與植物抗氧化能力相關的alt1蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種與植物抗氧化能力相關的ALT1蛋白及其編碼基因與應用。本發明公開一種蛋白，為如下(1)或(2)所示：(1)SEQ ID No.4所示的蛋白；(2)將SEQ ID No.4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。本發明證明ALT1基因的表達抑制可以顯著提高植物的抗氧化脅迫能力和根系活力。
【專利說明】與植物抗氧化能力相關的ALT1蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種與植物抗氧化能力相關的ALT1蛋白及其編碼基因與應用，屬于 生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 干旱、鹽堿、低溫、重金屬等非生物脅迫會導致植物細胞內R0S增加。由于R0S的 過量積累會產生氧化脅迫，因此，植物為了應對復雜的外界環境，在進化過程中形成了復雜 的R0S平衡調控機制。
[0003] 在正常外界環境條件下，氧分子處于不太活潑的氧化狀態。但是，當植物遭受病 蟲、干旱、鹽堿、重金屬、UV等生物或非生物脅迫時，植物體內電子傳遞和氧化還原動態平衡 被破壞，細胞內產生的電子很容易使氧化態的氧轉變為還原態的氧，產生超氧陰離子（〇 2〇、 羥自由基（· 0H)、單線態氧（102)和過氧化氫（H202)等物質，這些物質被統稱為活性氧 (reactive oxygen species, ROS)〇
[0004] 植物對非生物脅迫的耐性與自身的抗氧化脅迫能力密切相關，水稻中一些基因通 過調控R0S的平衡在應對外界環境脅迫中發揮重要的作用。例如，DST通過調節與H 202平衡 相關基因的表達調控體內H202的積累。DST功能的喪失抑制了 H202清除相關基因的表達，導 致H202在保衛細胞中積累，促使氣孔關閉，減少干旱脅迫下水分的流失，從而提高耐旱性。 Ning等的研究發現，DSM1可能參與了 R0S平衡的調控。甲基紫精（methyl viologen，MV) 脅迫處理和3, 3'一二氨基聯苯胺（3, 3'-diaminobenzidine, DAB)染色結果都表明dsml對 氧化脅迫更加的敏感。由此可以推測DSM1可能是通過調節R0S的清除而在水稻的耐旱性 中發揮作用。Du等研究表明DSM2主要通過調控葉黃素的循環和ΑΒΑ的合成在水稻耐旱和 抗氧化脅迫中發揮功能。用DAB染色觀察sikl、RNAi和過量表達的轉基因株系在鹽脅迫后 的H 202積累情況，發現sikl和RNAi株系受到的氧化傷害程度顯著高于過量表達的轉基因 株系，表明SIK1主要通過增強植株的抗氧化脅迫能力在水稻耐鹽中發揮作用。
[0005] 研究結果表明，植物對氧化脅迫的損傷防御分為3個層次：阻止活性氧的產生、過 量活性氧的清除以及損傷DNA的修復。
[0006] 關于水稻ALT1基因在植物抗氧化脅迫能力和根系活力中的研究還未見報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種與植物抗氧化能力相關的ALT1蛋白及其編碼基因與應 用。
[0008] 本發明提供一種蛋白，為如下（1)或（2)所示：
[0009] (l)SEQ ID No. 4 所示的蛋白；
[0010] (2)將SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。
[0011] 上述蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。
[0012] 上述編碼基因中，所述編碼基因為如下中至少一種：
[0013] 1) SEQ ID No. 3 所示的 DNA 分子；
[0014] 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子；
[0015] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質的DNA 分子。
[0016] 含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于 本發明的保護范圍。
[0017] 一種提高植物抗氧化脅迫能力的方法也屬于本發明的保護范圍，是將植物中的所 述蛋白的編碼基因敲除。
[0018] 一種提高植物根系活力的方法也屬于本發明的保護范圍，是將植物中的所述蛋白 的編碼基因敲除。
[0019] 上述任一所述的方法中，所述敲除是將所述蛋白的編碼基因（即SEQ ID No. 3所 示的DNA分子）自5'末端起第3037位堿基進行缺失。
[0020] 上述任一所述的方法中，所述植物為水稻。
[0021] 上述蛋白、上述任一所述的編碼基因作為靶點在提高植物抗氧化脅迫能力中的應 用也屬于本發明的保護范圍。
[0022] 上述蛋白、上述任一所述的編碼基因作為靶點在提高植物根系活力中的應用也屬 于本發明的保護范圍。
[0023] 上述任一所述的應用中，所述植物為水稻。
[0024] 在本發明的altl突變體背景下，50個與氧化脅迫相關的差異表達基因涵蓋了植 物應對氧化脅迫損傷防御的所有3個層次，揭示了 ALT1在調控氧化脅迫損傷防御中起著非 常重要的作用。并且，進一步通過氧化脅迫處理證實了 ALT1基因的突變使植株獲得了更強 的抗氧化脅迫能力，從而使突變體植株的根系能夠維持較強的活力。
[0025] 本發明提供的ALT1基因的表達抑制可以顯著提高植物的抗氧化脅迫能力和根系 活力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026] 圖1為altl突變體與野生型植株在突變位點附近序列的測序結果比較。
[0027] 圖2為altl突變體和野生型植株的氧化脅迫響應分析。
[0028] 圖3為堿脅迫下altl突變體和野生型植株的根系活力研究。
【具體實施方式】
[0029] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0030] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0031] 水稻空育131 (Oryza sativa L. ssp. Japonica)在文獻"董德龍，霍志軍，潘曉琳， 黃玉福.空育131不同密度對產量關系的影響。《農業與技術》2008年第5期中公開過， 公眾可從中國科學院遺傳與發育生物學研究所獲得。
[0032] 實施例1、ALT1基因的獲得
[0033] 一、設計并合成如下引物
[0034] 上游引物：5, -atggaggaagcggcggcggcgg-3'（SEQ ID No. 1)
[0035] 下游引物：5，-ctaaaccataaacaaatagttca-3'（SEQ ID No. 2)
[0036] 二、提取空育131的總RNA，并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，以步驟一的上游引 物和下游引物為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物，即為ALT1的編碼基因序列，如SEQ ID No. 3所示，ALT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0037] 實施例2、altl突變體的制備
[0038] 以空育131為母本、以NaN3為誘變劑，以ImM NaN3的水溶液浸泡6小時，水洗10 分鐘，25°C催芽1天，播種得到Ml群體，進一步建立大約有100, 000個單株的M2突變體庫。 通過對M2突變體庫進行pH9. 5的NaHC03-Na0H緩沖液處理篩選，得到一個可耐受高堿脅迫 的突變體，將其命名為altl突變體。通過圖位克隆及互補實驗，鑒定到altl突變體，證明 altl突變體僅在ALT1基因發生突變，altl突變體與野生型植株空育131中ALT1基因在突 變位點附近序列的測序結果比較如圖1所示，與野生型植株空育131相比，altl突變體中 ALT1編碼基因 （SEQ ID No. 3所示的DNA分子）自5'末端起第3037位堿基G缺失，盡管該 堿基的缺失并不影響其在突變體中的表達，但卻造成了終止密碼子的提前形成，使ALT1由 1228個氨基酸組成的蛋白突變為一個由1026個氨基酸組成的截短蛋白。
[0039] 上述altl突變體也可按照基因工程的方法制備得到。
[0040] 實施例3、ALT1基因的抗氧化脅迫功能研究
[0041] 一、氧化脅迫表型分析
[0042] (一）將兩葉一心期的野生型植株（水稻空育131)和altl突變體水稻幼苗轉移 至含有20 μ Μ甲基紫精（MV)的水培營養液（配方如表1所示）中，每3天更換一次，觀察 兩種幼苗的表型以檢測它們在抗氧化脅迫能力上的差異。
[0043] 表1水培營養液配方
[0044]
【權利要求】
1. 一種蛋白，為如下⑴或⑵所示： (1) SEQIDNo·4所示的蛋白； (2) 將SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且功能相同的蛋白質。
2. 權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3. 根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于：所述編碼基因為如下中至少一種： 1. SEQ ID No. 3所示的DNA分子； 2) 在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1所述蛋白質 的DNA分子。
4. 含有權利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5. -種提高植物抗氧化脅迫能力的方法，是將植物中的權利要求1所述蛋白的編碼基 因敲除。
6. -種提高植物根系活力的方法，是將植物中的權利要求1所述蛋白的編碼基因敲 除。
7. 根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述植物為水稻。
8. 權利要求1所述的蛋白、權利要求2或3所述的編碼基因作為靶點在提高植物抗氧 化脅迫能力中的應用。
9. 權利要求1所述的蛋白、權利要求2或3所述的編碼基因作為靶點在提高植物根系 活力中的應用。
10. 根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于：所述植物為水稻。
【文檔編號】A01H5/00GK104250294SQ201410487617
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年9月22日 優先權日:2014年9月22日
【發明者】姚善國, 王汝慈, 郭明欣, 劉小強, 汪月明 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所