本發明涉及基因技術，尤其涉及一種促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法。
背景技術：
羅漢果甜苷v屬于葫蘆烷型四環三萜類物質，羅漢果甜苷v生物合成的前體物質是異戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯內基焦磷酸(dmapp)，二者是通過甲羥戊酸(mva)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(mep)兩條途徑形成，mva途徑發生在胞質中，mep途徑發生在質體中。來源于上述兩途徑的ipp或dmapp經牻牛兒基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛兒基焦磷酸(gpp)，ipp與gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下進而形成法呢基焦磷酸(fpp)，然后經角鯊烯合酶(ss)、角鯊烯環氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鯊烯，葫蘆二烯醇合酶(cs)進一步催化形成葫蘆二烯醇，最后在cyp450酶和葡萄糖基轉移酶(ugt)的作用下，形成羅漢果甜苷v。
異戊二烯類物質的產生受到限速酶活性的嚴格調控，一直被認為在其生物合成途徑中起著重要的調控作用。作為異戊二烯途徑中的限速酶，ugt基因的表達對羅漢果甜苷v的生物合成起著決定性作用。過表達ugt基因，可以促進羅漢果甜苷v的積累；相反，如果抑制ugt基因的表達，羅漢果甜苷v的產量將顯著降低。現有技術中未見有促進羅漢果ugt84a21基因表達的報道。
技術實現要素：
針對上述技術問題，本發明設計開發了一種促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法。
本發明提供的技術方案為：
一種促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法，包括：
步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養基中培養，其中，茉莉酸甲酯在固體培養基中的濃度為50-400μmol/l；
步驟二、栽培所述步驟一培養得到的羅漢果植株，在栽培期間，將濃度為50-400μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后20-30d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續噴施5d；并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時，預先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃；每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為10℃，每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為15℃，之后通風。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法中，所述步驟一中，所述培養條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux，光照時間8h/d，溫度21-25℃條件下培養30d。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法中，所述的固體培養基配比為ms+6-ba1.5mg/l，iba0.3mg/l，瓊脂3.5g/l，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/l。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法中，所述步驟一中，所述含有茉莉酸甲酯的固體培養基通過以下方式制備得到：用體積百分比濃度為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養基中，至茉莉酸甲酯的最終濃度為50-400μmol/l，將固體培養基滅菌并冷卻至24-26℃。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法，還包括：
步驟三、利用qrt-pcr檢測所述步驟二栽培得到的羅漢果果實中的ugt84a21基因表達。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法中，所述步驟三中，采用改良trizol法提取羅漢果果實總rna。
本發明通過在羅漢果組培苗和栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯，短期內快速誘導羅漢果甜苷v生物合成途徑中關鍵酶基因ugt84a21的高表達，從而促進羅漢果甜苷v含量的顯著提高。本發明操作簡便，成本低，對環境友好，適于規模化生產，具有較強的實用性和推廣價值。
具體實施方式
下面對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
實施例一
一種促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法，包括：
步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養基中培養，其中，茉莉酸甲酯在固體培養基中的濃度為50μmol/l。所述培養條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux，光照時間8h/d，溫度21℃條件下培養30d。所述的固體培養基配比為ms+6-ba1.5mg/l，iba0.3mg/l，瓊脂3.5g/l，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/l。
所述含有茉莉酸甲酯的固體培養基通過以下方式制備得到：用體積百分比濃度為2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養基中，至茉莉酸甲酯的最終濃度為50μmol/l，將固體培養基滅菌并冷卻至24-26℃。
步驟二、栽培所述步驟一培養得到的羅漢果植株，在栽培期間，將濃度為50μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后22d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續噴施5d；并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時，預先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃；每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為10℃，每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為15℃，之后通風。
步驟三、利用qrt-pcr檢測所述步驟二栽培得到的羅漢果果實中的ugt84a21基因表達。
先將羅漢果果實進行處理，挑取果肉，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃備用。
采用改良trizol法提取羅漢果果實總rna。
采用abi7500實時熒光定量pcr儀。
將rna反轉錄為cdna的反應體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應條件為37℃(15min)到85℃(5s)，再到4℃。
采用primerpremier5.0軟件設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt84a21引物序列為(fp：cgccatatgcaccaccaccaccaccacatggtaaaggaagttgcagatg(seqidno:1)，rp：ccgagctctcaagaagtcgccgaacaatgg(seqidno:2))，內參基因用ubq5，序列為(fp：ataaaagacccagcaccacattc(seqidno:3)，rp：cccttgccgactacaacatcc(seqidno:4))。
qrt-pcr反應體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反應條件為95℃(30s)，接著進行40個cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。采用hplc法測定羅漢果甜苷v的含量。色譜條件為：色譜柱：dikmadiamomsil(tm)c18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：乙腈-水(梯度0-40min；10％線性升至40％；40.01-45mm；回至10％)；流速：1.0ml/min，檢測波長：203nm。供試品樣液的配制為：取羅漢果粉末2g，精密稱定，置于100ml具磨口塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，搖勻，稱定重量。超聲處理1h，放冷，再稱定重量，并用甲醇補足減失的重量，搖勻，以0.45μm的濾液微孔濾膜過濾即可。
對比例一
步驟一、將羅漢果組培苗接種不含有茉莉酸甲酯的固體培養基中培養；步驟二、不對羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實施例一一致。
qrt-pcr檢測結果顯示，在對比例一中，羅漢果ugt73af1基因的表達量為1，而在實施例一中，羅漢果ugt73af1基因的表達量高達10.8，較對比例一提高了980％，可見，實施例一可以顯著促進羅漢果ugt73af1基因的高表達。hplc檢測結果顯示，在對比例一中，羅漢果甜苷v含量為0.79％，而在實施例一中，羅漢果甜苷v含量高達2.13％，較對比例一提高了169.62％，可見，實施例一還可以顯著促進羅漢果甜苷v產量的提高。
實施例二
一種促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法，包括：
步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養基中培養，其中，茉莉酸甲酯在固體培養基中的濃度為200μmol/l。所述培養條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux，光照時間8h/d，溫度25℃條件下培養30d。所述的固體培養基配比為ms+6-ba1.5mg/l，iba0.3mg/l，瓊脂3.5g/l，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/l。
步驟二、栽培所述步驟一培養得到的羅漢果植株，在栽培期間，將濃度為200μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后24d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續噴施5d；并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時，預先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃；每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為10℃，每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為15℃，之后通風。
其他條件均與實施例一一致。
對比例二
步驟一、將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養基中培養；步驟二、不對羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實施例二一致。
qrt-pcr檢測結果顯示，在對比例二中，羅漢果ugt73af1基因的表達量為1，而在實施例二中，羅漢果ugt73af1基因的表達量高達17.9，較對比例二提高了1690％，可見，實施例二可以顯著促進羅漢果ugt73af1基因的高表達。hplc檢測結果顯示，在對比例二中，羅漢果甜苷v含量為0.78％，而在實施例二中，羅漢果甜苷v含量高達2.24％，較對比例二提高了187.18％，可見，實施例二還可以顯著促進羅漢果甜苷v產量的提高。
實施例三
一種促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法，包括：
步驟一、羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養基中培養，其中，茉莉酸甲酯在固體培養基中的濃度為300μmol/l。所述培養條件為：相對濕度60-66％、光照強度1400lux，光照時間8h/d，溫度25℃條件下培養30d。所述的固體培養基配比為ms+6-ba1.5mg/l，iba0.3mg/l，瓊脂3.5g/l，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/l。
步驟二、栽培所述步驟一培養得到的羅漢果植株，在栽培期間，將濃度為300μmol/l的茉莉酸甲酯噴灑于授粉后28d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續噴施5d；并且在每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液時，預先將茉莉酸甲酯的乙醇溶液降溫至8℃；每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為10℃，每次噴灑茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向羅漢果表面噴水霧，水霧溫度為15℃，之后通風。
其他條件均與實施例一一致。
對比例三
步驟一、將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養基中培養；步驟二、不對羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實施例三一致。
qrt-pcr檢測結果顯示，在對比例三中，羅漢果ugt73af1基因的表達量為1，而在實施例三中，羅漢果ugt73af1基因的表達量高達15.3，較對比例三提高了1430％，可見，實施例三可以顯著促進羅漢果ugt73af1基因的高表達。hplc檢測結果顯示，在對比例三中，羅漢果甜苷v含量為0.71％，而在實施例三中，羅漢果甜苷v含量高達2.11％，較對比例三提高了197.18％，可見，實施例三還可以顯著促進羅漢果甜苷v產量的提高。
盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節。
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<110>李華政
<120>促進羅漢果ugt84a21基因表達的方法
<130>2016
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<170>patentinversion3.5
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<213>人工序列
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