IDL4成熟多肽植物衰老促進劑、制備方法及應用與流程

本發明涉及植物衰老促進劑領域，尤其涉及一種IDL4成熟多肽植物衰老促進劑及其制備方法和應用。

背景技術：

葉片衰老是影響農作物產量、品質等農藝性狀的重要因素。以煙草為例，煙草是重要經濟作物，葉片是其收獲器官，隨著煙草進入生育后期，葉片進入衰老階段，煙草上部、中部、下部葉片成熟時期不相同，通常，生產上采用不同部位不同時期采收的策略完成，拖延了采收時間；另一方面，環境因素如接近采收時期連續雨天可能會造成煙葉“二次返青”影響采收。因此，利用衰老促進劑，可以促進植物葉片衰老，可有效解決不同部位煙草葉片成熟度不一致及返青問題。

目前，對植物衰老控制的應用主要集中在對植物激素的調節方面，生長素、細胞分裂素等可抑制葉片衰老，乙烯、脫落酸可促進葉片衰老；人為減緩葉片衰老進程，一方面可以通過減少衰老促進激素的合成或代謝，另一方面也可增加衰老抑制激素的合成或代謝。

衰老相關的功能解析的工作已較廣泛和深入的開展，大量促進葉片衰老的基因被功能解析。例如，擬南芥2-氧化戊二酸依賴的雙加氧酶基因缺失會使葉片衰老延遲表型；地塞米松(DEX)誘導該基因過量表達后，可使轉基因擬南芥葉片衰老提前；擬南芥AtNAC家族成員NAP基因過量表達可使葉片提早衰老，而NAP基因缺失突變體則推遲衰老，同樣，在水稻中該基因也能夠影響葉片衰老；除此之外，植物小RNA，WRKY等轉錄因子家族等都可調控葉片的衰老。但至目前，已報道的衰老相關基因真正直接應用到作物生產中的還鮮有報道。

多肽是動植物體內的一類具有調控作用的小分子物質，植物多肽參與了多項發育過程，例如根分生組織發育、莖端分生組織發育等，但植物多肽是否參與衰老，還未見報道，成熟多肽是由前體蛋白經過翻譯后剪切、修飾，最終形成只有較短氨基酸組成的功能分子，作為配體與定位在細胞膜上的受體識別，啟動信號轉導。成熟多肽直接外施對植物生長可產生影響，如根的伸長。目前成熟多肽在植物尤其是作物上的應用研究很少，目前更沒有將其應用在促進植物衰老方面的研究。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種IDL4成熟多肽植物衰老促進劑、制備方法及應用。該IDL4成熟多肽植物衰老促進劑可以促進植物的葉片衰老，使其衰老加速，并且無其它額外不良表型。

本發明一方面提供了IDL4成熟多肽植物衰老促進劑，該植物衰老促進劑功能成份為IDL4成熟多肽，IDL4成熟多肽的氨基酸序列為Pro-Val-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Ser-Arg-Lys-His-Asn。

優選的，所述IDL4成熟多肽植物衰老促進劑包括：IDL4成熟多肽，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物溶解于1/2MS液體培養基或MS液體培養基。

優選的，所述IDL4成熟多肽植物衰老促進劑中，IDL4成熟多肽的濃度為8-10μmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸的濃度為2.5-3mmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為5.8-6。

更優選的，所述IDL4成熟多肽植物衰老促進劑中，IDL4成熟多肽的濃度為10μmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸的濃度為3mmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為5.8。

優選的，本發明的IDL4成熟多肽植物衰老促進劑還可加入助劑，優選的，助劑為Triton X-100，加入量為植物衰老促進劑總量的1-3‰。

本發明另一方面提供了IDL4成熟多肽植物衰老促進劑的制備方法，具體的，該方法包括如下步驟：

(1)稱量IDL4成熟多肽粉末溶解在水或二甲基亞砜溶劑中，配制成濃度為8-10mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用；

(2)配制1/2MS液體培養基或MS液體培養基，稱取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述1/2MS液體培養基或MS液體培養基中，配制成2.5-3mmol/L的溶液，調節溶液pH值為5.8-6，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；

(3)將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液中，IDL4成熟多肽母液與2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液體積比為1:1000，玻璃棒攪拌均勻，得到IDL4成熟多肽植物衰老促進劑。

優選的，步驟(1)中溶劑為二甲基亞砜；步驟(2)中優選1/2MS液體培養基；步驟(3)中IDL4成熟多肽植物衰老促進劑中加入1-3‰的Triton X-100，用玻璃棒攪拌均勻。

優選的，步驟(1)中IDL4成熟多肽母液現用現配，若超過一月不使用，母液-70℃儲存；若一月之內使用，母液-20℃儲存。

本發明的另一方面還提供了上述IDL4成熟多肽植物衰老促進劑在促進植物衰老方面的應用，施用于植物的葉面，具體的，施用方法為：直接葉面噴灑或用IDL4成熟多肽植物衰老促進劑浸泡棉球涂抹葉面，植物葉片完全伸展時期即可使用，優選的，煙草可在成熟前期葉面施用。

本發明的有益效果在于：(1)本發明的IDL4成熟多肽植物衰老促進劑中的IDL4成熟多肽人工合成方便，獲取便利，可大批量合成；(2)本發明的植物衰老促進劑的配制和使用方法簡單，田間可操作性強，對于施用人員不需要經過特殊培訓，操作便利、實用；(3)本發明的植物衰老促進劑對葉片衰老影響適度，不會造成不良反應，效果有益。

附圖說明

圖1為擬南芥上IDL4基因缺失延遲葉片衰老示意圖；

圖2為人工合成的IDL4成熟多肽植物衰老促進劑處理擬南芥及煙草離體葉片結果示意圖；

圖3為IDL4成熟多肽植物衰老促進劑處理活體煙草葉片結果示意圖。

具體實施方式

下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。

本發明實施例提供了一種IDL4成熟多肽植物衰老促進劑，包括IDL4成熟多肽，IDL4成熟多肽的氨基酸序列為P-V-P-A-S-A-P-S-R-K-H-N，具體的，氨基酸序列為Pro-Val-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Ser-Arg-Lys-His-Asn，該植物衰老促進劑包括：8-10μmol/L IDL4成熟多肽，2.5-3mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于1/2MS液體培養基或MS液體培養基，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為5.8-6。

可以理解的是，IDL4成熟多肽的濃度可以為8、9、10μmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的濃度可以為2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3mmol/L，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH可以為5.8、5.9、6。

具體的，在本發明的上述實施例中，IDL4成熟多肽植物衰老促進劑還包括助劑，所述助劑可以為本領域用于葉面潤濕和葉面延展的常規助劑，本發明加入的助劑為Triton X-100，加入量為植物衰老促進劑總量的1-3‰，但是可以理解的是，本領域任何常用的葉面用助劑均可加入從而促進本發明的IDL4成熟多肽植物衰老促進劑的應用，例如本領域的表面活性劑、延展劑、潤濕劑等。

本發明的又一實施例提供了IDL4成熟多肽植物衰老促進劑的制備方法，具體的，該方法包括如下步驟：

S1稱量IDL4成熟多肽粉末溶解在水或二甲基亞砜溶劑中，配制成濃度為8-10mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用。

在本步驟中，由于二甲基亞砜對多肽的溶解性能更好，可以更好的促進多肽的溶解，更好的促進多肽提供相應功能。由于IDL4成熟多肽對儲存溫度有較高要求(不易在室溫放置超過24小時)，因此IDL4成熟多肽母液現用現配，若超過一月不使用，母液-70℃儲存；若一月之內使用，母液-20℃儲存。

S2配制1/2MS液體培養基或MS液體培養基，稱取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述1/2MS液體培養基或MS液體培養基中，配制成2.5-3mmol/L的溶液，調節溶液pH值為5.8-6，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液。

本步驟中MS或1/2MS液體培養基不僅能夠充分溶解2-(N-嗎啉)乙磺酸，從而保證在植物表面形成一定的滲透式，為多肽的作用提供基礎，同時，該液體培養基作為溶劑還能提供相應的大中量元素營養，保證作用效果。

S3將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液中，IDL4成熟多肽母液與2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液體積比為1:1000，玻璃棒攪拌均勻，得到IDL4成熟多肽植物衰老促進劑。

本步驟中可加入1-3‰的Triton X-100，相應的助劑能夠促進上述溶液盡快的在植物表面進行延展和滲透濕潤。本步驟即為將IDL4成熟多肽母液用2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液稀釋1000倍。

本發明的又一實施例提供了該IDL4成熟多肽植物衰老促進劑在促進植物衰老方面的應用，施用方法為：直接葉面噴灑或用IDL4成熟多肽促進劑浸泡棉球涂抹葉面，植物葉片完全伸展時期即可使用，優選的，煙草可在成熟前期葉面施用。

噴灑或浸泡該IDL4成熟多肽植物衰老促進劑的棉球涂抹植物葉片，可使植物生長狀態不受影響的前提下，促進植物葉片衰老，特別有利于葉片不同步衰老作物的一致性采收，例如煙草。

上述實施例的IDL4成熟多肽植物衰老促進劑中IDL4成熟多肽人工合成方便，獲取便利，可大批量合成；配制和使用方法簡單，田間可操作性強，對于施用人員不需要經過特殊培訓，操作便利、實用；該植物衰老抑制劑對葉片衰老影響適度，不會造成不良反應，尤其在煙草上具備顯著的應用效果。

為了更清楚詳細地介紹本發明實施例所提供的IDL4成熟多肽植物衰老促進劑，下面將結合具體實施例進行描述。

實施例1

IDL4成熟多肽植物衰老促進劑，包括：10μmol/L IDL4成熟多肽，3mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于1/2MS液體培養基或MS液體培養基，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為5.8。

制備方法如下：

(1)稱量IDL4成熟多肽粉末溶解在二甲基亞砜溶劑中，配制成濃度為10mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用；

(2)配制1/2MS液體培養基，稱取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述1/2MS液體培養基中，配制成3mmol/L的溶液，調節溶液pH值為5.8，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；

(3)將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液取50μL加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液50mL中，玻璃棒攪拌均勻，得到50mL的IDL4成熟多肽植物衰老促進劑。

實施例2

IDL4成熟多肽植物衰老促進劑，包括：8μmol/L IDL4成熟多肽，2.5mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于MS液體培養基，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為5.9。

制備方法如下：

(1)稱量IDL4成熟多肽粉末溶解在二甲基亞砜溶劑中，配制成濃度為8mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用；

(2)配制MS液體培養基，稱取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述MS液體培養基中，配制成2.5mmol/L的溶液，調節溶液pH值為5.9，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；

(3)將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液取100μL加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液100mL中，玻璃棒攪拌均勻，得到100mL的IDL4成熟多肽植物衰老促進劑。

實施例3

IDL4成熟多肽植物衰老促進劑，包括：9μmol/L IDL4成熟多肽，2.7mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于MS液體培養基，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為6。

制備方法如下：

(1)稱量IDL4成熟多肽粉末溶解在水中，配制成濃度為9mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用；

(2)配制1/2MS液體培養基，稱取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述1/2MS液體培養基中，配制成2.7mmol/L的溶液，調節溶液pH值為6，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；

(3)將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液取20μL加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液20mL中，玻璃棒攪拌均勻，加入1‰的Triton X-100，得到20mL的IDL4成熟多肽植物衰老促進劑。

實施例4

IDL4成熟多肽植物衰老促進劑，包括：9μmol/L IDL4成熟多肽，2.7mmol/L 2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；所述2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液為2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液一水合物溶解于MS液體培養基，2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液的pH為6。

制備方法如下：

(1)稱量IDL4成熟多肽粉末溶解在水中，配制成濃度為9mmol/L的IDL4成熟多肽母液備用；

(2)配制1/2MS液體培養基，稱取定量的2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物，加入到上述1/2MS液體培養基中，配制成2.7mmol/L的溶液，調節溶液pH值為6，充分混合溶解均勻得到2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液；

(3)將步驟(1)得到的IDL4成熟多肽母液取200μL加入到步驟(2)制得的2-(N-嗎啉)乙磺酸溶液200mL中，玻璃棒攪拌均勻，加入3‰的Triton X-100，得到200mL的IDL4成熟多肽植物衰老促進劑。

試驗測試

通過進行擬南芥上IDL4基因缺失處理，參見圖1。模式雙子葉植物擬南芥中IDL4基因缺失突變體idl4，與野生型對照在相同條件下表型分析：持續光照生長25天，植物材料生長狀態整體表型觀察及葉片采摘后比較觀察，結果表明，圖1的A、B圖可以看出IDL4基因缺失突變體延遲葉片衰老，同時，利用乙醇法測定不同材料相同葉位(第6葉位)葉綠素含量，進一步分析各材料衰老表征參數，結果如圖1的C圖，野生型較idl4突變體葉綠素含量偏低；另外，對不同材料各取30株統計，對葉片衰老情況進行分析，發現圖1的D圖表明野生型較idl4突變體葉片衰老較為明顯，綜上說明，當IDL4基因缺失后，植物表現出了晚衰的癥狀，進一步說明IDL4多肽在促進葉片衰老方面的作用。

取實施例1制備的IDL4成熟多肽植物衰老促進劑，按照施用方法分別處理擬南芥、煙草的離體葉片和煙草的活體葉片。

處理1：處理擬南芥葉片：持續光照生長擬南芥35天左右，獲取同葉位離體葉片(第六葉位)，將其平放在濾紙上，多肽試劑均勻、充分噴灑，同時，對照為3mM 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)處理，1/2MS水溶液處理，觀察表型。

處理2：煙草旺長期，處理離體葉片，處理方式為噴灑，對照與處理1相同處理

處理3：煙草旺長期，處理煙草活體葉片，處理方式為用棉球涂抹煙草葉片，對照與處理1相同處理，表型觀察。

參見圖2，用鑷子選取長勢一致的相同葉位(第六蓮座葉)擬南芥葉片，較規則的放在培養皿中，IDL4成熟多肽植物衰老促進劑以噴灑的方式處理，同時加對照相同方式處理，持續光照下放置5天，結果可以看出，圖A、B表明IDL4成熟多肽植物衰老促進劑促進擬南芥葉片衰老，擬南芥離體葉片3天后噴灑有IDL4成熟多肽植物衰老促進劑的葉片有明顯早衰表型，同時利用乙醇法測定葉綠色含量，發現對照較IDL4成熟多肽植物衰老促進劑處理的葉片葉綠素含量明顯多；另外，圖C表明IDL4成熟多肽衰老促進劑促進煙草葉片衰老，選取旺長期煙草長勢一致的葉片，利用IDL4衰老促進劑及對照噴灑，煙草離體葉片5天后有可見早衰性狀。綜上表明，IDL4成熟多肽植物衰老促進劑對植物離體葉片有促進衰老的作用。

參見圖3，以生長在持續光照，27℃條件下生長約25天的本氏煙草為材料，棉球浸泡分別在IDL4成熟多肽植物衰老促進劑工作液及對照中5分鐘，使其完全浸透，處理過的棉球處理活體煙草葉片13天后有可見早衰性狀，參見圖A；同時，利用乙醇法測定涂抹IDL4成熟多肽植物衰老促進劑及對照后13、21天煙草葉片葉綠素含量，結果表明與對照相比，IDL4成熟多肽植物衰老促進劑處理后的煙草葉片葉綠素含量都降低，參見圖B。綜上表明，IDL4成熟多肽植物衰老促進劑確實對活體植物葉片有明顯促進衰老的作用。