一種快速誘導白及鱗莖的專用培養基及組培方法與流程

本發明屬于白及栽培技術領域，具體涉及一種快速誘導白及鱗莖的專用培養基及組培方法。

背景技術：

白及為蘭科植物白及(bletillastriata(thunb.)reichb.f.，其假鱗莖為藥用部位，具有收斂止血、消腫生肌的功效，現研究發現白及在治療肺結核、胃病、腫瘤等方面效果明顯，同時還是優質的化學品材料。但白及植物被人為采挖、生鏡破壞，野生資源十分稀少，現已被列為珍稀植物二級保護種。

隨著白及開發利用價值的發展需要，其市場需求量不斷增加，而野生資源已經十分稀少了，白及自然條件下繁殖率較低，所以急需開展白及人工繁殖及規范化栽培的研究，從而較好的保護白及野生資源，并保障白及的市場需求和開發利用。

傳統栽培條件下，白及以分株繁殖為主，其繁殖速度慢，繁殖系數極低，且容易導致病害的積累和傳播，難以適宜現代種植的需要。而白及果莢中種子數量大，但因為種子結構特殊，自然條件下難以萌發，所以白及種苗稀缺成為其規模化發展的瓶頸。而隨著生物技術的發展，白及組培技術得到了較快發展，一般都經過無菌播種、叢生苗培養、壯苗培養、生根培養等多個環節，并耗工、耗時，通常情況下組培苗鱗莖分化率不高，組培苗的移栽成活率也不高，從而較大程度的影響了白及組培苗的生產應用。所以如何簡化組培環節，減少成本，促進鱗莖的分化、快速生長成為影響組培苗移栽成活率及生產應用的重要因素。

201110119312.0也公開了一種培養器皿內制備白及假鱗莖的方法及其專用培養基，其介紹了以白及種子為外植體的專用培養基，由種子萌發培養基，假鱗莖誘導培養基，假鱗莖增殖培養基和假鱗莖生根培養基組成。其每一個步驟需要一個特定的培養基，其培養方式如上所述具有耗工、耗時等缺陷。

技術實現要素：

針對現有白及鱗莖組培技術的缺陷，本發明的目的在于提供一種快速誘導白及鱗莖的專用培養基及組培方法，所述方法操作簡單，生產成本低，并且效果穩定。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1、一種快速誘導白及鱗莖的專用培養基，所述專用培養基由白及種子萌發培養基和鱗莖高效誘導及壯苗培養基組成，其中：

所述白及種子萌發培養基的配方為：1/2ms，naa0.1mg/l，ga30.1mg/l，瓊脂6.5～7.0g/l，白糖20g/l，ph5.8～6.0；所述和鱗莖高效誘導及壯苗培養基的配方為：1/2ms，naa0.5～0.6mg/l，6-ba0.6～0.8mg/l，pp3330.4～0.5mg/l，白糖30～45g/l，香蕉泥25～40g/l，活性炭0.1g/l，ph5.8-6.0。

優選的，所述鱗莖高效誘導及壯苗培養基的配方為：1/2ms，naa0.6mg/l，6-ba0.8mg/l，pp3330.5mg/l，白糖40g/l，香蕉泥25g/l，活性炭0.1g/l，ph5.8-6.0。

2、一種快速誘導白及鱗莖的組培方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)白及種子的消毒滅菌：將未開裂的白及種子用質量分數為75％的酒精涂洗表面1-3min，然后在超凈工作臺上將果莢置于0.1％的升汞中浸泡15～20min，再用無菌水沖洗3～5次，無菌濾紙吸干表面水分以備接種；

2)在無菌工作條件下，將步驟1)消毒滅菌的白及種子接種到權利要求1所述的種子萌發培養基中培養；

3)當步驟2)所述白及種子萌發苗高0.8～1.2cm時轉接至權利要求1所述的鱗莖高效誘導及壯苗培養基中培養。

進一步優選的，步驟2)的培養條件為：光照1500～2000lx，10～12h/天；溫度，24～28℃。

進一步優選的，步驟3)的培養條件為：光照1500～2000lx，12～15h/天；溫度，24～28℃。

進一步，上述方法中所述白及種子的采集及貯藏方法為：采集9-10月白及成熟、飽滿果莢置于陰涼通風的地方，攤涼2～3周；待果莢表皮變為淺棕色時，將果莢裝于牛皮紙袋中保存在冰箱4℃冷藏室中，可保證白及組培苗周年生產所用。

本發明中所用的naa為萘乙酸，ga3為赤霉素，6-ba為6-芐氨基腺嘌呤，pp333為多效唑，試劑均為分析純，水為超純水。

本發明的有益效果在于：本方法以促進種子快速萌發為第一階段培養，然后采用高效培養基，即以促進快速分化的激素6-芐氨基腺嘌呤，調節根分化、生長的萘乙酸，以及調節植物激素平衡、提高抗逆性的多效唑，三種激素為配方，篩選適宜的濃度和比例，使其較好的調控白及組培假苗鱗莖、莖葉、根的分化和生長；并加入濃度適宜的營養原—白糖和香蕉泥，有效的促進了鱗莖的快速生長，而適當的活性炭能較好的促進根的生長，并能有效吸附白及生長中產生的一些毒素。所以，該培養方法簡化了白及假鱗莖組培苗的生產環節，集誘導假鱗莖、假鱗莖快速生長及生根壯苗培養于一步完成，從種子到移栽所需時間為90天內，縮短了培養時間，提高了假鱗莖分化率，促進了假鱗莖的快速生長，提高了組培苗的移栽成活率。

附圖說明

為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明：

圖1為一株白及假鱗莖的直徑測試圖；

圖2白及假鱗莖的株高測試圖；

圖3白及假鱗莖的株高測試圖；

圖4為一個培養皿培養60天后的白及假鱗莖生長情況；

圖5為移栽20天后的生長情況。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。

以下實施例采用的是成熟未開裂的白及蒴果(采于重慶市藥物種植研究所實驗基地)，果莢保存方法，于8-10月采集微黃的果莢在室內通風處晾5-10天，待果莢表皮變為淺棕色時，放入牛皮紙信封中，置于4℃冰箱保鮮室內，該方法能有效保存種子活力并便于周年的生產。培養基在121℃條件下高壓滅菌17min，備用。

以下實施例中所用的種子果莢均按以下方式消毒及接種：將未開裂的果莢流水洗凈，用75％的酒精涂洗表面1～3min，然后在超凈工作臺上將果莢置于質量分數為0.1％的升汞中浸泡15～20min，然后用無菌水沖洗3-5次，無菌濾紙吸干表面水分以備接種，在接種盤中將消毒過的果莢用無菌剪刀剪開小口，以無菌接種環蘸取種子均勻的涂在萌發培養基上。

白及無菌萌發培養基的篩選

按照表1所示的配方設計，對白及種子無菌萌發進行觀測，培養條件為：光照1500--2000lx，10-12h/天；溫度，24--28℃。4周時統計白及萌發苗高、根毛情況如表2所示：

表1：白及無菌培養基的配方設計

表2：不同萌發培養基上白及種子萌發生長情況

從表2可以看出，在培養條件相同的條件下1/2ms較ms培養效果好，而幾種培養基對比發現，(4)培養基配方在萌發啟動，小苗生長方面優勢明顯，所以較為適宜白及快速萌發需要，較優的萌發培養基配方為：1/2ms+naa0.1mg/l+ga30.1mg/l+白糖20g/l。

鱗莖高效誘導及壯苗培養基篩選

將高0.8～1.2cm的鱗莖轉接到表3列舉所示的培養基中進行轉接培養，培養條件為ph5.8-6.0；光照1500--2000lx，12-15h/天；溫度，24--28℃；對對各個培養基的鱗莖生長情況進行觀測及統計，記錄于表4。

表3鱗莖高效誘導及壯苗培養基配方設計

表4鱗莖高效誘導、壯苗培養基篩選情況

由表4可看出，a配方根生長旺，影響了鱗莖的分化及生長；h培養基因多效唑濃度較高，出現分孽明顯，而鱗莖、植株生長都受到抑制；d、e、f配方，根生長良好，但鱗莖分化和長勢較差，分化較多纖細的小苗；b、c、g配方，因6-ba、pp333的濃度和配比較為適宜，其鱗莖分化及長勢較好，其中以c配方在鱗莖誘導分化、鱗莖生長、壯苗方面效果最顯著，所以適宜白及鱗莖高效誘導、壯苗培養的配方為1/2ms，naa0.6mg/l，6-ba0.8mg/l，pp3330.5mg/l，白糖40g/l，香蕉泥25g/l，活性炭0.1g/l。

進一步將表4培養而成的組培苗(轉接60天)進行移栽，開瓶煉苗1周，移栽到覆蓋腐殖土3-5cm的壟上，并注意遮陰和保濕，移栽20天時統計成活率及長勢，記錄于表5所示：

表5：移栽苗的成活率統計

“_”表示長勢差，“+”表示長勢較好。

從表5可以看出，c配方的移栽苗生長勢及生根情況較好。

實施例1白及鱗莖快速誘導組培方法

步驟1：果莢要求，采用變淺棕色、成熟白及果莢，常規保存的果莢極容易感染雜菌和破裂，無法滿足白及組培苗周年生產所需，采用牛皮紙包住于冰箱冷藏是4℃保存；

步驟2：將未開裂的果莢用70％的酒精涂洗表面1-3min，然后在超凈工作臺上將果莢置于質量分數為0.1％的升汞中浸泡15--20min，再用無菌水沖洗3--5次，無菌濾紙吸干表面水分以備接種；在超凈工作臺上，將消毒過的果莢用無菌剪刀剪開小口，用無菌接種環蘸取種子均勻的涂在高溫滅菌的培養基上，培養基配方為1/2ms+naa0.1mg/l+ga30.1mg/l+瓊脂粉6.5-7.0g/l+白糖20g/l，ph5.8-6.0；培養條件為，培養條件為光照1500--2000lx，10-12h/天；溫度，24--28℃，培養4周左右，得到帶1-2片小葉，株高0.8-1.2cm的小苗；

步驟3：進行轉接培養，培養基配方1/2ms+naa0.6mg/l+6-ba0.8mg/l+pp3330.5mg/l+白糖40g/l+香蕉泥25g/l+活性炭0.1g/l，ph5.8-6.0，經滅菌后用；該培養基為白及假鱗莖誘導、快速生長，生根的壯苗培養基；培養條件：光照1500--2000lx，12-15h/天；溫度，24--28℃；在轉接培養基上，假鱗莖誘導及快速生長觀察：轉接苗在假鱗莖高效培養基上，經過2-3周培養，小的假鱗莖已經分化，4-5周時統計，鱗莖分化率在90％以上，且假鱗莖生長快速；到8周時，假鱗莖直徑大于0.4cm的為90％以上，株高6-10cm,根須發達；圖1為一株白及假鱗莖的直徑測試圖，從圖1可看出其直徑達到9.41mm，圖2、圖3為兩株白及假鱗莖的株高測試圖，圖4為一個培養皿培養60天后的白及假鱗莖生長情況。

步驟4：煉苗、移栽，將培養苗從培養室中移到常溫環境下開瓶煉苗1周，洗凈，定植到移苗地的箱面上，澆上定根水，并用遮陽率40-60％的遮陽網遮陽，每3-5天澆水1次，保持濕度。30天左右，新根及新葉長出，統計成活率，圖5為移栽20天后的生長情況。用以上方法培養，分別于2017年3月25日、2017年4月22日、2017年5月20日、2017年6月22日出苗移栽，成活率統計如下表6：

表6：實施例1的組培苗的移栽成活率

由表6可以看出，各日期移栽的株苗成活率均在85％以上，而且生長快速；而5月份，以腐殖土70％+珍珠巖30％為覆蓋土上移栽成活率最好。

進一步將實施例1所述白及鱗莖組培方法與現有方法進行對比，得到如表7所示的結論：

表7現有方法與實施例1所述方法的比對

表中“——”表示無

由表7可進一步反應出，本方法簡化了白及假鱗莖組培苗的生產環節，誘導假鱗莖、促進假鱗莖快速生長，以及生根壯苗培養在同一步完成，從種子到移栽所需時間為90天內，縮短了培養時間，提高了假鱗莖分化率，促進了假鱗莖的快速生長，提高了組培苗的移栽成活率。

最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。