專利名稱：雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法
雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法所屬技術領域
本發明屬于基因工程技術領域，特別是涉及一種在雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法。
背景技術：
褪黑素(melatonin，MT)是由動物腦部的松果體細胞在暗環境下所分泌的吲哚類激素，其化學名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺。它的生理功能是由褪黑素受體(melatonin acceptor,MTR)介導的，松果體是生物鐘的重要組成部分，通過分泌褪黑素的節律性改變來影響許多組織、腺體的代謝功能。因此，研究褪黑素及其受體作用機制、作用靶器官等對于揭示、提高和調控動物許多生理機能具有重要的基礎研究價值。研究發現，MTR是一種具有多種生物學功能的蛋白質并與醫學有著重要的關系。主要存在于腸組織上。MTR與MT特異性結合，通過信號轉導系統產生生物學效應。MT可影響哺乳動物次級毛囊和毛絨生長，能夠刺激體外培養的哺乳動物次級毛囊纖維生長，可調節生殖系統發育和功能，同時可以誘導皮毛提如成熟，提聞毛續廣量。
褪黑素受體的研究，在2008年，李子海等人研究了褪黑素對毛發生長的影響就， 表明不同濃度的褪黑素對毛發生長和毛發顏色的影響不同。2011年，陳建波等人就褪黑素受體對絨山羊絨毛生長的影響及其作用機理作了研究，結果表明褪黑激素對絨山羊絨毛生長具有促進作用，褪黑激素是通過影響類胰島素生長因子或催乳素的分泌間接影響絨毛生長；是通過調控皮膚組織中脫碘酶基因表達或者改變皮膚中催乳素受體基因可變剪接規律影響絨毛生長。
在雙峰駝中，褪黑素受體具有廣泛的生物學功能，尤其對動物毛發生長周期、換毛等其它生物節律和免疫活動等都具有重要的調節作用。因此，對駱駝褪黑素受體的研究將有助于細胞生物學和醫學的發展。發明內容
一種雙峰駝褪黑素受體，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示
(a) SEQ ID NO. 2 所示序列；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或/和疊加一個或多個氨基酸衍生得到的，且與(a)編碼蛋白質具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。
一種雙峰駝褪黑素受體編碼基因，該序列是與毛囊發育和毛色形成密切相關的基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示
(a) SEQ ID NO.1 所示序列；
(b)由堿基簡并或/和替代衍生的與(a)所述核苷酸序列90%以上同源性，且與 (a)編碼相同功能蛋白質的序列。
本發明還提供了一種雙峰駝褪黑素受體基因的克隆和測序方法，該方法包括步驟(I)組織分離(Isolation) ； (2)總 RNA 的分離(Total RNA isolation)包括①提取 RNA 的準備工作組織總RNA提取組織總RNA的鑒定。(3)全長cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括①引物設計及合成RT-PCR擴增；③克隆和測序，其特征在于 PCR引物的正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4，其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’
SEQ ID NO. 4 01igo dT ；
上述從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA為將雙峰駝耳部組織放入裝有Trizol 的勻漿器管中勻漿，離心分離，吸取上清液，在15-30°C溫育5分鐘，加氯仿，劇烈震蕩，繼續在15-30°C溫育2-3分鐘，再次離心分離，吸取上清液，加異丙醇混合均勻，然后15-30°C溫育10分鐘，離心分離，所得沉淀物加75%乙醇洗滌，離心分離后自然干燥或真空干燥得到總RNA。分離提取后的總RNA用分光光度計測定RNA含量和用瓊脂糖電泳分析RNA的質量。
上述反轉錄PCR按照大連寶生物反轉錄試劑盒的要求進行反轉錄。
上述克隆和測序包括PCR擴增片段的回收、回收片段同T載體的連接、質粒的轉化、轉化菌落的PCR鑒定與培養、質粒的回收、質粒的酶切鑒定和重組質粒的測序。
上述PCR擴增片段的回收按照上海華舜小量膠回收試劑盒的要求進行。
上述回收片段同T載體的連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒。
上述質粒的轉化為將感受態細胞加入到回收片段同T載體的連接產物中，冰浴 30分鐘，然后在42°C水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘，加液體LB培養基，37°C 復活50分鐘，后涂布于含有氨芐青霉的LB平板上，37°C恒溫培養10-15小時。
上述轉化菌落的PCR鑒定與培養為挑選轉化培養的單菌落，放入到加有PCR反應液的EP管中晃動，使單菌落充當模板；用獲得該片段的PCR條件進行擴增，PCR產物同 Marker 一起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的與之對應的單菌落，放入含有的青霉素鈉LB液體培養基中，37°C過夜搖菌培養，用于質粒回收。
上述質粒的回收用上海華舜小量質粒抽提純化試劑盒實現。
上述質粒的酶切鑒定采用雙酶切法鑒定，選擇內切酶Bam H I和Hin d III。
本發明在提供了雙峰駝褪黑素受體基因的cDNA序列和蛋白編碼序列基礎上；將人、鼠、牛等不同物種褪黑素受體基因的CDS序列和氨基酸序列進行同源性比較；對包括雙峰駝在內的8個物種的八個褪黑素受體基因的CDS序列構建了系統發生樹。本發明是通過以下技術方案實現的
本發明中的雙峰駝褪黑素受體基因的cDNA序列是通過以雙峰駝耳部組織中總 RNA為模板，參考人、鼠、牛等物種的褪黑素受體基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR 而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列見SEQ ID NO.1。將雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質編碼序列見 SEQ ID NO. 2。
在SEQ ID NO.1中，RT-PCR產物長度為1140bp，電泳結果見附圖1，其中19-21位為起始密碼子ATG，1105-1107位為終止密碼子TAA，19-1107位為編碼蛋白質區域(OTS)。 在SEQ ID NO.1，雙峰駝褪黑素受體基因編碼362個氨基酸。雙峰駝與褐家鼠(AAG18471.1) 的褪黑素受體核酸序列具有94%的相似性。雙峰駝和人、鼠、牛等動物用Clustal X中對齊的褪黑素受體基因編碼氨基酸序列同源性比較結果見附圖2。
對包括SEQ ID NO.1在內的8個物種的八條褪黑素受體基因的⑶S序列構建了系統發生樹，結果發現雙峰駝褪黑素受體同褐家鼠的進化距離最近，間接證明了所得到的序列確為雙峰駝褪黑素受體基因。
本發明所得到的褪黑素受體蛋白的基因序列和該蛋白結構的數據可用于研究其在黑素合成的下游途徑中的重要作用，為闡明雙峰駝絨毛生長機理和未來產生人為控制絨毛產量提供理論基礎和依據，并能夠為其它哺乳動物的絨毛生長機理研究奠定一定的生物學基礎。
圖1為雙峰駝褪黑素受體基因RT-PCR產物電泳圖2為構建系統發生樹所用褪黑素受體氨基酸同源性比較；
圖3為不同物種褪黑素受體氨基酸序列系統進化樹。
具體實施方式
下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的保護范圍。
實施例1:雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列的克隆
1、組織分離(Isolation)
從內蒙古阿拉善盟雙峰駝，快速采得樣品，將耳部組織樣迅速放入液氮中冷凍后于-70°C保存，拿回實驗室準備提取組織總RNA。
2、總 RNA 的分離(Total RNA isolation)
(I)提取RNA的準備工作
玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡過夜，用自來水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗2遍， 180°C烘烤4小時。
勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20-30分鐘，再用0.1 %的DEPC水沖洗。由于未滅活的DEPC對PCR反應有影響，可用0. 5%的SDS處理。
Tip頭、EP管用0.1 %的DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌使DEPC失活。
雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液，室溫放置過夜， 高壓滅菌30分鐘DEPC失活。
(2)組織總RNA提取
取IOOmg在液氮中凍存的組織樣放入有 Iml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL，USA)的勻漿器管中勻漿。4°C 12000rpm離心10分鐘。吸取上清液，15_30°C溫育5分鐘。 加0. 2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒。15-30°C溫育2-3分鐘。4°C 12000rpm離心 15分鐘。吸取上清液，加0. 8ml異丙醇，混合均勻。15-30°C溫育10分鐘，4°C 12000rpm離心 10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗滌RNA，4°C 7500rpm 離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分裝，_70°C保存。
(3)組織總RNA的鑒定
通過分光光度計上測定RNA含量并且用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質量，具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4_5小時，再用DEPC處理過的水反復沖洗數次后倒入I X TBE待用。瓊脂糖凝膠用IXTBE配制。在IOul上樣緩沖液 (2XTBE，13%菲可，O. 1%溴酚蘭，7M尿素)中加入Iul以上組織總RNA，65°C變性10分鐘后立即放入冰水中2-3分鐘。點樣于瓊脂糖凝膠中電泳。
3、全長 cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)
(I)引物設計及合成
根據GenBanK發表的綿羊(ACF74448.1)、褐家鼠(AAG18471.1)等物種的褪黑素受體基因mRNA序列ORF側翼同源序列，設計如下引物用于以雙峰駝褪黑素受體cDNA為模版的PCR擴增，以獲得雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列。引物用Primer Premier5. O自行設計，由上海桑尼生物科技有限公司合成，該引物對的核苷酸序列分別為SEQ ID N0:3(正向)和SEQ ID NO :4(反向)，序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’
SEQ ID Ν0·4(反向)01igo dT
(2) RT-PCR 擴增
按大連寶生物反轉錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求進行反轉錄。 反轉錄反應液組成10ul2XBca 1st Buffer,4ul 25Mm MgS04, Iul dNTP Mixture,0. 5ul Rnase Inhibitor(40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul),Iul Oligo dT Primer,Iul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20，總體系為 20ul。反轉錄反應條件65°C I 分鐘，30°C 5 分鐘(15分鐘-30分鐘內勻速升溫)，65°C 25分鐘，98°C 5分鐘，5°C 5分鐘。PCR擴增條件 97°C變性5分鐘；95°C 30秒一55V 30秒一72V I分鐘，如此進行30次循環；72°C延伸10 分鐘，4 °C保存。
(3)克隆和測序
PCR擴增片段的回收。片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說明進行，操作過程如下盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊，放入1. 5mlEP管中。按每IOOmg瓊脂糖加入 300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分鐘。將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，IOOOOrpm離心I分鐘，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOrpm離心15秒，倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液，靜置I分鐘后，IOOOOrpm離心15秒，倒掉管中液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，靜置I 分鐘后，IOOOOrpm離心I分鐘，EP管中液體即為回收的DNA。
回收片段同T載體的連接。連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒，操作過程如下在 EP 管中制備下列連接反應液pMD18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul，DNA20-40ng, Solution I 5ul，加dH20至10ul。將上述反應液在16°C反應30分鐘(過夜也可以)，產物用于轉化感受態細胞。
質粒的轉化。從_70°C冰箱中取出保存的感受態細胞，冰浴助溶。IOOul感受態細胞加入IOul連接產物，冰浴30分鐘。42°C水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加 400ul液體LB培養基，37°C復活50分鐘。取IOOul鋪于LB平板上，平板含0.1 % (V/V)的氨節青霉Amp (100mg/ml)。37°C恒溫培養10-15小時。
轉化菌落的PCR鑒定與培養。用記號筆標記轉化培養的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應液(不含模板，是指引物、DNA聚合酶、dNTP、緩沖液及水加上剛才的單菌落就成了 PCR反應體系)的EP管中晃動，使單菌落充當模板。用獲得該片段的PCR條件進行擴增。PCR產物同Marker —起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應的單菌落， 放入40ml LB液體培養基中，先在液體中加入O.1 % (V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)，37°C過夜搖菌培養，用于質粒回收。
質粒的回收。質粒回收用上海華舜小量質粒抽提純化試劑盒，操作步驟如下將轉化培養的菌液加入1. 5mlEP管中，4000rpm離心，倒掉液體獲細菌沉淀。細菌沉淀不夠時可再加一次菌液離心。在細菌沉淀中加入250ulPl液，振蕩懸浮。加入250ulP2液，溫和搖勻，室溫靜置4分鐘。加入350ulP3液，溫和搖勻。離心10分鐘，將上清液小心移入吸附柱，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，離心15秒，倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl，靜置I分鐘，離心15秒，倒掉液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，靜置I分鐘后，離心I分鐘.EP管中液體即為回收的質粒。
質粒的酶切鑒定。為了證明回收質粒確為插入目的片段的重組質粒，采用雙酶切法鑒定.本研究具體操作如下根據TaKaRa pMD18_T Vector圖，選擇內切酶Bam H I和 Hin d II1.保證目的片段中無這兩種酶的切點。組成如下酶切反應體系Bam H I lul,Hin d III lul, IOXK Buffer 2ul，DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul。30°C反應 3 小時。瓊脂糖凝膠電泳檢測。
重組質粒的測序。取20ul重組質粒于EP管中，封口膜密封，交生物技術公司測序。
實施例2 :雙峰駝褪黑素受體基因編碼序列同源性比較和系統發生樹構建
1、雙峰駝褪黑素受體基因編碼序列同源性比較
在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等七種動物的褪黑素受體基因編碼蛋白序列， 將其同克隆測序獲得的本發明獲得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物學軟件MEGA4上進行序列同源性比較(見附圖2)。比較結果顯示SEQ ID NO. 2序列與褐家鼠的褪黑素受體氨基酸序列同源性為94. 00%。
2、褪黑素受體基因編碼序列系統發生樹構建
在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等七種物種的7條褪黑素受體基因的編碼蛋白序列，加上本發明獲得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物學軟件MEGA4構建了系統發生樹 (見附圖3)。結果顯示雙峰駝褪黑素受體基因同褐家鼠的親緣關系最近；間接證明了所得到的序列確為雙峰駝褪黑素受體基因。
序列表
<110>內蒙古農業大學
〈120〉雙峰駝褪黑素受體的蛋白編碼序列
<160>4
<170>PatentIn version3. 3
<210>1
<211>1140
<212>DNA
〈213〉阿拉善盟雙峰駝
<400>權利要求
1.一種雙峰駝褪黑素受體，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO. 2 所示序列；(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或/和疊加一個或多個氨基酸衍生得到的，且與(a)編碼蛋白質具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。
2.一種雙峰駝褪黑素受體編碼基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO.1 所示序列；(b)由堿基簡并或/和替代衍生的與(a)所述核苷酸序列90%以上同源性，且與(a)編碼相同功能蛋白質的序列。
3.—種雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法，該方法包括如下步驟(1)從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA；(2)根據人、鼠及牛不同物種的褪黑素受體基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR，其中引物的正向引物為 SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’反向引物為 SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ；(3)克隆和測序。
4.按照權利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法，其特征在于從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA為將雙峰駝耳部組織放入裝有Trizol的勻漿器管中勻漿，離心分離，吸取上清液，在15-30°C溫育5分鐘，加氯仿，劇烈震蕩，繼續在15-30°C溫育2_3分鐘，再次離心分離，吸取上清液，加異丙醇混合均勻，然后15-30°C溫育10分鐘，離心分離，所得沉淀物加75%乙醇洗滌，離心分離后自然干燥或真空干燥得到總RNA。
5.按照權利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法，其特征在于分離提取后的總RNA用分光光度計測定RNA含量和用瓊脂糖電泳分析RNA的質量。
6.按照權利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法，其特征在于上述反轉錄PCR按照大連寶生物反轉錄試劑盒的要求進行反轉錄。
7.按照權利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法，其特征在于上述克隆和測序包括PCR擴增片段的回收、回收片段同T載體的連接、質粒的轉化、轉化菌落的PCR鑒定與培養、質粒的回收、質粒的酶切鑒定和重組質粒的測序。
8.按照權利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法，其特征在于上述PCR擴增片段的回收按照上海華舜小量膠回收試劑盒的要求進行。
9.按照權利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法，其特征在于上述回收片段同T載體的連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒。
10.按照權利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法，其特征在于上述質粒的轉化為將感受態細胞加入到回收片段同T載體的連接產物中，冰浴30分鐘，然后在42°C水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘，加液體LB培養基，37°C復活50分鐘，后涂布于含有氨芐青霉的LB平板上，37°C恒溫培養10-15小時。
11.按照權利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法，其特征在于上述轉化菌落的PCR鑒定與培養為挑選轉化培養的單菌落，放入到加有PCR反應液的EP管中晃動，使單菌落充當模板；用獲得該片段的PCR條件進行擴增，PCR產物同Marker —起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的與之對應的單菌落，放入含有的青霉素鈉LB液體培養基中，37°C過夜搖菌培養，用于質粒回收。
12.按照權利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法，其特征在于上述質粒的回收用上海華舜小量質粒抽提純化試劑盒實現。
13.按照權利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法，其特征在于上述質粒的酶切鑒定采用雙酶切法鑒定，選擇內切酶Bam H I和Hin d III。
全文摘要
本發明涉及一種在雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法，本發明中的雙峰駝褪黑素受體基因的cDNA序列是通過以雙峰駝組織中總RNA為模板，參考人、鼠、牛等物種的褪黑素受體基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列見SEQ ID NO.1。將雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質編碼序列見SEQ ID NO.2。本發明通過對包括SEQ ID NO.1在內的8個物種的八條褪黑素受體基因的CDS序列構建了系統發生樹，結果發現雙峰駝褪黑素受體同褐家鼠的進化距離最近，間接證明了所得到的序列確為雙峰駝褪黑素受體基因。
文檔編號C07K14/72GK102993295SQ201210371328
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者張文彬, 哈斯蘇榮 申請人:張文彬