一種茄子花藥培養直接獲得植株的方法和培養基與流程

本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及一種茄子花藥培養直接獲得植株的方法和培養基。

背景技術：

花藥培養是獲得單倍體植株的重要途徑，通過該技術可以快速獲得純合二倍體，具有縮短育種周期、提高選擇效率、克服遠緣雜種的不育性等優勢，還可以作為分子標記和遺傳圖譜繪制研究的良好材料。

由花藥培養或游離小孢子培養獲得茄子單倍體植株主要有三種途徑：1、先脫分化形成愈傷組織，再誘導愈傷組織分化形成胚狀體，最后由胚狀體發育成完整植株；2、由誘導形成的愈傷組織直接分化出不定芽，不定芽再發育為完整的植株；3、直接獲得胚狀體，發育成完整植株。

茄子花藥培養研究開展較早，自從Raina和Iyer等于1973年首次報道通過花藥培養經愈傷組織途徑獲得茄子單倍體植株以來，茄子花藥培養和小孢子培養都有成功報道。雖然不少茄子品種或雜交種已獲得了DH植株，但遠沒有像茄科另一作物煙草那樣具有高效的單倍體再生系統，從而阻礙了該技術在茄子生產中大規模應用。

目前茄子花藥培養大多經過脫分化形成愈傷組織和愈傷組織分化胚狀體或不定芽這兩個階段，需要置于兩種不同的培養基上進行培養，轉接工作量大，但愈傷組織的分化頻率卻較低；游離小孢子培養可以直接獲得胚狀體，但方法較為繁瑣，且胚狀體的誘導頻率低，不能完全滿足生產上對單倍體植株的需求。因此，如何建立高效、簡捷的胚狀體誘導體系，獲得大量單倍體植株，是現在茄子育種亟待解決的問題。

技術實現要素：

本發明的目的在于公開了一種茄子花藥培養直接獲得植株的方法.

本發明另一個目的在于公開了用于茄子花藥培養直接獲得植株的方法的培養基。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種茄子花藥培養直接獲得植株的方法，包括下述步驟：

(1)、胚狀體的獲得：將單核靠邊期的無菌花藥接種于花藥培養固體培養基中，33～37℃黑暗培養2～8天，轉至25-28℃光照培養30-40天，可見胚狀體由裂開的花藥壁內萌發出來；

所述花藥培養固體培養基的組成為：950mg/L KNO₃、825mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.5mg/L葉酸、0.05mg/L生物素、800mg/L谷氨酰胺、100mg/L絲氨酸、30mg/L谷胱甘肽(GSH)、0.1～1mg/L KT、0.1～1mg/L IAA、0.01～0.05mg/L NAA、0.1％～0.3％活性炭、3％～6％蔗糖和0.6％～0.8％瓊脂；固體培養基的pH值為5.8；

(2)、再生單倍體植株的獲得：當胚狀體生長到子葉型胚狀體階段，將其轉接至健苗生根固體培養基中繼續培養，長成完整植株；

所述健苗生根固體培養基的組成為：1900mg/L KNO₃、1650mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、0.5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.01～0.1mg/L KT、0.1～0.5mg/L IBA、3％蔗糖和0.8％瓊脂；健苗生根固體培養基的pH值為5.8。

上述技術方案所述的一種茄子花藥培養直接獲得植株的方法，其中，在所述方法之前還包括下述步驟：

(1)、新鮮花蕾的選取：選取小孢子處于單核靠邊期的花蕾，通過DAPI染色確定花粉發育時期為單核靠邊期；

(2)、花蕾的表面消毒、無菌花藥的獲得：花蕾用75％酒精浸泡0.5-1分鐘，5％的次氯酸鈉溶液浸泡3-5分鐘，無菌水沖洗3-5次，無菌濾紙吸干水分。

上述技術方案所述培養方法中培養無菌花藥的培養基，其中，所述無菌花藥培養固體培養基的組成為：950mg/L KNO₃、825mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.5mg/L葉酸、0.05mg/L生物素、800mg/L谷氨酰胺、100mg/L絲氨酸、30mg/L谷胱甘肽(GSH)、0.1～1mg/L KT、0.1～1mg/L IAA、0.01～0.05mg/L NAA、0.1％～0.3％活性炭、3％～6％蔗糖和0.6％～0.8％瓊脂；固體培養基的pH值為5.8。

上述技術方案所述培養方法中健苗生根的培養基，其中，所述健苗生根固體培養基的組成為：1900mg/L KNO₃、1650mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、0.5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.01～0.1mg/L KT、0.1～0.5mg/L IBA、3％蔗糖和0.8％瓊脂；健苗生根固體培養基的pH值為5.8。

本發明具有以下有益效果：

(1)、本發明所采用的培養方法步驟少、簡單易行，由花藥離體培養直接誘導胚狀體獲得單倍體植株。由于本發明采用的方法不經過愈傷組織過程，所以不存在愈傷組織分化問題，避免了花藥培養誘導形成的愈傷組織轉接至分化培養基，再誘導形成再生植株的過程；也避免了由花藥壁等二倍體體細胞參與愈傷組織形成而出現的倍性混雜現象。

(2)、本發明采用的方法具有單倍體植株再生周期短、誘導頻率高、省時省力等優點。同時克服了基因型障礙，不同基因型紫色和綠色圓茄、長茄的花藥培養都獲得了較高的胚狀體誘導率。

(3)、現有技術中采用小孢子培養可以直接獲得胚狀體，雖然不受花藥壁等二倍體細胞的干擾，但培養技術難度較大、不易操作，而且胚狀體誘導率較低，一般都在10％以下，而采用本發明的方法，胚狀體誘導頻率一般在20％-40％。

具體實施方式：

為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對本發明一種茄子花藥培養直接獲得植株的方法和培養基作進一步的說明。

實施例1：紫萼片紫色圓茄的花藥培養：

2015年5-6月間，從種植大棚取回花蕾，花粉經DAPI(4，6-聯脒-2-苯基吲哚)染色確認發育時期為單核靠邊期。花蕾經75％酒精1分鐘，5％次氯酸鈉5分鐘表面消毒，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干水分。用小鑷子小心地將花藥取出，置于花藥培養固體培養基中，37℃黑暗培養3天后轉至25℃光照下繼續培養；30天左右，肉眼可見白色胚狀體從裂開的花藥壁內萌發出來；

當胚狀體分化出兩片小子葉時將其轉至健苗生根固體培養基中上繼續生長，進行壯苗及生根。1130個花藥共產出胚狀體446個，胚狀體誘導率為39.5％；

其中，無菌花藥培養固體培養基的組成為：950mg/L KNO₃、825mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.5mg/L葉酸、0.05mg/L生物素、800mg/L谷氨酰胺、100mg/L絲氨酸、30mg/L谷胱甘肽(GSH)、0.1～1mg/L KT、0.1～1mg/L IAA、0.01～0.05mg/L NAA、0.1％～0.3％活性炭、3％～6％蔗糖和0.6％～0.8％瓊脂；固體培養基的pH值為5.8；

其中，健苗生根固體培養基的組成為：1900mg/L KNO₃、1650mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、0.5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.01～0.1mg/L KT、0.1～0.5mg/L IBA、3％蔗糖和0.8％瓊脂；健苗生根固體培養基的pH值為5.8。

實施例2：

按照實施例1的實施過程，2013-2016年間對13種不同基因型的茄子分別進行了實驗，其中對4個茄子雜交種(A、C、G、J)進行了重復實驗，結果如表2所示，表2中雜交種A于2014年和2015年進行了重復實驗；雜交種C于2015年和2016年進行了重復實驗；雜交種G于2014年和2015年進行了重復實驗；雜交種J于2015年和2016年進行了重復實驗：

表2不同基因型茄子花藥培養的胚狀體誘導結果

由表2可知，采用本發明的方法，胚狀體誘導頻率一般在20％-40％。

以上所述，僅為本發明的較佳實施例，并非對本發明作任何形式上和實質上的限制，凡熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案范圍內，當可利用以上所揭示的技術內容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發明的等效實施例；同時，凡依據本發明的實質技術對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發明的技術方案的范圍內。