本發明涉及欖葉柯無性繁殖技術，尤其是一種欖葉柯初代培養芽誘導方法。
背景技術：
欖葉柯（Lithocarpus oleaefolius A. Camus）又名欖葉石櫟、欖葉椆，系殼斗科（Fagaceae）柯屬（Lithocarpus）喬木，高8～15米，芽鱗幾無毛，一年生枝、葉柄、葉背及花序軸被易脫落的褐銹色或棕黃色長柔毛，二年生枝暗褐黑色，皮孔甚小，不易察見。樹皮暗灰至灰黑色，不開裂，樹高約13米的樹皮厚約8毫米，內皮淡紅褐色，脊棱顯著突出。果實含淀粉為50%～60%。分布于江西、福建、湖南、貴州四省南部、廣東、廣西。生于海拔500～1200米山地雜木林中。
目前，欖葉柯資源仍處于野生分布狀態，但隨著保持植物多樣性的需求，規模化人工栽培欖葉柯資源勢在必行。組織培養技術是一種快速無性繁殖技術，選擇欖葉柯優良家系或者無性系為材料，通過組織培養方法繁殖苗木，既可以滿足生產上的數量要求，又可保持母本性狀。組織培養過程中，初代培養是制約組織培養順利進行的關鍵步驟，其中涉及了外植體的獲取、外植體的消毒、培養基選擇以及培養過程中培養體褐變、苗木玻璃化等重要問題。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種能克服芽誘導過程中外植體褐變以及玻璃化等問題，提高芽誘導率，出芽指數以及萌芽生長狀況，獲取數量多、質量好的萌芽，從而滿足增殖培養的需要，促進欖葉柯組織培養快速繁殖體系的建立的欖葉柯初代培養芽誘導方法。
為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：
一種欖葉柯初代培養芽誘導方法，采用欖葉柯基部萌條為外植體，通過外植體無菌處理后，將外植體接種于優質初代培養芽誘導培養基上，置于適宜的溫度、濕度和光照強度條件下進行培養，誘導芽的萌發；其操作步驟為，
（1）外植體選擇：選擇欖葉柯基部萌發的半木質化的萌條為外植體；
（2）外植體消毒及接種：將欖葉柯萌條經過洗潔精清洗，流水沖洗和化學試劑處理消毒后，剪切成莖段接入芽誘導培養基中；
（3）芽誘導培養：將接種后的外植體置于適宜室內條件下培養。
以上所述的芽誘導培養基其原料含量為：1/3～1/2改良WPM培養基+6-KT 1.0～2.0mg/L+活性炭10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。
以上所述的改良WPM培養基組分和體積重量比為：NH4NO3 820 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇85 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
以上所述的萌條是長為6~9cm、直徑0.2～0.4 cm的半木質化的萌條。
以上步驟（2）所述的消毒及接種方法是將欖葉柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1~5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉速為200 r/min的搖床上清洗10~15 min后置于流水下沖洗1~2 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5~4.0 cm長的莖段接種于芽誘導培養基中，每瓶接種2個莖段。
以上步驟（3）所述的適宜室內條件為：暗培養10d后轉為光照500～1000 lx，光照8～12h/d；培養溫度20±1℃，濕度為50~55 %。
本發明具有的優點及有益效果如下：
1、本發明采用1/3～1/2改良WPM培養基培養基作為基本培養基，同時重點調整了與欖葉柯出芽相關的微量元素和有機成分，使得培養基更科學，更有針對性，有效的克服了欖葉柯組織培養芽誘導過程中易出現的玻璃化現象，更易促使欖葉柯芽誘導的發生，促進了萌芽的生長速度和健壯度。
2、本發明以基部長6~9 cm長的半木質化粗壯萌條作為外植體，保證了外植體較強的分生能力，促進芽的誘導；本發明在外植體采集后進行洗凈、消毒，有效降低外植體的污染率，提高了出芽率。
3、本發明將接種后的外植體置于溫度為度20±1℃，濕度為50~55%，光照由暗培養后轉到強度為500～1000 lx的室內條件下培養，溫度和濕度偏低，光照強度也不高的室內條件，有利于減少芽誘導過程中玻璃化的發生。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
實施例1：
選擇欖葉柯基部萌發、長為6~7cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質化的萌條作為外植體。將欖葉柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為1 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗2 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5 cm長的莖段接種于芽誘導培養基中，每瓶接種2個莖段。
所述的芽誘導培養基其原料含量為：1/3改良WPM培養基+6-KT 1.0mg/L+活性炭10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養基組分和體積重量比為：NH4NO3 820 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內暗培養10d后轉為光照500 lx，光照12h/d的條件下進行培養，誘導芽的萌發。
實施例2：
選擇欖葉柯基部萌發、長為7~8cm、直徑0.2～0.3 cm的半木質化的萌條作為外植體。將欖葉柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為2%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉速為200 r/min的搖床上清洗10 min后置于流水下沖洗1.5 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為3.5 cm長的莖段接種于芽誘導培養基中，每瓶接種2個莖段。
所述的芽誘導培養基其原料含量為：1/3改良WPM培養基+6-KT 1.5mg/L+活性炭10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養基組分和體積重量比為：NH4NO3 820 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為50 %室內暗培養10d后轉為光照500lx，光照10h/d的條件下進行培養，誘導芽的萌發。
實施例3：
選擇欖葉柯基部萌發、長為7~8cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質化的萌條作為外植體。將欖葉柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為4%的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1 h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為4.0 cm長的莖段接種于芽誘導培養基中，每瓶接種2個莖段。
所述的芽誘導培養基其原料含量為：1/2改良WPM培養基+6-KT 1.5mg/L+活性炭10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養基組分和體積重量比為：NH4NO3 820 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內暗培養10d后轉為光照1000 lx，光照10h/d的條件下進行培養，誘導芽的萌發。
實施例4：
選擇欖葉柯基部萌發、長為8~9cm、直徑0.3～0.4 cm的半木質化的萌條作為外植體。將欖葉柯萌條針葉剪去，置于三角瓶中，加入體積濃度為5 %的洗潔精溶液，采用紗布封住瓶口，置于轉速為200 r/min的搖床上清洗15 min后置于流水下沖洗1h，然后用無菌水清洗2次，將外植體轉到超凈工作臺上用體積濃度0.1%氯化汞溶液浸泡消毒10 min；再采用無菌水沖洗8~10次后剪成長為4.0 cm長的莖段接種于芽誘導培養基中，每瓶接種2個莖段。
所述的芽誘導培養基其原料含量為：1/2改良WPM培養基+6-KT 2.0mg/L+活性炭10mg/L+瓊脂5.0g/L+蔗糖20.0g/L。其中改良WPM培養基組分和體積重量比為：NH4NO3 820 mg/L，CaCl2·2H2O 192 mg/L，MgSO4·7H20 300 mg/L，KH2PO4 250 mg/L，Ca(NO3)2·4H2O 180 mg/L，KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·H2O 22.4 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/L，CuSO4·5H2O 0.25 mg/L，Na2·EDTA 37.3 mg/L，FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，肌醇100 mg/L，煙酸1.0 mg/L，鹽酸吡哆醇1.0 mg/L，鹽酸硫胺素2.0 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L。
將接種后的外植體置于溫度20±1℃，濕度為55 %室內暗培養10d后轉為光照1000 lx，光照8h/d的條件下進行培養，誘導芽的萌發。