一種巨紫荊組培苗的繼代培養方法與流程

本發明涉及一種組培苗的培養方法，具體涉及一種巨紫荊組培苗的繼代培養方法。
背景技術：
：巨紫荊(CercisgiganterLines)為豆科/蘇木科紫荊屬落葉喬木，自然生長的大樹胸徑達60cm、高達15m以上，因樹形巨大，又與常見的灌木狀紫荊相象而得名“巨紫荊”。巨紫荊為我國特有的鄉土樹種，集中分布在亞熱帶地區。南到貴州的遵義，北到河南洛寧；東到浙江的臨安,西到湖北的神農架地區。巨紫荊幼葉紫紅色，花假蝶形，淡紫紅色，3～4月葉前開花，花色艷麗，“像法桐一樣高大，像櫻花一樣燦爛”，具有較高的觀賞價值，是優良的行道樹、庭蔭樹及綠化點綴樹種。巨紫荊屬豆科紫荊屬樹種，有關巨紫荊的研究及應用尚處于起始階段，因此巨紫荊組織培養的研究報道較少，僅河南四季春園林藝術工程有限公司張林等進行了巨紫荊組織培養的研究，并且發現MS+ZT2.0mg/L的增殖效果最好，增殖倍數為3.56倍(巨紫荊優良新品系組織培養快速繁殖技術)。該配方是以MS為基本培養基，增值系數為3.56，本實驗中所用玉米素(ZT)成本高，不適用于組培苗的工廠化生產。本發明對MS培養基進行改良，使平均增殖系數達到5以上，生根率達到98％，大棚煉苗成活率為90％以上，降低了生產成本，在規模化生產中帶來了更高的經濟效益。技術實現要素：本發明的目的在于，提供一種巨紫荊組培苗的繼代培養方法，以克服現有技術所存在的上述缺點和不足。本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現：一種巨紫荊組培苗繼代培養的方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)、無菌外植體的獲取；(2)、巨紫荊繼代增殖步驟：(2.1)試驗材料；(2.2)巨紫荊繼代培養的實驗方案設計；(3)、巨紫荊生根培養步驟；(3.1)選取繼代培養的巨紫荊組培苗，選取標準為高度1.8～3.5cm、健壯、葉片舒展的單株組培苗；(3.2)將選取的繼代培養的巨紫荊組培苗接種至1/2MS生根培養基上；(3.3)進行生根培養激素篩選，接種30天后統計生根率，生根率＝生根株數/接種株數×100％；(4)、巨紫荊繼代培養及生根培養條件；(5)、巨紫荊組培苗的煉苗與移栽。(5.1)巨紫荊大棚煉苗種苗要求；(5.2)巨紫荊大棚煉苗條件；(5.3)巨紫荊大棚煉苗基質特點。其中，步驟1中，選取1～2年生帶芽包的健壯枝條于室內進行水培，待新芽萌發后切割成1～2cm長的頂芽或帶腋芽的莖段，剪去葉片留3～5mm葉柄，用75％酒精擦拭外植體表面，用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下沖洗0.5～1h；在超凈工作臺上，用0.05～0.1％的升汞處理5～15min，用無菌水沖洗5～6次，接種至誘導培養基中，按照MS+0.1～1mg/L6-BA+30g/L糖+5～7g/L瓊脂，每瓶接種一株，獲得的無菌外植體的成功率為85％。其中，步驟(2.1)中，(2.1)試驗材料，選取步驟1中誘導出來的芽直接進行增殖培養，所選材料生長健壯、葉片舒展，利用頂芽及莖段進行繁殖，其中頂芽高0.5～1cm左右、莖段高0.5～1cm左右含至少一個腋芽。其中，步驟(2.2)中，改良MS培養基包括KNO32000～2100mg/L、NH4NO31645～1600mg/L、MgSO4·7H2O555～740mg/L與KH2PO4255～340mg/L，細胞分裂素的最佳濃度為0.3～1.0mg/L，生長素為IBA，濃度范圍為0.03～0.1mg/L。因此，巨紫荊繼代培養最佳增殖培養基配方為：改良MS+0.3～1.0mg/L6-BA+0.03～0.1mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂。其中，步驟(3.2)中，1/2MS生根培養基中包括：NH4NO3825mg/L、KNO3950mg/L、KH2PO485mg/L、MgSO4·7H2O185mg/L、CaCl2·2H2O220mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA·2H2O18.65mg/L、KI0.42mg/L、H3BO33.1mg/L、MnSO4·H2O8.45mg/L、ZnSO4·7H2O4.25mg/L、Na2MoO4·2H2O0.05mg/L、CoCl2·6H2O0.0125mg/L、CuSO4·5H2O0.0125mg/L、肌醇50mg/L、煙酸0.25mg/L、鹽酸吡哆醇0.25mg/L、鹽酸硫胺素0.05mg/L、甘氨酸1.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、20g/L蔗糖、7g/L瓊脂。其中，步驟(3.3)中，IBA與NAA配合使用時巨紫荊生根率明顯提高。其中篩選出的最適生根配方為：1/2MS+0.5～1.0mg/LNAA+0.5～1.0mg/LIBA+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂。其中，步驟4中，巨紫荊組培苗繼代及生根培養的條件為：光培養與暗培養交替進行，光培養條件為連續進行12h光照，光照強度為3000lx，培養溫度為26℃；暗培養條件為連續進行12h，溫度為20℃。其中，步驟5中，還包括：(5.1)生根培養35～45天的生根苗可進溫室煉苗移栽，選取葉色正常、無枯葉黃葉的健壯植株進行移栽。(5.2)將巨紫荊生根苗根系上的培養基洗凈，種植在含蛭石、珍珠巖、草炭等基質的營養杯或穴盤中，濕度控制在80～90％，待新根與新葉發出后逐漸降低濕度，培養45～60天，即可得巨紫荊容器苗，巨紫荊生根苗大棚煉苗成活率為90％以上。(5.3)上述所說基質配方包括上下兩層，其中上層1/3容量體積為蛭石：珍珠巖＝2:1；下層2/3容量體積為草炭：蛭石：珍珠巖＝3:1:1，該基質配方的特點是上層基質疏松透氣、保水保濕，利于煉苗前期新根及新葉的發出；下層基質營養豐富，利于后期組培苗營養生長，且根系與基質易于成團、便于容器苗運輸。本發明的有益效果：《巨紫荊優良新品系組織培養快速繁殖技術》所采用的方法，平均增殖系數為3.56，且使用的激素ZT成本是6-BA與IBA的幾百倍。采用該方法的巨紫荊組培苗的繁殖具有如下優點：(1)增殖系數高，平均增殖系數達到5以上；(2)生根率高，最高可達98％；(3)煉苗成活率高，平均為90％以上。該方法增殖系數明顯高于《巨紫荊優良新品系組織培養快速繁殖技術》，且所用藥品成本更低，生根率及煉苗成活率也高于前者，因此適合用于巨紫荊組培苗的工廠化生產及推廣。附圖說明圖1為巨紫荊擴繁培養。圖2為巨紫荊生根培養的側視圖。圖3為巨紫荊生根培養的主視圖。圖4為巨紫荊生根培養的仰視圖。圖5為巨紫荊大棚煉苗營養杯苗。具體實施方式以下結合具體實施例，對本發明作進步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范圍。實施例1(一)實驗材料母本材料：從生長健壯、無病蟲害的4年生大樹上剪取1～2年生帶飽滿芽體的健康枝條于室內水培，待新芽萌發后作為外植體啟動培養的來源；繼代及生根培養材料：繼代周期為25～30天，生長健壯、葉片舒展，株高為3～5cm的巨紫荊組培苗作為繼代培養及生根培養的實驗材料；(二)具體實驗步驟一種巨紫荊組培苗繼代培養的方法，步驟如下：1、無菌外植體的獲取選取1～2年生帶芽包的健壯枝條于室內進行水培，待新芽萌發后切割成1～2cm長的頂芽或帶腋芽的莖段，剪去葉片留3～5mm葉柄，用75％酒精擦拭外植體表面，用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下沖洗0.5～1h；在超凈工作臺上，用0.05～0.1％的升汞處理5～15min，用無菌水沖洗5～6次，接種至誘導培養基中(MS+0.1～1mg/L6-BA+30g/L糖+7g/L瓊脂)，每瓶接種一株，獲得的無菌外植體的成功率為85％。2、巨紫荊繼代增殖步驟：(1)試驗材料選取步驟1中誘導出來的芽直接進行增殖培養，所選材料生長健壯、葉片舒展，利用頂芽及莖段進行繁殖，其中頂芽高0.5～1cm左右、莖段高0.5～1cm左右含至少一個腋芽。(2)巨紫荊繼代培養的實驗方案設計巨紫荊繼代培養的基本培養基為改良MS培養基，其中添加蔗糖30g/L，瓊脂5～7g/L，pH為5.8～6.0。選用6-BA(6-芐基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)等植物生長調節劑。每個處理接種20瓶，每瓶接種15株，實驗重復三次，培養28天統計增殖比例及生長情況，從而比較不同培養基對不定芽增殖的影響，進一步篩選出最佳繼代增殖培養基。改良MS培養基包括KNO32000～2100mg/L、NH4NO31645～1600mg/L、MgSO4·7H2O555～740mg/L與KH2PO4255～340mg/L，改良MS配方主要針對培養基的大量元素進行改良，其它MS添加物保持不變，改良如表1：表1改良MS培養基配方大量元素MS培養基中用量(mg/L)改良MS培養基中用量(mg/L)KNO319001995～2090NH4NO316501568～1485MgSO4·7H2O370555～740KH2PO4170255～340巨紫荊繼代培養細胞分裂素6-BA的篩選如表2：表2巨紫荊繼代培養細胞分裂素6-BA的篩選由上述結果顯示，如圖1所示，巨紫荊繼代培養所用細胞分裂素的最佳濃度為0.3～1.0mg/L。在此基礎上進行巨紫荊生長素種類的篩選，各處理結果如表3：表3巨紫荊生長素種類的篩選處理6-BAIBANAA處理結果10.30.030植株健壯，平均株高為2.5，增殖比例為320.300.03基部愈傷組織大，植株不長高，基本無增殖由上述結果可知，NAA不適合用作巨紫荊的繼代培養，6-BA與IBA的組合利于巨紫荊的增殖擴繁。在此實驗基礎上，對巨紫荊繼代培養的激素水平進行調整，實施結果如表4：表4巨紫荊繼代培養的激素水平進行調整由上述結果可知，適合巨紫荊繼代培養的生長素為IBA,濃度范圍為0.03～0.1mg/L。因此，巨紫荊繼代培養最佳增殖培養基配方為：改良MS+0.3～1.0mg/L6-BA+0.03～0.1mg/LIBA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂。3、巨紫荊生根培養步驟(1)選取繼代培養的巨紫荊組培苗，選取標準為高度1.8～3.5cm、健壯、葉片舒展的單株組培苗；(2)將選取的繼代培養的巨紫荊組培苗接種至1/2MS生根培養基上。1/2MS生根培養基中包括：NH4NO3825mg/L、KNO3950mg/L、KH2PO485mg/L、MgSO4·7H2O185mg/L、CaCl2·2H2O220mg/L、FeSO4·7H2O13.9mg/L、Na2·EDTA·2H2O18.65mg/L、KI0.42mg/L、H3BO33.1mg/L、MnSO4·H2O8.45mg/L、ZnSO4·7H2O4.25mg/L、Na2MoO4·2H2O0.05mg/L、CoCl2·6H2O0.0125mg/L、CuSO4·5H2O0.0125mg/L、肌醇50mg/L、煙酸0.25mg/L、鹽酸吡哆醇0.25mg/L、鹽酸硫胺素0.05mg/L、甘氨酸1.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、20g/L蔗糖、7g/L瓊脂。(3)接種30天后統計生根率，生根率＝生根株數/接種株數×100％。生根培養基激素篩選如表5，如圖2-4所示：表5生根培養基激素篩選由上述結果可知，IBA與NAA單獨使用時不利于巨紫荊組培苗的生根培養，而IBA與NAA配合使用時巨紫荊生根率明顯提高。其中篩選出的最適生根配方為：1/2MS+0.5～1.0mg/LNAA+0.5～1.0mg/LIBA+20g/L蔗糖+7g/L瓊脂。該配方培養的巨紫荊組培苗生根率最高可達98％,且根系數量多、根系粗壯，在煉苗移栽過程中提高了巨紫荊組培苗的成活率，本發明不僅解決了巨紫荊組培苗生根率低的問題，而且大大降低了生產成本，加快了巨紫荊的工廠化生產及推廣。4、巨紫荊繼代培養及生根培養條件巨紫荊組培苗繼代及生根培養的條件為：光培養與暗培養交替進行，光培養條件為連續進行12h光照，光照強度為3000lx，培養溫度為26℃；暗培養條件為連續進行12h，溫度為20℃。5、巨紫荊組培苗的煉苗與移栽(1)如圖5所示，生根培養35～45天的生根苗可進溫室煉苗移栽，選取葉色正常、無枯葉黃葉的健壯植株進行移栽；(2)將巨紫荊生根苗根系上的培養基洗凈，種植在含蛭石、珍珠巖、草炭等基質的營養杯或穴盤中，濕度控制在80～90％，待新根與新葉發出后逐漸降低濕度，培養45～60天，即可得巨紫荊容器苗。巨紫荊生根苗大棚煉苗成活率為90％以上。(3)上述所說基質配方包括上下兩層，其中上層1/3容量體積為蛭石：珍珠巖＝2:1；下層2/3容量體積為草炭：蛭石：珍珠巖＝3:1:1。該基質配方的特點是上層基質疏松透氣、保水保濕，利于煉苗前期新根及新葉的發出；下層基質營養豐富，利于后期組培苗營養生長，且根系與基質易于成團、便于容器苗運輸。對比分析《巨紫荊優良新品系組織培養快速繁殖技術》所采用的方法，平均增殖系數為3.56，且使用的激素ZT成本是6-BA與IBA的幾百倍。采用該方法的巨紫荊組培苗的繁殖具有如下優點：(1)增殖系數高，平均增殖系數達到5以上；(2)生根率高，最高可達98％；(3)煉苗成活率高，平均為90％以上。該方法增殖系數明顯高于《巨紫荊優良新品系組織培養快速繁殖技術》，且所用藥品成本更低，生根率及煉苗成活率也高于前者，因此適合用于巨紫荊組培苗的工廠化生產及推廣。以上對本發明的具體實施方式進行了說明，但本發明并不以此為限，只要不脫離本發明的宗旨，本發明還可以有各種變化。當前第1頁1 2 3