植物組織培養脫毒外植體脫毒方法與流程

本發明屬于植物脫毒技術領域，特別涉及植物組織培養脫毒外植體脫毒方法。

背景技術：

病毒對植物危害嚴重，病毒可導致植物樹體衰弱，果實變小并且畸形，品質變劣，產量嚴重下降，病毒病屬于難治療病害，迄今還沒有一種有效的藥物可以解決^[2-7]。因此，培育無病毒植物苗木已經成為防止病毒危害的主要措施。目前，通常采用的培育無病毒植物苗木的方法是莖尖組織培養技術。莖尖培養可以從植物組織中脫除病毒，形成無病毒(或脫毒)植株。莖尖培養，有時也稱微莖尖培養，其利用莖尖為分生組織，其中無病毒的原理，通過組織培養實現脫除病毒的目的。但莖尖大小對成活率和脫毒率有很大的影響，莖尖越大，分化率和成活率越大，但脫毒率越低；反之，如果莖尖越小，雖然脫毒率提高了，但分化率和成活率又大大降低，往往外植體死亡，造成組織培養脫毒失敗^[8-11]。

技術實現要素：

為解決現有技術中莖尖脫毒培養法使用的外植體太小而導致脫毒培養失敗的問題，本發明采用成熟組織^[1]作為外植體，使得組織培養脫毒操作變得更加簡單，大大提高分化率和成活率，使脫毒的成功率更高。

本發明的技術構思是：采用成熟組織作為外植體時，首先要誘導出愈傷組織，而愈傷組織中存在部分分生組織，分生組織中是不存在病毒的，因此，通過對愈傷組織的培養就有可以培育出由分生組織分化來的脫毒苗木。

本發明采用的技術方案如下：

植物組織培養脫毒外植體脫毒方法，包括以下步驟：選取植物成熟組織，將其進行滅菌處理后于初代培養基進行初代培養，在初代培養的基礎上進行增殖培養，在增殖培養的基礎上進行病毒檢測，挑選病毒陰性的繼代苗擴大繁殖量后進行生根培養，至長出良好的根系后馴化、移栽。

進一步的，所述的方法具體為：(1)將休眠季或生長季的植物成熟組織作為外植體用流水清洗，放入30～50wt％大蒜水溶液中滅菌20～40min；

(2)滅菌后的外植體立即接種在最適初代培養基中，待誘導出愈傷組織后轉移到最適繼代培養基中進行增殖培養；

(3)待增殖培養的無根苗達到較大數量時，取50～10mg葉片進行病毒檢測，將檢測結果為陰性的繼代苗繼續在增殖培養基中培養；

(4)待繼代苗培養至一定數量后轉移至生根培養基中進行生根培養；

(5)待長出良好的根系后馴化、移栽。

進一步的，所述的植物成熟組織為雙子葉植物生長季葉片或休眠季韌皮部或單子葉植物葉片。

進一步的，所述的初代培養基包括：0.5～3.0mg/L2,4-D。

進一步的，所述繼代培養基包括：0.2～1.5mg/L 6-BA，0.05～0.5mg/L IBA，0.4～2.0mg/L GA。

進一步的，所述生根培養基包括：0.3～2.0mg/L IBA。

所述的馴化為：將長出良好的根系轉移到珍珠巖和沙土上進行馴化。

進一步的，所述步驟(5)中，馴化后將根系移栽在中性土壤中。

本發明另一個目的是請求保護雙子葉植物成熟組織在組織培養脫毒中的應用。

本發明還請求保護單子葉植物成熟組織在組織培養脫毒中的應用。

本發明采用成熟組織作為外植體，在脫除植物病毒方面具有如下優勢：

1、操作極為方便，傳統的莖尖培養培育脫毒苗，由于所取外植體太小(一般外植體長度不超過1mm)，工作人員需要在體視顯微鏡下，才能獲取外植體。而且由于外植體太小，用鑷子將其接種到培養基上時操作難度大，操作速度慢。而采用成熟組織作為外植體，由于外植體較大，操作方便，無需借助體視顯微鏡。

2、分化率和成活率很高，傳統的莖尖培養培育脫毒苗，由于外植體太小，外植體分化為組培苗的難度較大，成苗率自然很低，往往導致接種后的外植體死亡，導致失敗。而采用成熟組織作為外植體，分化率和成活率相對很高。

3、采用成熟組織作為外植體，即使生成極少量的脫毒苗，也可以通過組培快速地繁殖起來，不影響脫毒培養。

附圖說明

圖1為紅富士蘋果ACLSV RT-PCR產物電泳圖；

圖2為蝴蝶蘭CyMV RT-PCR產物電泳圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步的說明，但本發明不以任何形式受限于實施例內容。實施例中所述試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；如無特殊說明，所述試劑和生物材料，均可從商業途徑獲得。

實施例1

選雙子葉植物“紅富士”蘋果生長期的葉片作為外植體，流水沖洗后，放入到30％大蒜水溶液滅菌30min，然后剪成1㎝²的正方形，立即接種在最適初代培養基中(MS+2,4-D 1.0mg/L+3％蔗糖+瓊脂8g/L)上。待誘導出愈傷組織后轉移到最適繼代培養基(2/3MS+6-BA0.6mg/L+IBA0.2mg/L+GA1.0+3％蔗糖+8g/L瓊脂)中培養，不斷地進行增殖培養，待繼代培養的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測。本次檢測的病毒是蘋果主要病毒之一，即蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)，如圖1所示電泳圖中沒有出現長度為358bp病毒特異性片段，即檢測結果為陰性，將檢測結果為陰性的繼代苗繼續在增殖培養基中培養，到一定數量后再將其轉到適宜的生根培養基中(1/2MS+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+8g/L瓊脂)中進行生根培養，至長出良好的根系后轉移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最后移栽在中性壤土中，脫毒成功率能達到4.2～5.7％。

實施例2：

選雙子葉植物“紅富士”蘋果休眠期的韌皮部作為外植體，流水沖洗后，放入到50％大蒜水溶液滅菌30min，立即接種在最適初代培養基中(MS+2,4-D1.5mg/L+3％蔗糖+瓊脂8g/L)上。待誘導出愈傷組織后轉移到最適繼代培養基(2/3MS+6-BA 0.6mg/L+IBA 0.2mg/L+GA1.0+3％蔗糖+8g/L瓊脂)中培養，不斷地進行增殖培養，待繼代培養的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒ACLSV的檢測。然后將檢測結果為陰性(即電泳圖1中沒有出現長度為358bp病毒特異性片段)的繼代苗繼續在增殖培養基中培養，到一定數量后再將其轉到適宜的生根培養基中(1/2MS+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+8g/L瓊脂)中進行生根培養，至長出良好的根系后轉移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最后移栽在中性壤土中，脫毒成功率能達到4.6～6.2％。

實施例3：

選單子葉植物蝴蝶蘭的葉片，流水沖洗后，浸泡在30％大蒜溶液中30min，然后剪成1㎝²的正方形片狀，立即接種在最適初代培養基中(MS+2,4-D1.0mg/L+BA1.0mg/L+3％蔗糖+瓊脂8g/L)上。待誘導出愈傷組織后轉移到最適繼代培養基(MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L+3％蔗糖+8g/L瓊脂)中培養，不斷地進行增殖培養，待繼代培養的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測。本次檢測的病毒是蝴蝶蘭主要病毒之一，即建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)。然后將檢測結果為陰性(即電泳圖2中沒有出現長度為431bp病毒特異性片段)的繼代苗繼續在增殖培養基中培養，到一定數量后再將其轉到適宜的生根培養基中(1/2MS+BA0.2mg/L+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+8g/L瓊脂)中進行生根培養，至長出良好的根系后轉移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最后移栽在中性壤土中，脫毒成功率能達到6.4～7.3％。

試驗例：

一.紅富士蘋果ACLSV RT-PCR檢測技術體系：

1.總RNA的提取

⑴取50～100mg葉片(包括待檢測“紅富士”蘋果繼代組培苗、陰性和陽性指示植物GF305葉片)，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5mL Eppendorf管中，加入600μL RNA提取緩沖液(50mmol/L TrisCl、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS及2％PVP，用1‰DEPC水配制，pH8.0)，1μL RNasin混勻。4℃，12000rpm，離心15min。

⑵取上清，加入等體積氯仿：異戊醇(24∶1v/v)溶液，混勻，4℃，12000rpm，離心10min。重復1～2次，直至不再出現蛋白層。

⑶取水相，加2.5倍體積的無水乙醇及1/10體積3mol/L NaAc(pH5.3)，混勻。-20℃置2h。取出后，4℃，12000rpm，離心15min。

⑷棄上清，用200μL 70％無水乙醇洗沉淀，4℃，12000rpm，5min，清洗多次，至沉淀為純白色。

⑸室溫下干燥后15min左右，溶于30μL 1‰DEPC水中，-20℃保存。

2.RT優化體系及程序：

⑴反應體系：dNTPs 125μmol/L；5×Buffer 1.0μl；RNasin 8U；MgCl₂1.05mmol/L；Cl-Pc 0.60μmol/L；Mo-MLV RTase 50U；總RNA模板0.5μl；用DEPC水補足10μl。

⑵反應程序：37℃，1～1.5h；95℃，5min。

3.PCR優化體系及程序：

⑴反應體系：dNTPs 100μmol/L；10×Buffer(10x)2.5μl；MgCl₂1.5mmol/L；Cl-Pc 0.6μmol/L；Cl-P_h 0.64μmol/L；TaqE 1U；RT產物10μl；用DEPC水補足25μl。

⑵反應程序：94℃1min；52℃2min；72℃2min；循環25～30次，最后一次延伸5min。

二..蝴蝶蘭CyMV RT-PCR檢測技術體系：

1.總RNA的提取

⑴取50～100mg葉片(陽性蝴蝶蘭繼代組培苗、陰性和陽性指示植物莧色藜葉片)，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5mL Eppendorf管中，加入600μL RNA提取緩沖液(50mmol/L TrisCl、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS及2％PVP，用1‰DEPC水配制，pH8.0)，1μL RNasin混勻。4℃，12000rpm，離心15min。

⑵取上清，加入等體積氯仿：異戊醇(24∶1)溶液，混勻，4℃，12000rpm，離心10min。重復1～2次，直至不再出現蛋白層。

⑶取水相，加2.5倍體積的無水乙醇及1/10體積3mol/L NaAc(pH5.3)，混勻。-20℃置2h。取出后，4℃，12000rpm，離心15min。

⑷棄上清，用200μL 70％無水乙醇洗沉淀，4℃，12000rpm，5min，清洗多次，至沉淀為純白色。

⑸室溫下干燥后15min左右，溶于30μL 1‰DEPC水中，-20℃保存。

2.RT優化體系及程序：

⑴反應體系：

5×Buffer 2.0μl；dNTPs 0.25mmol/L；RNasin 8U；引物CyMV-RP 1μmol/L；總RNA 1.0μl；Mo-MLV RTase 50U。用DEPC水補足10μl。

⑵反應程序：37℃2h；95℃5min滅活M_O-MLVRTase；反應結束后4℃保存。3.PCR優化體系及程序：

⑴反應體系：

10×Buffer 2.5μl；dNTPs 0.2mmol/L；MgCl₂1.5mmol/L；CyMV-FP 0.8μmol/L；CyMV-RP 0.8μmol/L；TagE 1U；RT產物10μl。用DEPC水補足25μl。

⑵反應程序：94℃1min；55℃2min；72℃2min；循環35次，最后一輪延伸5min，4℃保存。

參考文獻

1.魏道智主編.普通生物學(第二版)[M]，北京：高等教育出版社，2012.

2.崔德才，徐培文主編.植物組織培養與工廠化育苗[M]，北京：化學工業出版社，2003.

3.程家勝編著.植物組織培養與工廠化育苗技術[M]，北京：金盾出版社，2003.

4.侯義龍主編.果樹組織培養技術及其應用[M]，北京：中國農業科學技術出版社，2007.

5.洪健，李德葆，周雪平主編.植物病毒分類圖譜[M]，北京：科學出版社，2001.

6.黃文林主編.分子病毒學[M]，北京：人民衛生出版社，2002.

7.Ming-Hsien Hsieh,Hsiang-Chia Lu,Zhao-Jun Pan.Optimizing virus-induced gene silencing efficiency with Cymbidium mosaic virus in Phalaenopsis flower[J].Plant Science 2013,201-202:25-41.

8.劉湘寧，戴良英，董錚，等.植物RNA病毒檢測技術研究進展[J].現代農業科技，2016，9：150-152.

9.李美桂，謝文龍，謝鐘琛.植物病毒檢測技術研究進展[J].熱帶農業科學，2005，25(3)：71-75.

10.陳繼峰，趙軍營，李紹華.果樹病毒檢測方法及其應用[J].河北林果研究，2005，20(2)：167-173.

11.王國平，洪霓.果樹病毒檢測與脫除技術的研究進展[J].華中農業大學學報，2004，23(6)：686-692.