青蝦蛻皮抑制激素基因及其在加速青蝦蛻皮和生長中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種青蝦蛻皮抑制激素基因及其在加速青蝦蛻皮和生長中的應用，青蝦蛻皮抑制激素基因，其核酸序列如SEQIDNO:1所示。利用RNA干擾技術，根據青蝦蛻皮抑制激素基因序列的開放閱讀框設計RNA干擾引物，然后以青蝦總cDNA為模板進行PCR擴增，得到序列如SEQIDNO:4所示，以SEQIDNO:4進行體外轉錄合成dsRNA，將dsRNA注射到青蝦的圍心腔后，加速青蝦蛻皮和生長。利用RNAi的方法對青蝦的損傷小，不影響其正常的采食、棲息及交配，便于進行長期的研究，且作用效果顯著。本發明為調控青蝦生長發育，培育青蝦優良品種提供新的思路和有效手段。
【專利說明】青蝦蛻皮抑制激素基因及其在加速青蝦蛻皮和生長中的應 用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和發育調控領域，具體涉及一種青蝦蛻皮抑制激素基因及其 在加速青蝦蛻皮和生長中的應用。
【背景技術】
[0002] 青奸，學名日本沼奸，俗稱河奸，隸屬十足目 (Decapoda)、長臂奸科（Palaemonidae)、沼奸屬（Macrobrachium),廣泛分布于我國各地水 域，生長快、適應性強、養殖經濟效益高，是我國重要的淡水養殖蝦類。據2012年《中國漁業 年鑒》記載，全國養殖青蝦年產量超過23. 7萬噸，年產值超過150億元，青蝦養殖已在我國 水產養殖中發揮了舉足輕重的作用。近年來，隨著規模化養殖的不斷擴大和消費需求的不 斷提高，培育出性狀更加優良的新品種是當前青蝦遺傳育種的關鍵。
[0003] 脫皮抑制激素（molt-inhibting hormone，MIH),是甲殼動物眼柄中合成分泌的甲 殼動物高血糖激素 （crustacean hyperglycemic hormone,CHH)家族中一種重要的神經肽， 具有調控甲殼動物蛻皮、發育活動的作用。在甲殼動物中的多項研究發現，蛻皮抑制激素能 夠抑制甲殼動物的蛻皮的發生，是甲殼動物生殖和發育調控中一種重要激素。
[0004] RNAi (RNA interference, RNAi)技術是一種由雙鏈RNA誘發的基因沉默技術。 在細胞內能特異性地誘導與之同源互補的mRNA的降解，使相應基因的表達關閉。RNAi被認 為是在基因功能研究中最有效的方法之一，已成為甲殼動物重要基因的功能的研究等很多 領域中的重要工具。然而目前，在青蝦重要基因研究中的應用尚未有報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種青蝦蛻皮抑制激素基因及其在加速青蝦蛻皮和生長 中的應用。利用本發明提供的青蝦蛻皮抑制激素基因設計合成的dsRNA，可以有效的加速青 蝦蛻皮的發生從而加速青蝦的生長和發育，為培育發育快、生長好的青蝦優良品種提供新 的思路和有效手段。
[0006] 青蝦蛻皮抑制激素基因，其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0007] 所述青蝦蛻皮抑制激素基因在加速青蝦蛻皮和生長中的應用。
[0008] 所述的應用，是利用RNA干擾技術，根據青蝦蛻皮抑制激素基因序列的開放閱讀 框設計RNA干擾引物，然后以青蝦總cDNA為模板進行PCR擴增，得到序列如SEQ ID N0:4 所示，以SEQ ID N0:4進行體外轉錄合成dsRNA,將dsRNA注射到青奸的圍心腔后，加速青蟲下 脫皮和生長。
[0009] 所述RNA干擾引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，下游引物核苷酸 序列如SEQ ID NO: 3所示。
[0010] dsRNA是用上游引物SEQ ID NO: 2和下游引物SEQ ID NO: 3通過PCR擴增得到的 PCR產物SEQ ID NO: 4經純化后，進行體外轉錄合成得到的。
[0011] 將dsRNA注射到青蝦的圍心腔的注射劑量為每克體重注射2飛μ g dsRNA，優選為 每克體重注射4 μ g dsRNA。
[0012] 應用的具體步驟如下： 首先根據青蝦蛻皮抑制激素基因（MIH基因）序列SEQ ID NO: 1，在其開放閱讀框內設 計RNA干擾引物，并在上述引物前添加 T7啟動子序列(TAATACGACTCACTATAGGG),確定h游 引物 SEQ ID NO: 2 和下游引物 SEQ ID NO: 3,序列分別為：TAATACGACTCACTATAGGGGTAAACCT GACAGCGCAAGG、TAATACGACTCACTATAGGGCCATCTGTTGAGCTGTTCCA (下劃線為 T7 啟動子序列）。
[0013] 用上述含有T7啟動子的上游引物SEQ ID N0:2和下游引物SEQ ID N0:3通過 PCR擴增得到PCR產物(序列如SEQ ID NO: 4所示)，經純化后按照Transcript AidTM T7 High Yield Transcription kit (Fermentas, Inc.，USA)試劑盒說明進行體外轉錄合成 dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0014] dsRNA在青蝦蛻皮發育中的應用：注射上述dsRNA分別到同期發育的雌性和雄蝦 青蝦的圍心腔后在六周內進行連續觀察和數據統計。結果表明：dsRNA可以特異性的沉默 MIH基因 mRNA表達，并能顯著的加速雌雄青蝦蛻皮的發生和雄蝦體重的增加。
[0015] 有益效果：退皮是決定青蝦的生長和生殖的關鍵因素，目前用于加速青蝦蛻皮和 生長發育的主要方法是通過眼柄摘除實現的。然而，眼柄摘除對青蝦造成的機械損傷很大， 尤其是幼蝦，常常造成高死亡率。利用RNAi的方法對青蝦的損傷小，不影響其正常的采食、 棲息及交配，便于進行長期的研究，且作用效果顯著。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1.成體青蝦注射dsRNA后，眼柄中MIH基因在不同采樣點時間的mRNA表達 量，青蟲下β-Actin基因作為內參基因。2,4，6，8，10, 12分別為注射后2天,4天,6天,8 天，10天和12天（N = 3)。#P〈 0. 01。對照組注射相同劑量的DEPC水。
[0017] 圖2.連續性RNAi期間青蝦蛻皮頻次（a)和體重（b)的變化的直觀圖。其中：組 1，組2,組3,組4分別為雄蝦干擾組、雄蝦對照組、雌蝦干擾組、雌蝦對照組對照組注射相同 劑量的DEPC水。
[0018]
【具體實施方式】 實施例1 :青蝦MIH基因全長cDNA的獲得 總RNA提取：選取成熟青蝦兩只，無菌解剖剪摘除眼柄組織，在RNA保存液（TaKaRa Bio Inc. Japan)中進行將眼柄色素部分夾破、漂洗預處理后進行青蝦眼柄總RNA提取，具體操 作步驟參照Takara Trizol試劑盒。
[0019] 第一鏈cDNA合成：以上述總RNA，參照Takara M-MLV反轉錄試劑盒反轉錄之后得 到第一鏈cDNA。
[0020] 青蝦MIH基因全長cDNA的獲得： 依據羅氏沼奸 CifecroAracAi腫 KC990939.1)MIH cDNA 的保守區域，設 計兩對中間引物，見SEQ ID NO: 6?9，（ middle Fl:5' -CCGGCATTCCTTTGTTTACCTG-3，midd IeRlji -ATATTCTGGCGTGTGGTCCTG-3，； middleF2:5/ -CCTGAGTGTCTGTCCAGTTTGA-3; ,middle R2:5/ -TGGTCCTGGAGCTTATTTT AGAGG-3')，以上述第一鏈cDNA為模板進行中間片段的克隆，進行PCR擴增反應體系如下：
【權利要求】
1. 青蝦蛻皮抑制激素基因，其特征在于：其核酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 權利要求1所述青蝦蛻皮抑制激素基因在加速青蝦蛻皮和生長中的應用。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于：利用RNA干擾技術，根據青蝦蛻皮抑制激 素基因序列的開放閱讀框設計RNA干擾引物，然后以青蝦總cDNA為模板進行PCR擴增，得 到序列如SEQ ID NO:4所示，以SEQ ID NO:4進行體外轉錄合成dsRNA，將dsRNA注射到青 蝦的圍心腔后，加速青蝦蛻皮和生長。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于：所述RNA干擾引物的上游引物核苷酸序 列如SEQ ID NO: 2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
5. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于：所述dsRNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 5 所示。
6. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于：將dsRNA注射到青蝦的圍心腔的注射劑 量為每克體重注射2飛ii g dsRNA。
【文檔編號】A01K67/033GK104313031SQ201410560745
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月21日 優先權日:2014年10月21日
【發明者】江豐偉, 傅洪拓, 喬慧, 張文宜, 金舒博, 熊貽偉, 蔣速飛, 龔永生 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業研究中心