一種篩選獨角金內酯不敏感突變體的方法與流程

本發明屬于農業生物
技術領域：
，更具體涉及一種篩選獨角金內酯不敏感突變體的方法，用甲基磺酸乙酯對野生型擬南芥種子進行處理，后代種子用一定濃度獨角內酯為選擇壓，篩選根系長度不敏感的突變體。該發明為植物激素敏感差異材料的篩選提供了技術參考。
背景技術：
：EMS是甲基磺酸乙酯，屬于烷化劑誘變最常用的一種，誘變率很高。99％以上的突變都是堿基C至T的突變，所以導致CG配對變為TA配對。EMS突變材料可用于正向遺傳學及反向遺傳學研究。突變的頻率取決于基因在基因組的位置及處理條件。目前已通過該誘變方法篩選出油菜C18不飽和脂肪酸突變體(Leeetal.,2014)，黃瓜突變體(Wangetal.,2014)等，但高濃度(0.9％)EMS會顯著降低大豆突變體的篩選率(Koornneefetal.,1982)。植物激素對植株生長發育、器官建成、產量形成等具有重要的作用(Ghanemetal.,2011)。獨角金內酯(strigolactones,SLs)是一種產生于植物根部的類胡蘿卜素衍生物,具有刺激寄生植物種子萌發和促進叢枝菌根真菌菌絲分枝的作用(Xieetal.,2010；FooandReid,2013)。科學家通過對擬南芥和水稻等模式植物的研究，發現獨角金內酯通過抑制側芽的生長在株型建成中發揮關鍵調控作用(Gemez-Roldanetal.,2008；Elizabethetal.,2009；Jiaoetal.,2010)，獨角金內酯也調控根系發育和構型(Kapulniketal.,2014)，通過信號轉導協調地上和地下部植株生長(Koltai2011；KoltaiandBeveridge,2013),增加植株對逆境脅迫的抗性(Haetal.,2014)。雖然獨角金內酯是目前研究的熱點，但存在兩個問題：其一，相對于生長素、赤霉素、脫落酸、細胞分裂素、乙烯利5大類激素，對獨角金內酯的研究是近年來的研究熱點，主要是缺乏突變體材料；其二，經文獻查詢，國內外尚沒有和本技術專利相似的專利技術或非專利文獻公開或使用，也就是缺乏創造突變體的技術。本團隊成員經過2年的研究，優化了獨角金內酯突變體的篩選方法，從而為后續遺傳學、生理學、分子生物學研究提供了材料基礎。所以，該技術具有獨創性，先進性，不僅能篩選出擬南芥突變體材料，而且對作物突變體的篩選方法提供了借鑒。技術實現要素：本發明的目的是在于提供了一種篩選獨角金內酯不敏感突變體的方法，包括有效篩選獨角金內酯不敏感突變體所需要的遺傳變異材料的制備、試劑的準備、植株形態指標，處理條件等的問題。該方法操作簡便，篩選周期短，能快速高效地篩選出對獨角金內酯不敏感的擬南芥突變體。此外，也為篩選其它植物激素敏感或不敏感突變體提供了技術參考。為了實現上述的目的，本發明通過以下技術方案來實現：其技術構思是：具體操作分三步，即基礎材料的制備(野生型種子用EMS處理)，突變體的篩選、突變體的驗證。每一過程都有清楚詳細的步驟，提高了篩選效率和成功率。一種篩選獨角金內酯不敏感突變體的方法，其步驟是：(1)EMS處理野生型擬南芥種子：A、稱取1年以內收獲的擬南芥種子0.2g,用0.1％(重量比)吐溫15(Tween15)處理14－16分鐘，再用蒸餾水(dH2O)沖洗至無氣泡為止；B、加入15－45mL甲基磺酸乙酯(EMS)(0.1％－0.3％)，在通風廚中充分混勻8－16小時；C、將處理后的甲基磺酸乙酯(EMS)倒入新配制的0.5M氫氧化鈉(NaOH)中過夜后倒掉，再將種子放入50mL蒸餾水(dH2O)中清洗2－4小時；D、清洗后的種子放入100mL0.08－0.12％(重量比)瓊脂(Agar)溶液中，用移液槍移入土壤中生長；(2)獨角金內酯不敏感突變體的篩選：A、種子成熟后收獲，7－10天后取0.2g種子放入50mL大離心管中，準備數管，分別用50％(體積比)漂白劑溶液消毒后放進4℃冰箱，同時準備pH為5.8－6.2的AT培養基(請見表1AT培養基配比)，培養基中放入配制好的獨角金內酯至終濃度40μM，取直徑為12厘米的培養皿數個，每個培養皿中倒入50mL；B、72小時后用移液槍將種子播種于含有獨角金內酯的AT培養基上(請見表1AT培養基配比)，每管播種到一個培養皿中，輕輕搖動使種子均勻分布于表面；C、播種后的培養皿照光1－2小時，放在21－23℃黑暗條件下生長70－74小時；D、觀察根系長度，發芽后每天可連續觀察，6－8天選取長根系擬南芥突變體單株(長度與未激素處理時的野生型相當)，均能反復得到擬南芥突變體單株，然后將擬南芥單株移栽至土壤中。(3)獨角金內酯不敏感突變體的驗證：種子成熟后收獲，7－10天后取30粒左右種子按同樣的方法在放有獨角金內酯的AT培養基中篩選，以野生型植株和未添加獨角金內酯的處理為對照，根系長度與未激素處理時野生型相當的植株為候選目標植株。該方法為篩選獨角金內酯不敏感擬南芥突變體提供了可能，均能反復得到擬南芥突變體單株，并為作物突變體的選育提供了技術參考。所述的獨腳金內酯(strigolactone,SL)最初是從棉花中分離鑒定出的獨腳金(Strigaspp.)種子萌發的信號物質。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：(1)本發明中的EMS種子處理、突變體的篩選、突變體進一步驗證等方法是本人及研究團隊近年來的研究結果，種子量、試劑用量及處理時間都是經反復試驗、優化形成，具有獨創新、實用性等特點。(2)本發明中的獨角金內酯為近年來的研究熱點，在本發明中獨角金內酯具有抑制根系生長的特點，分析了該植物激素對植物表型變化的影響，可以利用該材料進行后續遺傳學及分子生物學研究，以發展植物激素領域理論研究成果。(3)眾所周知，突變體對理論研究具有重要的意義，獲得突變體有一定的難度，本發明不僅提供了一種篩選獨角金內酯突變體的方法，該方法針對于根系長度這一性狀，能有效獲得不同于MAX2分枝性狀突變體，豐富了突變體類型，通過該方法能反復獲得獨角金內酯突變體。(4)本發明不僅有助于篩選擬南芥突變體，而且對其他作物突變體的篩選提供了借鑒。篩選出的材料不僅可用于研究獨角金內酯信號傳導，而且為研究不同植物激素間的互作提供了材料基礎。附圖說明圖1為一種獨角金內酯不敏感突變體篩選示意圖。野生型擬南芥種子經EMS誘變后播種于含有40μM獨角金內酯的大培養皿中，在黑暗條件下發芽3天后每天連續觀察，選擇長根系突變體植株。圖2為一種獨角金內酯不敏感突變體驗證示意圖。在初步篩選到獨角金內酯不敏感突變體以后，收獲其種子，種子分別在未添加獨角金內酯和40μM獨角金內酯條件下生長，待種子發芽7天后，植株分別平鋪在AT培養基上，用Imagej軟件掃描，比較根系長度，長度無顯著差異表明該材料為獨角金內酯不敏感突變體。在未填加獨角金內酯條件下生長的植株(上)，在40μM獨角金內酯條件下生長的植株(下)。具體實施方式本發明所用獨角金內酯為GR24，是一種以在獨腳金內酯Strigol為框架的基礎上人工合成的化學物質，獨腳金內酯類似物中最有效的一個產品。本發明首先利用EMS處理野生型擬南芥種子，以獲得廣泛的遺傳變異，然后利用GR24抑制根系生長的特性，讓誘變后的種子在高濃度選擇壓力下生長，與野生型植株比較根系的長度，長根系的植株為待定突變體，突變體植株收獲種子再在選擇壓力下重復篩選一次，表型依然為長根系的植株則可能為目標突變體。實施例1：一種篩選獨角金內酯不敏感突變體的方法，其步驟是：(1)EMS處理野生型擬南芥種子：A、選擇在一年內收獲的擬南芥種子，稱取0.2g，放入50mL離心管中，用0.1％(重量比)Tween15混合均勻(0.1g吐溫15放入100mL蒸餾水中)，處理15分鐘后用蒸餾水沖洗至無氣泡為止；B、加入15－45mLEMS(0.1％或0.2％或0.3％)，通常用0.2％(重量比)，必須在通風廚中操作，充分搖勻、混勻8或10或12或14或16小時；C、將處理后的EMS倒入新配制的0.5M氫氧化鈉(NaOH)中過夜后倒掉，種子放入50mL蒸餾水中混合搖勻清洗2或3或4小時；D、漂洗后的種子移入100mL0.1％(重量比)瓊脂(Agar)中，用移液槍移入土壤中生長，每小缽(面積100cm2)1mL；(2)獨角金內酯不敏感突變體的篩選(圖1)：A、種子成熟后收獲，7或8或9或10天后取0.2g種子放入50mL大離心管中，用50％(體積比)消毒液(含8.3％次氯酸鈉)混合搖勻，消毒10分鐘，再用蒸餾水混合搖勻清洗5或6次。消毒后放進4℃冰箱，同時配制pH為6.0的AT培養基(請見表1AT培養基配比)。因為GR24抑制根系生長，并且隨濃度增加根系長度降低，培養基中入事先用DMSO溶解配制好的GR24至終濃度40μM(該濃度的選擇依據獨角金內酯對根系長度的抑制效果見表2)，每個培養皿中倒入50mL；B、72小時后將種子溶于約7mL含有同樣濃度GR24的AT培養基中，輕輕搖動使種子均勻分布在上述培養基表面；C、播種后照光1或2小時后，用錫紙包裹培養皿，放在22℃黑暗條件下生長72小時；D、用顯微鏡觀察根系長度，可連續觀察7天，每天將選擇出的長根系擬南芥突變體單株，(長度與未激素處理時的野生型相當)移入到含有獨角金內酯的AT培養基中單獨繼續生長，第7天再將所有植株移栽至土壤中，均能反復得到擬南芥突變體單株，然后將擬南芥單株移栽至土壤中，分單株移栽。(3)獨角金內酯不敏感突變體的驗證：種子成熟后收獲，7或8或9或10天后取30粒左右種子按同樣的方法在放有獨角金內酯的培養基中篩選，以野生型和未添加獨角金內酯的處理為對照，根系長度與未激素處理時的野生型相當的植株，均能反復得到擬南芥突變體單株(圖2)。表1AT培養基配方(1L)成份含量(g)MS(MurashigeandSkoog)粉末4.3蔗糖10瓊脂粉8加蒸餾水至終濃度1L，pH調整至6.0，121℃消毒滅菌30分鐘表2不同濃度GR24濃度對擬南芥根系生長的影響(單位mm)說明：研究了不同獨角金內酯濃度下野生型擬南芥種子(Col)、轉GUS基因的野生型種子(ColDRS:GUS)、生長素突變體(wei8-1)、乙烯利突變體(ein2-5DRS:GUS)根系的生長情況。發現隨著濃度增高，根系長度下降，40μM時根系長度顯著低于對照，以此作為不敏感突變體篩選的濃度。當前第1頁1 2 3