大地理分布區域，依據不同物種的地理分布和資源調查確定主要的物種混生居群(> 2個物種或者變種)，物種的鑒定依照國際通用的稱猴桃 UPOV(Un1n for the Protect1n of New Varieties of Plants, http://www.upov.1nt/genie/en/details, jsp ? id = 101)描述指標。在每個主要調查的地理區域內篩選10個以上的混生居群共后續的分子標記遺傳分析和雜交帶識別。混生居群的代表性樣本采集方式為:每個居群采集30份以上的樣本，且涵蓋該居群混生的所有物種類群，其中每個物種至少5份以上。
[0031]具體的實施例內容:基于我國獼猴桃屬植物的6個主要地理分布區域(西南地區、華南地區、華中地區、華東南地區、華北地區和東北地區)，根據獼猴桃屬植物的每個物種的分布范圍，確定相應的主要物種重疊分布區和多物種混生居群。本實施例共確定多物種混生居群(分布區)40個，分布區涵蓋華中地區、華南地區和西南地區。基于獼猴桃UPOV標準相關于果實、葉片和枝條的15個易觀察形態描述特征，總共鑒定出涉及這些混生的物(變)種數為10個，包括中華獼猴桃變種、美味獼猴桃變種、毛花獼猴桃、闊葉獼猴桃、京梨獼猴桃、黃毛獼猴桃、金花獼猴桃、軟棗獼猴桃、黑蕊獼猴桃和大籽獼猴桃。在所確定的這些混生居群中，每個居群至少混合分布2種不同的獼猴桃，居群最多混生的獼猴桃物種數為5種。
[0032]對所確定的40個混生居群進行代表性樣本的采集，每個居群采集樣本至少30份，同時對單一居群涉及到的物種，每個物種至少保證5個代表性的樣本。本實施例的樣本采集在所調查年的8-10月份完成，此段時間果實等形態特征最清晰，物種易于辨認區分。總共40個居群采集代表性樣本1500份，平均每個混生居群采集樣本37.5份。根據植物自然雜交帶分布的潛在規律(單峰或雙峰模型)，每個混生居群中的采樣依據一定的線性軌跡隨機采集。樣本的采集主要用于分子標記遺傳分析。利用全球衛星定位系統對每一個采集的樣本進行經緯度和海拔的三維定位，方便后續的補樣和種質持續采集。對于每一個采集的樣本，新鮮葉片立即埋入密封硅膠袋干燥保存。
[0033]2、如圖1步驟②利用分子標記分析輔助定位雜交帶居群，是指利用分子標記技術對所采集的樣本進行居群基因組多標記位點的群體遺傳學分析。在此基礎上利用生物信息軟件識別鑒定物種混生居群是否存在自然雜交漸滲現象。如果存在，則將其所在的地理位置定位為自然雜交帶區域。
[0034]具體的實施例內容:首先對干燥保存的獼猴桃樣本葉片進行基因組總DNA提取和分子標記實驗。DNA提取步驟包括:取50-100mg硅膠干燥保存的葉片組織樣本，在液氮中充分研磨，將粉末轉移至1.5mL離心管，然后用植物細胞核裂解液在65oC水浴中充分裂解細胞核至少30分鐘，經過氯仿分層和異丙醇沉淀以及75%乙醇洗滌，最后將獲取的基因組總DNA溶解于50uL的I X TE溶液中。DNA溶液通過凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質量和產量，達到分子標記試驗要求，隨即儲存備用；分子標記分析步驟包括基因組DNA模板的EcoR I和Mse I雙酶切、人工接頭連接到酶切片段、對應引物的PCR預擴增和選擇性擴增。本實施例采用對EcoR I引物5’端進行FAM熒光標記，將選擇性PCR擴增產物上樣到ABI 3730XL自動測序儀上進行條帶分型。所有樣本的分析結果共檢測遺傳位點350個，擴增條帶的平均多態性位點百分比為90%以上。
[0035]本實施例的雜交帶居群定位采用基于分子標記數據的STRUCTURE軟件進行。其具體的實施方法為:將所有40個居群的樣本的分子標記指紋數據整合成一個完整的數據表并轉換成適用于STRUCTURE軟件分析的數據輸入格式，缺失的數據輸入“-1”。軟件參數優化的設置為:采用Admixture混合模型，開啟獨立等位基因頻率選項，其他的使用默認值。將預評估的K值(所分析樣本中潛在的不同的基因組遺傳類型)設置成所分析居群樣本包含的物種數目(如包括兩個物種，則K = 2)，分析時貝葉斯的迭代數為1000，000,其中初始的50，000個迭代數據不收集。依據K值，在STURCTURE軟件中評估鑒定每一個居群樣本基因組的混合情況，即是否存在自然雜交漸滲(自然雜合子樣本)。本實施例對40個所分析的居群樣本共探測出27個居群分別屬于4個潛在的大雜交帶區域，即雪峰山區域、秦嶺區域、大巴山區域和幕阜山區域。
[0036]3、如圖1步驟③采集雜交帶的種質并在育種園中進行人工馴化，即基于定位的雜交帶居群，根據主要農藝目標性狀挑選采集雜交帶居群中的雜交種質并繁育于獼猴桃人工育種園進行馴化(包括嫁接和種子實生苗繁殖方式)。
[0037]具體的實施例內容:根據定位的雜交帶居群(區域)，本實施例先后分3年在所定位的雜交帶居群進行了相應的野生雜交種質資源的采集和育種園保存。主要采用的方式為:在獼猴桃最易于嫁接的時期即春季傷流期之前到所定位的雜交帶居群進行種質枝條采集，可根據實際需要和備用砧木的多少決定采集的數量，本實施例每個居群采集的枝條約40份，嫁接在國家獼猴桃種質資源圃(武漢)育種園。另外，在9-10月份果實充分成熟的季節，到雜交帶居群進行種子采集。選擇充分成熟的果實種子，清洗后放在室內攤薄晾干，然后用塑料袋密封后放入4°C冰箱貯藏約5周后，再經16小時21°C和8小時10°C的溫度變化處理，最終于當年12月至次年I月播種育苗。本實施例總共保存了雜交帶種質(嫁接株系和后代實生苗)500余份。
[0038]4、如圖1步驟④對人工馴化獲得的優株或優系進行品評和大面積區試，即在育種園馴化的基礎上，通過主要性狀和適應性不同區域的穩定性試驗，挑選優異株系開展區域性栽培試驗。
[0039]具體的實施例內容:在雜交帶居群種質收集保存并經過至少3年的育種園馴化適應的基礎上，依據獼猴桃UPOV標準進行優株的篩選，篩選程序根據不同的育種預設目標進行。本實施例涉及花形態、花期、花色、平均果重、果肉顏色、可溶性固形物含量、總糖和總酸含量、Vc含量、果實貯藏性、抗逆性等多個性狀指標的篩選評價，從收集保存的種質中總共篩選出單個特征突出或者綜合性狀優良的株系185份。對篩選的優株進行多地區試品評，本實施例區試分別于2008年冬季和2010年春季在湖北建始縣花坪鎮、江蘇蘇州市黃埭鎮和四川彭州小漁洞鎮等進行，采取定植幼苗和高接在四年生大樹方式。經多年多點對母樹和多代子代觀察，篩選性狀優良且穩定遺傳的品系十多份。
[0040]5、如圖1步驟⑤注冊申請新品種，即在各方面指標評價合格和區試穩定的基礎上，依照國家相應的動植物品種保護程序注冊發布新品種。【具體實施方式】此處從略。
[0041]二、應用
[0042]基于該方法，本實施例篩選培育出優株7-11-4，區試表明該優株果實品質綜合性狀突出，如平均果重可達75-85g、果肉黃色、肉質細嫩、風味酸甜適口等，且具有玫瑰紅色花、花期早，抗逆性強等特點，是兼具觀賞和鮮食于一體的優異雜交種質(表1和2)。在區試穩定的基礎上，本實施例對7-11-4優株進行了省級林木品種審定和農業部新品種保護。
[0043]表1篩選的7-11-4優株與獼猴桃主要栽培品種或物種的特征比較
[0044]
【權利要求】
1.一種獼猴桃自然雜交種質的發掘與新品種培育方法，其特征在于: ①調查獼猴桃屬植物自然重疊分布區物種混生居群的分布情況并采集樣本； ②利用分子標記分析輔助定位雜交帶居群； ③采集雜交帶的種質并在育種園中進行人工馴化； ④對人工馴化獲得的優株或優系進行品評和大面積區試； ⑤注冊申請新品種。
2.按權利要求1所述獼猴桃自然雜交種質的發掘與新品種培育方法的應用，其特征在于: 篩選培育出的獼猴桃自然雜交優異種質和新品種。
【文檔編號】A01H1/02GK104160908SQ201410403307
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】黃宏文, 劉義飛, 鐘彩虹, 李大衛 申請人:中國科學院華南植物園