本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種羽裂唇柱苣苔的組織培養方法。
背景技術：
羽裂唇柱苣苔(Chirita pinnatifida(Hand.-Mazz.)B.L.Burtt)為苦苣苔科唇柱苣苔屬的多年生草本植物。分布于廣西、廣東北部、貴州東南部、湖南南部、江西、福建西部、浙江南部和西部。生于海拔600-1500米的谷林中石上或溪邊。全草可供藥用，用于跌打損傷等癥。此外，羽裂唇柱苣苔還具有極高的觀賞價值，應用前景廣闊。
羽裂唇柱苣苔栽培難度較大，對生長環境要求苛刻。需要高空氣濕度、高土壤濕度，但是同時期根系對土壤水氣化、含氧量有嚴格要求；忌陽光直射，喜弱酸至中性栽培基質；畏熱；喜夏季較高的日夜溫差，夏季日溫最高溫度最好不超過30℃。
目前，有關羽裂唇柱苣苔的研究極少，僅在資源調查中有少量涉及。羽裂唇柱苣苔可以采用種子繁殖或葉片扦插，而組織培養技術具有繁殖速度快、繁殖系數大，繁殖后代整齊一致，能保持原有品種的優良性狀，不受季節的限制等優點，已廣泛應用各種觀賞植物中，目前尚未見有應用于羽裂唇柱苣苔上。
技術實現要素：
針對羽裂唇柱苣苔現有繁育技術的不足之處，本發明提供一種羽裂唇柱苣苔的組織培養方法，從而可以達到快速獲得羽裂唇柱苣苔優質種苗的目的。
為了實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案：
一種羽裂唇柱苣苔的組織培養方法，包括如下步驟：
(1)外植體的消毒滅菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩葉片，先用0.1-0.5％洗衣粉溶液浸泡25-30min后在流水下沖洗30min，并用軟毛刷輕輕刷洗葉片，然后轉入超凈工作臺進行滅菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦葉片表面，無菌水沖洗2次，將葉片在75％酒精中浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，氯化汞滅菌過程中輕輕震蕩使氯化汞充分接觸葉片；葉片切成2cm×2cm大小，接種在MS培養基，得到無菌葉片；
(2)不定芽的誘導：將獲得的無菌葉片切成1cm×1cm大小，并在葉片四周留有切口，接種在不定芽誘導培養基中，經過20-25d的培養，葉片四周的傷口誘導出不定芽；
(3)繼代培養：將獲得的不定芽切取下來，接種在繼代培養基中培養25-30d，得到組培小苗；
(4)生根培養：選取高度為1.5-3.0cm的組培小苗，接種在生根培養基中培養18-20d，得到組培生根苗；
(5)煉苗移栽：將高度為2.5-4.0cm的生根苗移出培養室后揭去組培瓶蓋在自然條件下煉苗4洗凈培養基移栽到裝有基質的50孔穴盤中；澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網的蔭棚下，透光率為40-50％，并采用間歇性噴霧系統控制空氣濕度，每2h噴霧1次，噴霧時間每次40s，確保空氣濕度85％以上，早晚澆透水各1次，移栽后7-10d，即可成活。
作為優選，步驟(2)中的不定芽誘導培養基為MS+6-BA1.0-2.0mg/L+NAA0.01-0.1mg/L。
作為優選，步驟(3)中的繼代培養基為MS+6-BA1.0-2.0mg/L+NAA0.05mg/L+活性炭0.1g/L。
作為優選，步驟(4)中的生根培養基為MS+IBA0.1-0.5mg/L+活性炭0.1g/L。
作為優選，步驟(5)中的基質是由泥炭和珍珠巖按照體積比為2:1組成。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
本發明的羽裂唇柱苣苔的組織培養方法具有后代長勢良好，不定芽多，繁殖速度快、繁殖系數大，繁殖后代整齊一致，生根率高，移栽成活率高的優點。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和本質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
實施例1：
一種羽裂唇柱苣苔的組織培養方法，包括如下步驟：
(1)外植體的消毒滅菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩葉片，先用0.1％洗衣粉溶液浸泡25min后在流水下沖洗干凈30min，并用軟毛刷輕輕刷洗葉片，然后轉入超凈工作臺進行滅菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦葉片表面，無菌水沖洗2次，將葉片在75％酒精中浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，氯化汞滅菌過程中輕輕震蕩使氯化汞充分接觸葉片；葉片切成2cm×2cm大小，接種在MS培養基，得到無菌葉片；
(2)不定芽的誘導：將獲得的無菌葉片切成1cm×1cm大小，并在葉片四周留有切口，接種在不定芽誘導培養基中，經過21d的培養，葉片四周的傷口誘導出不定芽；所述的不定芽誘導培養基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L；
(3)繼代培養：將獲得的不定芽切取下來，接種在繼代培養基中培養25d，得到組培小苗；所述的繼代培養基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+活性炭0.1g/L；
(4)生根培養：選取高度為1.5cm的組培小苗，接種在生根培養基中培養20d；所述的生根培養基為MS+IBA 0.1mg/L+活性炭0.1g/L；
(5)煉苗移栽：將高為2.5cm的生根苗移出培養室后揭蓋在自然條件下煉苗4d；洗凈培養基移栽到裝有基質的50孔穴盤中；澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網的蔭棚下，透光率為40％，并采用間歇性噴霧系統控制空氣濕度，每2h噴霧1次，噴霧時間每次40s，確保空氣濕度85％以上，早晚澆透水各1次，移栽后7d，即可成活；所述的基質是由泥炭和珍珠巖按照體積比為2:1組成。
實施例2：
一種羽裂唇柱苣苔的組織培養方法，包括如下步驟：
(1)外植體的消毒滅菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩葉片，先用0.5％洗衣粉溶液浸泡30min后在流水下沖洗30min，并用軟毛刷輕輕刷洗葉片，然后轉入超凈工作臺進行滅菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦葉片表面，無菌水沖洗2次，將葉片在75％酒精中浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，氯化汞滅菌過程中輕輕震蕩使氯化汞充分接觸葉片；葉片切成2cm×2cm大小，接入MS培養基，得到無菌葉片；
(2)不定芽的誘導：將獲得的無菌葉片切成1cm×1cm大小，并在葉片四周留有切口，接種在不定芽誘導培養基中，經過20d的培養，葉片四周的傷口誘導出不定芽；所述的不定芽誘導培養基為MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.01mg/L；
(3)繼代培養：將獲得的不定芽切取下來，接種在繼代培養基中培養30d，得到組培小苗；所述的繼代培養基為MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.05mg/L+活性炭0.1g/L；
(4)生根培養：選取高度難為3.0cm的組培小苗，接種在生根培養基中培養18d；所述的生根培養基為MS+IBA 0.5mg/L+活性炭0.1g/L；
(5)煉苗移栽：將高為4.0cm的生根苗移出培養室后揭蓋在自然條件下煉苗5d；洗凈培養基移栽到裝有基質的50孔穴盤中；澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網的蔭棚下，透光率為50％，并采用間歇性噴霧系統控制空氣濕度，每2h噴霧1次，噴霧時間每次40s，確保空氣濕度85％以上，早晚澆透水各1次，移栽后10d，即可成活；所述的基質是由泥炭和珍珠巖按照體積比為2:1組成。
實施例3：
一種羽裂唇柱苣苔的組織培養方法，包括如下步驟：
(1)外植體的消毒滅菌：春季取羽裂唇柱苣苔的幼嫩葉片，先用0.2％洗衣粉溶液浸泡28min后在流水下沖洗干凈30min，并用軟毛刷輕輕刷洗葉片，然后轉入超凈工作臺進行滅菌操作，先用棉球蘸取75％酒精拭擦葉片表面，無菌水沖洗2次，將葉片在75％酒精中浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，最后再用0.1％氯化汞溶液處理6min，無菌水沖洗3次，氯化汞滅菌過程中輕輕震蕩使氯化汞充分接觸葉片；葉片切成2cm×2cm大小，接種在MS培養基，得到無菌葉片；
(2)不定芽的誘導：將獲得的無菌葉片切成1cm×1cm大小，并在葉片四周留有切口，接種在不定芽誘導培養基中，經過25d的培養，葉片四周的傷口誘導出不定芽；所述的不定芽誘導培養基為MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L；
(3)繼代培養：將獲得的不定芽切取下來，接種在繼代培養基中培養26d，得到組培小苗；所述的繼代培養基為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L+活性炭0.1g/L；
(4)生根培養：選取高度為2.0cm的組培小苗，接種在生根培養基中培養19d；所述的生根培養基為MS+IBA 0.3mg/L+活性炭0.1g/L；
(5)煉苗移栽：將高為3.0cm的生根苗移出培養室后揭蓋在自然條件下煉苗4d；洗凈培養基移栽到裝有基質的50孔穴盤中；澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網的蔭棚下，透光率為45％，并采用間歇性噴霧系統控制空氣濕度，每2h噴霧1次，噴霧時間每次40s，確保空氣濕度85％以上，早晚澆透水各1次，移栽后8d，即可成活；所述的基質是由泥炭和珍珠巖按照體積比為2:1組成。
將上述實施例1-3得到的羽裂唇柱苣苔的組織培養方法中不定芽誘導、不定芽的繼代增值、不定芽生根情況以及組培苗的移栽成活率進行調查統計，結果見表1。
表1本發明的羽裂唇柱苣苔的組織培養方法對不定芽誘導、不定芽的繼代增值、不定芽生根情況的測定
由表1可知，本發明的羽裂唇柱苣苔的組織培養方法得到的不定芽長勢良好，不定芽多；其誘導率和生根率均為100％，組培苗的移栽成活率為100％。可見，本發明的方法具有明顯的技術優勢，值得進一步推廣和應用。
前述對本發明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發明的特定原理及其實際應用，從而使得本領域的技術人員能夠實現并利用本發明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發明的范圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。