專利名稱：：生長激素受體基因作為中國草原紅牛優良屠宰性狀分子標記的鑒定方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于動物基因工程
技術領域：
，涉及中國草原紅牛優良屠宰性狀候選基因在標記輔助選擇中的應用，具體地說是一種生長激素受體(GHR)基因作為分子標記及在中國草原紅牛優良屠宰性狀中的應用。
背景技術：
：1987年，L腦g[DAVIDW.LEUNG，GrowthHormonereceptorandSerumBindingProtein:Purification,CloningandExpression,yVa^Are330，537-543(10December1987)]從兔肝臟中提取并純化出生長激素受體(G服)，又根據氨基酸序列首次從兔的肝臟cDNA文庫中克隆出GHRcDNA。隨后人們相繼克隆了人、小鼠、大鼠、綿羊、牛、雞等20多種動物的G服cDNA。生長激素(GH)通過與耙細胞表面特定的生長激素受體(GHR)結合，刺激胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的生成而對發育和代謝產生作用。因此，GHR的功能區域的改變會影響到GH的結合能力和信號傳導，即GHR基因堿基序列發生突變可能影響到生長激素的正常功能的發揮，最終影響到許多生長性狀。1996年,Falaki等[M.Falaki,'RelationshipsofPolymorphismsforGrowLhHormonearidGrowLhHormoneReceptorGenesvdthMilkProduction-TraitsforItalianHolstein-FriesianBulls,JournalofDairyScienceVol.79No.8:1446-1453]報道在用來編碼細胞內部分C端的DNA序列中發現了9個RPLR-T叫I基因型，并且該位點的多態性與意大利荷斯坦奶牛的乳蛋白百分含量相關；S.Blott等[SarahBlott,MolecularDissectionofaQuantitativeTraitLocus:APhenylalanine-to-TyrosineSubstitutionintheTransmembraneDomainoftheBovineGrowthHormoneReceptorIsAssociatedwithaMajorEffectonMilkYieldandComposition,Genetics，Vol.163，253-266,January2003]報道在Holstein-Friesian牛基因部分編碼區和內含子受體跨膜區F279Y氨基酸的替換，從而影響牛的產奶性狀；而高雪等[高雪，牛生長激素受體基因遺傳變異研究，中國農學通報第21巻第8期2005年8月(2005)]在對本地奶牛的研究中，在GHR基因的第八外顯子、第九外顯子、第三外顯子、5，端均未發現多態，是由于樣本數量的限制還是本地黃牛特有的遺傳特性還不清楚。Hale等[HaleCS，DecreaseGrowthinAngusSteers,withTG-microsatelliteAlleleinPIPromoteroftheGrowthHormoneReceptorGene./5W，2000，78:2099-2104.]研究了安格斯牛GHR基因啟動區的(TG)n微衛星多態與生產性能的關系，比較了純合基因型LL和雜合基因型SL對牛的生長性狀和屠體性狀的影響，并得出S基因型對安格斯牛的斷奶重和屠體重有明顯影響，并得出S等位基因與安格斯牛群低生長率有關;但是，R.A.curi等[R.A.Curi,EffectsofPolymorphicMicrosatellitesintheRegulatoryRegionof/6！/77and(朋onGrowthandCarcassTraitsinBeefCattle,AnimalGenetics,2005，Volume36Issue1，Pages58-62]卻發現S等位基因與L等位基因的雜合型具有較高的日增重和體重(P<0.05)。Ge等[GeW，AssociationofSingleNucleotidePolymorphismsintheGrowthHormoneandGrowthHormoneReceptorGeneswithBloodSerumInsulin—LikeGrowthFactorIConcentrationandGrowthTraitsinAngusCattle.爿/n./z/a75We/2ce,2003，81(3):641—648]在G服基因的啟動子部分發現了一個SNP，其多態對血清IGF-1的濃度和生長性狀有明顯影響。DiStasioL[DiStasioL，PolymorphismoftheGHRGeneinCattleandRelationshipswithMeatProductionandQuality.Animalgenetics2005:36(2):138-40]等研究了GHR基因的第十外顯子257bP處的單核苷酸與14個產肉性狀和4個肉質性狀的關系，發現GHR的特定基因型對肉品質有不利影響。
發明內容本發明的目的是提供一種生長激素受體(GHR)基因作為中國草原紅牛優良屠宰性狀的分子標記。本發明在于獲得與中國草原紅牛優良屠宰性狀相關的GHR基因部分片段，并對該片段進行多態性分析，為中國草原紅牛的標記輔助選擇提供分子標記。本發明的另一個目的是提供鑒定作為中國草原紅牛分子標記的GHR基因的RCR-RFLP檢測方法。本發明的第三個目的是提供所涉及的分子標記在中國草原紅牛生長性狀關聯分析上的應用。本發明通過以下技術方案實現。一種克隆得到的中國草原紅牛生長激素受體基因G服片段，它的核苷酸序列如表l:表1中國草原紅牛生長長激素受體基因G服克隆片CTTCTGCGAGGTAGACfe^CCAAAAAGTACATTGCCCTGGCCCCTCATGTCGAGGCTGAATCACACGTCAGTCTCCACAGGGC其中，！^J為此序列片段中突變位點的兩種單核苷酸，該序列中只存在A或G的一種。所獲得的Gffi基因片段的核苷酸序列長度為489bp，是外顯子10的一部分。序列表1的第289位堿基處存在有一個堿基突變位點，導致限制性片段長度多態性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP)的產生。將此突變位點作為一個分子標記，通過PCR-RFLP即聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性的方法，使用限制性內切酶^s"C/檢測此突變位點，并將檢測結果與中國草原紅牛屠宰性狀相關聯，為中國草原紅牛的選種選育提供理論基礎。本發明的分子標記鑒定方法和性狀關聯分析過程如圖10所示。本發明的分子標記鑒定方法，通過下述步驟實現。一、克隆中國草原紅牛G服基因部分序列的方法1.采集中國草原紅牛血液用活體或屠宰時進行血液采集。為在后續實驗中便于從血液中提取基因組DNA，應使用EDTA抗凝血法進行處理，而不使用肝素抗凝血法。2.從中國草原紅牛血液中提取基因組DNA將采集的血液經EDTA抗凝血法處理后，用常規方法提取基因組DNA。3.設計特異性引物并進行P.CR擴增設計一對特異引物，上游引物5、CAGCAGCCCAGTGTTATC-3';下游引物5'-GCCCTGTGGAGACTGTACTAT-3'。PCR反應總體系為25微升，其中IOX反應緩沖液2微升，10mmol/LdNTP0.5微升，25咖ol/LMgCl2l.5微升，1.0,1/L的上游引物和下游引物各0.5微升，1UTaqDNA聚合酶，20-50納克基因組DNA，最后用四餾水補足至25微升。循環程序如下94'C預變性5分鐘，94t變性45秒，6(TC復性45秒，72°C延伸45秒，共35個循環。循環之后，72t延伸IO分鐘。全部反應完成后，PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。4.克隆所擴增的中國草原紅牛GHR基因序列并測序本發明將目的片段克隆在PMD18-T載體上，而后轉化重組質粒，經酶切鑒定正確后進行測序。二、建立PCR-RFLP方法并鑒定突變位點序列測定后，通過序列特征分析，使用限制性內切酶^s^67進行酶切反應。反應結束后經瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型。在所設計的一對特異引物的第288位置存在A/G等位突變，該突變引起氨基酸的改變，并導致限制性內切酶^s^C/位點發生改變。當發生改變的位點為G堿基時存在酶切位點(電泳檢測結果為287bp+202bp)，命名為A等位基因；當該位點為A堿基時，不存在酶切位點(489bp)，命名為B等位基因。這兩個等位基因可組成3種基因型。即AA、BB、AB。如圖2所示，其中M泳道為標準分子量Marker,1-2泳道為BB型，3-4泳道為AB型，5-6泳道為AA型。三、對標記性狀進行關聯分析本發明通過生長性狀關聯分析過程，對中國草原紅牛部分性狀進行關聯分析并預測相應基因型個體部分性狀的生長潛力。生長性狀關聯分析過程，是通過下述步驟實現的。使用SPSS12.0軟件中的GeneralLinearModel過程，建立如下統計分析模模型并消除系統效應來分析不同基因型和部分屠宰性狀的關聯。統計分析模型為Yi^+Gj+e"其中，Yi為被觀測個體的生產性能表型值，U為生產性能的最小二乘均值，Gj為基因型對生產性能的效應值，ei為對應于觀察值的隨機殘差。對中國草原紅牛第10外顯子的萬s"C/多態性位點與部分屠宰性狀進行關聯分析，基因型檢測結果表明在145個個體中AA型基因型有25個，AB基因型個體有107個，BB型基因型個體有13個。分析結果如表2所示，其中，同一性狀最小二乘均值及標準差后具有不同字母隸示差異顯著(P〈0.05)，具有不同大小寫字母表示差異極顯著(P〈0.01)。由表2可知，B等位基因是中國草原紅牛性狀的有利等位基因，BB基因型標記可作為用于提高中國草原紅牛優良性狀的選擇標記(分子標記)，并對一些性狀提出預測值，最小二乘均值士標準差即為對相同月齡中國草原紅牛屠宰性狀。將此突變位點作為一個分子標記，通過PCR-RFLP的方法鑒定此突變位點，并將鑒定結果與中國草原紅牛部分屠宰性狀相關聯，為中國草原紅牛的選種選育提供理論基礎。利用本發明建立的PCR-RFLP方法即可檢測處在任何生長階段的中國草原紅牛GHR基因型并評估其生長潛力，也可通過檢測2卜23月齡的育肥中國草原紅牛個體的GHR基因不同基因型，提出部分屠宰性狀的估測值。本發明的效果是如下。1、克隆了中國草原紅牛GHR基因部分DNA序列GHR基因擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示為特異性PCR產物，如圖1所示。將PCR產物回收測序，結果顯示產物長度為489bp。測序結果顯示該片段289bp處存在A、G兩個等位基因，測序峰如圖3所示。2、建立了中國草原紅牛G服基因PCR-RFLP診斷方法用本發明設計的特異性引物擴增中國草原紅牛基因組DNA得到的489bp特異擴增片段。測序的結果發現在該489bp片段存在"s"C/酶切位點(GR*CGYC)，其中第288bp處為多態性切點，位于GHR基因第10外顯子中，用該引物擴增的中國草原紅牛GHR基因的489bp長的片段，經過酶切可產生三種基因型，即AA型、AB型和BB型，具體圖片如圖2所示。3、對標記性狀進行關聯分析最小二乘平均值及標準差后帶有不同小寫字母表示差異顯著，帶有不同大寫字母表示差異極顯著。表2部分性狀在AA、BB和AB基因型的最小二乘平均值及標準差<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>圖1是GHR基因擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,1-8泳道為被檢測的8個PCR產物。圖2是2%瓊脂糖凝膠電泳檢測G服基因擴增產物的^s"C7酶切結果。其中M泳道為標準分子量Marker,1-2泳道為BB型，3-4泳道為AB型，5-6泳道為AA型。圖3是本發明擴增的GHR基因部分DNA序列的克隆測序峰圖。圖4是實施例1中PCR擴增產物的1.5%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的PCR產物。圖5是實施例1中酶切反應產物的2%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的酶切產物。圖6是實施例2中PCR擴增產物的1.5%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的PCR產物。圖7是實施例2中酶切反應產物的2%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的酶切產物。圖8是實施例3中PCR擴增產物的1.5%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的PCR產物。圖9是實施例3中酶切反應產物的2%瓊脂糖凝膠檢測結果。其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的酶切產物。圖10是本發明的分子標記鑒定方法和性狀關聯分析過程圖。具體實施例方式為了更清楚地理解本發明，用具體實施方式詳細描述具體內容。本發明利用已公布的G服基因序列和已提取的中國草原紅牛基因組DNA，設計特異性引物一對，克隆第IO外顯子的一部分，利用PCR-RFLP方法，使用限制性內切酶^s"C/對PCR反應產物進行酶切。將酶切結果分型并將不同基因型與部分生產性狀關聯，并對不同基因型個體的部分性狀預測，為中國草原紅牛的選種選育提供理論基礎。一、中國草原紅牛GHR基因部分DNA片段的克隆1引物設計以牛GHR基因為參照，NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation,美國國家生物技術信息中心)收錄號為AM161140,利用01igo6.0軟件設計特異性引物1對。引物序列如下所示上游引物5、-CAGCAGCCCAGTGTTATC-3、下游引物5、-GCCCTGTGGAGACTGTACTAT-3、擴增產物長度為489bp。2PCR(聚合酶鏈式反應)體系及擴增條件PCR反應總體系為25微升，其中10X反應緩沖液[10mmol/LTris-HCL(PH8.0)，50畫1/LKCl，0.l%TritonX-100]2微升，10mmol/LdNTP0.5微升，25,1/LMgCl丄5微升，引物濃度為1.0umol/L，1UTaqDNA聚合酶，20-50納克基因組DNA，用四餾水補足至25微升。循環程序如下94'C預變性5分鐘，94'C變性45秒，60'C復性45秒，72°C延伸45秒，共35個循環。循環之后，72。C延伸10分鐘。全部反應完成后，PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。3PCR產物回收、純化及測序(1)PCR擴增產物的凝膠回收、純化PCR擴增產物的凝膠回收和純化使用常規方法即可。本發明中為快速、高效的回收PCR擴增產物，使用Omega公司的E.Z.N.AGelExtractionKit試劑盒進行凝膠純化，具體操作參照其說明書進行，使用試劑除1XTAEBuffer緩沖液和二餾水外均為試劑盒內提供。在新鮮的IXTAEBuffer下，用1%瓊脂糖/溴化乙啶凝膠電泳完全分離目的DNA片段。在長波紫外燈下用潔凈的手術刀片快速切取含目的DNA片段凝膠條。在干凈的1.5ml離心管中稱量所切膠塊的重量，計算膠塊的體積(按1克為1毫升計算，為保證回收量，回收的膠塊重量應在50毫克至350毫克之間)，加入等體積的BindingBuffer,55"—65。C水浴或溫浴直到膠塊完全融化，期間每2—3分鐘搖動一次以便混合均勻。將上述操作得到的所有溶液(不超過700微升，超過700微升的部分則棄去)轉移至HiBindDNASpin-Column管中，室溫10000g離心1分鐘，棄去濾液。加入300微升BindingBuffer后，10000g離心1分鐘。將HiBindDNASpin—Column中加入700微升SPWBuffer,豎直靜置2—3分鐘，然后室溫10000g離心1分鐘。棄掉濾液，再將HiBindDNASpin-Colum中加入700微升SPWBuffer,豎直靜置2—3分鐘，然后室溫10000g離心1分鐘，使HiBindDNASpin-Column管無液體殘留的。棄去濾液，將無液體殘留的HiBindDNASpin-Column10000g離心l分鐘，干燥其基質。將HiBindDNASpin-Column放入一個干凈滅菌的1.5ml離心管中，力口30微升DNAElutionBuffer或滅菌的2餾水到HiBindDNASpin-Column的中央，10000g離心l分鐘洗脫DNA。(2)感受態DH5a宿主菌的制備用CaCl2法制備大腸埃希氏DH5a(E.coliDH5a)感受態宿主菌，整個過程需在嚴格的無菌條件下進行。方法如下從37〔培養16至20小時的LB(Luria-Bertani)平板培養基中挑取新活化的E.coliDH5a單菌落于不加氨芐的LB液體培養基中，37。C每分鐘200至220轉振蕩培養12小時，然后取300微升于50毫升裝有LB的錐形瓶中，柔和搖晃2小時，OD6。。值為0.45至0.55。取冰中預冷10分鐘的E.coliDH5a菌液于冰上預冷的離心管中，在4t:下每分鐘4500轉的轉速離心10分鐘。取25毫升冰浴預冷的0.075Mol/L的CaCl2-Tris-Cl懸浮沉淀，置于冰浴15分。在4。C下每分鐘4500轉的轉速離心IO分鐘，棄上清液后，倒置1分鐘。加2毫升冰浴預冷的CaCl2-甘油重懸沉淀。每管200微升分裝至1.5毫升離心管內，在一8(TC保存。(3)目的片段與克隆載體的連接可根據實際情況選擇合適的載體。本發明為快速、高效的進行載體連接，選用了TaKaRa公司的pMD18-T載體連接試劑盒進行目的片段與克隆載體的連接，除四餾水外，其他所有試劑均為試劑盒內提供。將凝膠回收的目的DNA片段連接到pMD-18T載體上。按照表3的連接反應體系，在200微升高壓滅菌的微量離心管中加入表2中所列的組分，混勻，16'C連接30分鐘。表3連接反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(4)重組質粒的轉化在每管200微升冰上凍融的感受態細胞中，加入10微升的連接產物，輕彈管壁以混勻內容物，冰浴45分鐘。將離心管放入預熱的42'C恒溫水浴中靜置2分鐘。快速將離心管轉移到冰中，冰浴5分鐘。在離心管中加入400微升LB液體培養基，37"C搖床每分鐘150轉的轉速溫浴1小時。(5)陽性克隆的篩選將LB固體培養基15psi(l.05kg/cm2)高壓蒸汽滅菌20分鐘，冷卻至60°C時，加入1毫升100毫克/毫升的氨芐青霉素(AMP)、1毫升24毫克/毫升的異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、2毫升20毫克/毫升的5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-乳糖苷(X-Gal)后均勻混合，鋪制平板。取100微升轉化后的細菌均勻涂布于培養基表面，37'C培養箱中放置1小時。然后將平板倒置于37t:培養箱中培養，12-16小時后將平板移入4'C放置，以使藍色充分顯現。觀察藍色與白色菌落生長情況，為使每條目的帶的轉化產物覆蓋5'和3'末端全序列，挑取陽性菌落(白色)5-IO個接種于LB培養基。(6)重組質粒的提取可使用常規方法進行重組質粒的提取。本發明為快速、高效進行重組質粒的提取，選用Omega公司的E.Z.N.A.PlasmidMiniKitI試劑盒提取陽性質粒DNA，除四餾水、去離子水外，所用試劑均為試劑盒內提供。從平板培養基上挑選單個陽性菌落接種到5毫升'50微克/毫升的LB/Ampicillin液體培養基中，37。C每分鐘220轉的轉速恒溫振蕩，培養12-16小時。取5毫升菌液放入離心管中，室溫10000g離心1分鐘，棄掉上面的上清液。用250微升的含RM去除酶的SolutionI充分懸浮細胞沉淀。加入250微升的Solution11，輕輕地上下翻轉混合46次，使菌體充分裂解，形成透明溶液，室溫放置2分鐘。加入350微升的Solutionin，輕輕上下翻轉混合5至6次，直至形成緊實凝集塊，室溫10000g離心10分鐘。將試劑盒中的HiBindDNAMinicolumn放置于2毫升的CollectionTube上，將上述帶有凝集塊混合液的上清液轉移至HiBindTMDNAMinicolumn中，室溫10000g離心1分鐘。棄掉濾液，加入500微升的BufferHB到HiBindDNAMinicolumn,然后室溫10000g離心1分鐘。離心完畢后棄掉濾液，加700微升用乙醇稀釋過的DNAWashBuffer清洗HiBindDNAMinicolumn,室溫10000g離心1分鐘，棄掉濾液。然后室溫10000g離心空的HiBindDNAMinicolumn1分鐘，干燥基質。干燥完畢后將HiBindDNAMinicolumn安置于新的滅菌過的1.5毫升的離心管上，在HiBindDNAMinicolumn中的膜的中央處加入60微升滅菌的去離子水，室溫靜置1分鐘后，10000g離心1分鐘洗脫DNA，可以再洗脫一次提高產量，在-2(TC貯存。(7)陽性質粒的酶切及測序選用適當的限制性內切酶進行酶切以鑒定重組質粒，將酶切鑒定正確的重組質粒送測序公司進行序列測定。本發明中，重組質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。二、PCR-RFLP方法的建立1中國草原紅牛G服基因部分片段的獲得GHR基因擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示為特異性PCR產物，見圖l，其中M泳道為標準分子量Marker,1-8泳道為被檢測的8個PCR產物。將PCR產物回收測序，結果顯示產物長度為489bp。2RFLP方法建立限制性內切酶^fe^C/可自行選擇。本發明中為得到高效、高速的效果，選用BioBasicInc.(BBI公司)的^t467內切酶。PCR產物酶切反應體系為15微升，其中IXBufferW[其中含lOmMTris-HCl(PH8.0)，lOmMMgCl2，lOOmMNaCl,ImMDTT]1.5微升，PCR產物5微升，限制性內切酶0微升(10U)，用二餾水補足至15微升，將樣品混合均勻后37'C恒溫水浴5小時。恒溫水浴結束后，取5微升酶切產物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型。在該對引物的第2S8bp位置存在A/G等位突變，該突變引起氨基酸的改變，并導致限制性內切酶^^^Y位點發生改變。當該位點為G堿基時存在酶切位點(電泳檢測結果為287bp+202bp)，命名為A等位基因；當該位點為A堿基時，不存在酶切位點(489bp),命名為B等位基因。這兩個等位基因可組成3種基因型。即AA、BB、AB。如圖2所示，其中M泳道為標準分子量Marker,1-2泳道為BB型，3-4泳道為AB型，5-6泳道為AA型。三、對標記性狀進行關聯分析在利用已屠宰的中國草原紅牛共145個基因組DNA樣品(基因組DNA提取自肝臟和血液)，分析性狀包括部分屠宰性狀。運用SPSS12.0軟件中的GeneralLinearModel過程，建立如下模型并消除系統效應來分析不同基因型和性狀間的關聯。統計分析模型為Yi=y+Gj+ei。其中，Yi為被觀測個體的生產性能表型值；u為生產性能的最小二乘均值；Gj為基因型對生產性能的效應值；ei為對應于觀察值的隨機殘差。實施例1在中國吉林省桶榆縣三家子鄉的中國草原紅牛中隨機抽取一個23月齡的待屠宰個體，在屠宰時采集血液進行基因組DNA的提取并整理其相關的性狀資料。提取的基因組DNA經分光光度儀測定，濃度為32.44ug/ml,OD260/OD280Ratio為1.824。利用本發明設計的引物、PCR反應體系和條件進行PCR擴增。PCR反應總體系為25微升，其中10X反應緩沖液[10腿ol/LTris-HCL(PH8.0)，50咖ol/LKC1，0.l%TritonX-100]2微升，10mmol/LdNTP0.5微升，25mmol/LMgChl.5微升，引物濃度為1.Oumol/L,上游引物和下游引物各0.5微升，0.5微升(2U/ul)TaqDNA聚合酶，1微升提取的基因組DNA(含32.44ng基因組DNA)，四餾水19.5微升。循環程序94。C預變性5分鐘，94。C變性45秒，6(TC復性45秒，72t:延伸45秒，共35個循環。最后，72。C延伸10分鐘。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示為特異性PCR產物。如圖4所示，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的PCR產物。將PCR產物按本發明設計的RFLP方法進行酶切反應。PCR產物酶切反應體系為15微升，其中1XBufferl.5微升，PCR產物5微升，限制性內切酶&"C/1.0微升(10U/ul),二餾水7.5微升。將樣品混合均勻后，37'C恒溫水浴5小時。為提高酶切反應效率，可每隔l小時將反應管取出，將部分蒸發的液體輕甩到管底部。酶切反應結束后，取5微升酶切產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，并記錄其基因型。如圖5所示，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的酶切產物。經鑒定，此個體屬于AA型。其性狀與本發明所預測的值的對比見表5。表5實施例1中抽取的個體性狀測量值與估計值對比<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例2在中國吉林省農科院畜牧分院飼養的中國草原紅牛中隨機抽取一個21月齡的待屠宰個體，在屠宰時采集血液進行基因組DNA的提取并整理其相關的性狀資料。提取的基因組DNA經分光光度儀測定，濃度為37.25ug/ml,0D260/0D280Ratio為1.792。利用本發明設計的引物、PCR反應體系和條件進行PCR擴增。PCR反應總體系為25微升，其中10X反應緩沖液[10mmol/LTris-HCL(PH8.0)，50mmol/LKC1，0.l%TritonX-100]2微升，10mmol/LdNTP0.5微升，25mmol/LMgCl2l.5微升，引物濃度為1.0umol/L，上游引物和下游引物各0.5微升，0,5微升(2U/ul)TaqDNA聚合酶，1微升提取的基因組DNA(含37.25ng基因組DNA)，四餾水19.5微升。循環程序94'C預變性5分鐘，94'C變性45秒，6CTC復性45秒，72。C延伸45秒，共35個循環。最后，72'C延伸10分鐘。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示為特異性PCR產物.如圖6所示，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的PCR產物。將PCR產物按本發明設計的RFLP方法進行酶切反應。PCR產物酶切反應體系為15微升，其中1XBufferl.5微升，PCR產物5微升，限制性內切酶A^^TL0微升(10U/ul)，二餾水7.5微升，將樣品混合均勻，37"恒溫水浴5小時。為提高酶切反應效率，可每隔1小時將反應管取出，將部分蒸發的液體輕甩到管底部。酶切反應結束后，取5微升酶切產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，并記錄其基因型。如圖7所示，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的酶切產物。此個體屬于AB型。其性狀與本發明所預測的值的對比見表6。表6實施例2中抽取的個體性狀測量值與估計值對比性狀實際值測量值預測值宰前活重566.7561.5556±52.29749胴體重344.9328.7000±56.47222腎脂重9.29.2222±2.04803骨重57.150.5000±13.37675凈肉重267.8278.2000±50.90971肉骨比4.694.4830±0.88485肋脂厚0.90.9444±0.15092眼肌面積122.55131.2944±15.80991實施例3在中國吉林省農科院畜牧分院飼養的中國草原紅牛中隨機抽取一個22月齡的待屠宰個體，在屠宰時采集血液進行基因組DNA的提取并整理其相關的性狀資料。提取的基因組DNA經分光光度儀測定，濃度為38.27微克/毫升，OD260/OD280比率為1.811。利用本發明設計的引物、PCR反應體系和條件進行PCR擴增。PCR反應總體系為25微升，其中10X反應緩沖液[10mmol/LTris-HCL(PH8.0)，50咖ol/LKC1，0.l%TritonX-100]2微升，10mmol/LdNTP0.5微升，25mmol/LMgCl2l.5微升，濃度為1.0畫1/L的上游引物和下游引物各0.5微升，0.5微升(2U/ul)TaqDNA聚合酶，1微升提取的基因組DNA(含38.27納克基因組DNA)，四餾水19.5微升。循環程序94""C預變性5分鐘,94"C變性45秒，6(TC復性45秒，72'C延伸'45秒，共35個循環。最后，72'C延伸10分鐘。擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示為特異性PCR產物。如圖8，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的PCR產物。將PCR產物按本發明設計的RFLP方法進行酶切反應。PCR產物酶切反應體系為15微升，其中lXBufferl.5微升，PCR產物5微升，限制性內切酶淑^7L0微升(10U/ul)，二餾水7.5微升，將樣品混合均勻后，37'C恒溫水浴5小時。為提高酶切反應效率，可每隔1小時將反應管取出，將部分蒸發的液體輕甩到管底部。酶切反應結束后，取5微升酶切產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，并記錄其基因型。如圖9，其中M泳道為標準分子量Marker,泳道1為被檢測的酶切產物。此個體屬于BB型。其性狀與本發明所預測的值的對比見表7。表7實施例3中抽取的個體性狀測量值與估計值對比<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>權利要求1、一種克隆中國草原紅牛GHR基因部分序列的方法，(1)采集中國草原紅牛血液，(2)從中國草原紅牛血液中提取基因組DNA，(3)設計特異性引物并進行PCR擴增，(4)克隆所擴增的中國草原紅牛GHR基因序列并測序，其特征是所述的設計特異性引物并進行PCR擴增，所設計一對特異引物為上游引物5`-CAGCAGCCCAGTGTTATC-3`下游引物5`-GCCCTGTGGAGACTGTACTAT-3`PCR反應總體系為25微升，其中10×反應緩沖液2微升，10mmol/LdNTP0.5微升，25mmol/LMgCl21.5微升，1.0umol/L的上游引物和下游引物各0.5微升，1UTaqDNA聚合酶，20-50納克基因組DNA，最后用四餾水補足至25微升；循環程序如下94℃預變性5分鐘，94℃變性45秒，60℃復性45秒，72℃延伸45秒，共35個循環。循環之后，72℃延伸10分鐘。全部反應完成后，PCR擴增產物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測；所克隆的中國草原紅牛生長激素受體基因的核苷酸序列如下CAGCAGCCCAGTGTTATCCTAGTAGAGGAAAACAAACCAAGACCACTTCTCATTGGTGGAACTGAGTCAACTCATCAAGCTGTCCATACACAGCTCAGCAATCCAAGTTCATTGGCAAACATTGATTTTTATGCCCAGGTAAGCGACATTACACCAGCAGGAAATGTGGTCCTTTCCCCAGGCCAAAAGAATAAGACTGGGAACCCCCAGTGTGACACGCACCCAGAAGTGGTCACACCCTGCCAAGCTAACTTCATCGTGGACAACGCTTACTTCTGCGAGGTAGACid="icf0001"file="A2009100670050002C1.tif"wi="8"he="7"top="216"left="58"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>CCAAAAAGTACATTGCCCTGGCCCCTCATGTCGAGGCTGAATCACACGTAGAGCCAAGCTTTAACCAGGAAGACATTTACACCACCACAGAAAGCCTTACCACTACAGCTGGGAGGTCGGGGACAGCAGAACATGTTCCAAGTTCTGAGATACCTGTCCCAGATTATACCTCCATTCATATAGTACAGTCTCCACAGGGC，其中，id="icf0002"file="A2009100670050003C1.tif"wi="10"he="6"top="38"left="48"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>為此序列片段中突變位點的兩種單核苷酸，該序列中只存在A或G的一種；所述的序列長度為489bp，是外顯子10的一部分。2、一種PCR-RFLP方法，其特征是在生長激素受體基因片段的核苷酸序列中，第289位堿基處存在有一個堿基突變位點，導致限制性片段長度多態性的產生；將此突變位點作為一個分子標記，通過PCR-RFLP的方法，使用限制性內切酶i^MC/檢測此突變位點，并將檢測結果與中國草原紅牛屠宰性狀相關聯，為中國草原紅牛的選種選育提供理論基礎。3、一種對標記性狀進行關聯分析，其特征是使用SPSS12.0軟件中的GeneralLinearModel過程，建立如下模型并消除系統效應來分析不同基因型和部分屠宰性狀的關聯。統計分析模型為Yi=y+Gj+ei。其中，Yi為被觀測個體的生產性能表型值；P為生產性能的最小二乘均值；Gj為基因型對生產性能的效應值；ei為對應于觀察值的隨機殘差。利用本發明中建立的PCR-RFLP方法即可檢測處在任何生長階段的中國草原紅牛GHR基因型并評估其生長潛力。另外，可通過檢測21-23月齡的育肥中國草原紅牛個體的G服基因，提出部分屠宰性狀的估測值。全文摘要本發明屬于動物基因工程
技術領域：
，是一種生長激素受體基因作為中國草原紅牛優良屠宰性狀的分子標記及應用。所獲得的GHR基因片段的核苷酸序列長度為489bp，是外顯子10的一部分。在第289位堿基處存在有一個堿基突變，導致限制性片段長度多態性的產生。將此突變位點作為一個分子標記，通過PCR-RFLP即聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性的方法，使用限制性內切酶BstACI檢測此突變位點，并將檢測結果與中國草原紅牛屠宰性狀相關聯，為中國草原紅牛的選種選育提供理論基礎。本發明的特點在于獲得與中國草原紅牛優良屠宰性狀相關的GHR基因部分片段，并對該片段進行多態性分析，為中國草原紅牛的標記輔助選擇提供分子標記。文檔編號C12P19/34GK101633943SQ20091006700公開日2010年1月27日申請日期2009年5月25日優先權日2009年5月25日發明者健吳,昊姜,張嘉保,張國梁,張金玉,陽曹,秦立紅,胡成華,趙志輝,趙玉民申請人:吉林大學;吉林省農業科學院