具有殺線蟲活性的幾丁質-蛋白質復合物的制作方法

專利名稱:具有殺線蟲活性的幾丁質-蛋白質復合物的制作方法
本發明涉及將有殼水生動物廢料轉變成有用產品的，和代替用于處理有殼水生動物加工工業所產廉價廢物的高成本傳統方法的加工過程，更具體一些說，本發明涉及從甲殼綱外骨骼硬聚合基質分離出和回收自然界存在的幾丁質-蛋白質復合物，和應用此復合物去抑制園藝和農業所關心的植物寄生線蟲和其他線蟲生長的方法。
背景技術：
線蟲，或不分節的線蟲，具有細長、梭形或袋狀和外蓋護膜的身體，屬線形動物門，廣存于自然界，居于土壤、水和植物，與廣大動、植物的寄生病害有重要關系。
雖然有些重要問題與動物的線蟲病有關，但主要的興趣似乎仍然集中在寄生于植物的根、莖、葉和種子的線蟲方面。線蟲是損害農作物和使世界生產遭受重大經濟損失的主要因素。舉例來說，有害線蟲包括根瘤線蟲(根節線蟲屬類)、傷根線蟲(草地墊刃線蟲屬類)、螺旋形線蟲(嗜日墊刃線蟲屬類)與潛伏線蟲(與內侵線蟲屬相似)。這些線蟲對柑桔類作物和200多種其他植物，具有嚴重的損害作用。在葉紋中也可找到損害矮生植物桿子的線蟲(墊丸大線蟲屬類)、腎狀線蟲(Rotylenchulus類)和針狀線蟲(Amphelenchoid-es類)。侵擾果園的線蟲有環狀線蟲(Marroposthonic類)和劍狀線蟲(Xiphinema類)。常常侵擾大豆的有大豆囊線蟲(異皮線蟲屬類)和根瘤線蟲(根節線蟲屬類)。
僅在美國，就有近2百萬英畝農田每年要進行預防、檢疫、施化肥、煙熏土壤、熱水處理和其他處理，以防止線蟲。這些土地包括種植非糧食作物(如棉花和煙葉)、大田作物(如玉米和小麥)、果園作物(如蘋果、柑桔和堅果)、蔬菜(如土豆)和大量觀植物的土地。易受線蟲侵擾的有扁桃、蘋果、天門冬屬植物、柑桔(包括橙子、園柚、洋檸檬和酸橙)、棉花、葡萄、西瓜、桃子、落花生、菠蘿、大豆、草莓和其他食用植物和幾乎全部蔬菜，此外還有家庭花園和草坪，工業觀賞草地和許多其他植物。此外，由于直接或間接受不可防御的線蟲的干擾，使得大面積的可耕農田(包括作物地、牧草地、森林地和其他農田地)可能休閑或無用。
控制線蟲的植物方法有作物輪換、土壤處理、施化學肥料、施新鮮苜蓿或芥末這樣的“綠肥”，以及土壤處理等各種物理方法。象水蒸汽處理土壤和熱水處理植物主莖之類的方法，一般只是在一定的范圍內適用。另一方面，雖然線蟲對許多市售農藥，不論是以氣體的形式用(如煙熏法)，還是以液體和固體的形式用(如撒在土壤中)，都有抵制作用，但是系統施農藥的化學方法已取得了相當大的收效(A.C.Tarjan and P.C.Cheo，“羅德島大學的線蟲篩選方案”，Contribution 887，農業實驗站，Kingston，R.I.March，1956)。
目前，已在美國環境保護署注冊的、可作重要食品、原料和纖維作物防止線蟲用的化學品只有25個左右。而且現在市場上大多數的防線蟲劑商品，對人和動物是有毒的，大都是含有機物的硫代磷酸酯(硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯)化合物和膽堿脂酶抑制劑。其中許多還有植物毒。由于其對環境有不利的影響，目前對市場的一些防滅線蟲藥品，正在進行可能導致取消注冊的鑒定。在控制植物寄生線蟲方面應考慮的關鍵問題，是安全和效力問題，以及農業成本問題。目前商業上很需要有干擾線蟲和殺線蟲的物質，特別需要各種對動、植物和人類無害的生物控制劑。
雖然幾乎在所有的土壤中，特別是在那些含有腐植質的土壤中，有原生動物門、細菌、捕食線蟲的東西和在理論上可起抵抗植物寄生線蟲控制劑制作用的霉菌，但是世界上到處都在大規模地實行生物控制方案(K.F.Baker and R.J.Cook，“植物病原的生物控制”，W.H.Freeman and Company，舊金山，California，1974;H.Decker，“植物線蟲和對它的控制(植物線蟲學)”，Published for the U.S.Department of Agricul-ture and the National Science Foundation，Washington，D.C.by Amerind Publishing Co.Ltd.，New Delhi，India，1981)。
用有系統和有規劃的方法，對Chesapeake Bay之類的特別地區，將相當大量的無毒有機廢料(可以聚集起來的和引起嚴重環境污染和經濟后果的無毒有機廢料)引入土壤所起生物作用的分析結果是，效果甚微(R.A.A.Muzzarelli and E.R.Pariser Eds.，“關于幾丁質-蛋白質的第一次國際會議的科研報告集”，MIT Sea Grant Report，MISG 78-7，Cambrige，Mass，1978;B.L.Averbach，“利用幾丁質廢料生產幾丁質/脫乙酰殼多糖”，P.P.285～300，in W.S.Otwell;“80年代海洋食品廢料的有效管理科研報告集”，Florida Sea Grand Report No.40，February，1981;T.P.Cathcort et al，“復合蘭蟹加工植物固體廢料”，An-nual Report，Department of Agricuture Eng-ineering University of Maryland，College Park，Maryland，March，1982)。
但是Brown等在實驗室所做各項試驗所取得的結果表明，當用干粉海洋食品廢料〔含有市售的幾丁質和葡萄糖，堿處理(3.5%NaOH，24小時)過的和未處理的蝦殼廢料〕作土壤調節劑時，據統計，在根瘤干擾上明顯下降，在番茄和觀賞植物中幾丁質分離放線菌綱的數目明顯上升(L.R.Brown et al.，“幾丁質海洋生物廢料應用于控制植物寄生線蟲”，MMRC Project No.GR-76-004 and CO-76-020，Mississippi Marine Re-source Chronical，Long Beach，Mississippi，Octorber，1977 and“幾丁質海洋食品廢料用于控制植物寄生線蟲”，BMR Project No.GR-ST-78-003 and GR-ST-78-004，Bureau of Marine Resources，Miss-issippi Department of Wildlife Conservation，Long Beach，Mississippi，September，1979)。
在Chesapeake Bay地區與聚集蟹殼廢料有關的一些問題(如墨西哥灣的蝦殼廢料)，和在由這些廢料分離幾丁質和脫乙酰殼多糖所起的作用和所得的效果方面，大家經常看法不一致，因此促使了實驗室研究工作的開展，導致了本發明方法的產生。在已發表的報告中提出的看法有以下一些(a)將殘存作物和炭質物質加入土壤的結果是，土壤群體中的線蟲和某些真菌都受到抑制(M.B.Linford et al，“在有機質分解期間，爛根線蟲的土壤群體下降”，SoilSci，45，27，1938;C.B.Davey and G.C.Papa-vizas，“有機土壤調節劑對菜豆抗絲核菌病害的作用”，Agron.J.，51493，1959);(b)在土壤中加少量市售幾丁質，但不加脫乙酰殼多糖或乙酰氨基葡糖時，似乎能夠刺激產殼質酶的微生物，和減輕由鐮刀菌引起的菜豆嚴重爛根(R.Mitchell and M.Alexander，“溶真菌的現象和土壤中鐮刀菌的生物控制”，Na-ture，190，1961;R.Mitchell and M.Alexander，“幾丁質和鐮刀菌病害的生物控制”，Plant Disease Repor-ter 45487，July 15，1961;(c)是脫乙酰殼多糖而不是幾丁質，能抑制包括在培養基中的植物和動物的病原體在內的許多真菌(C.R.Allan and L.A.Hedwiger，“幾丁質對變更細胞壁組成的真菌所起的殺真菌作用”，Exp.Mycology 3285，1979)。(d)脫乙酰殼多糖的工業制品在減少工業蟹加工過程廢水所需化學氧和生物氧方面的作用很小，或沒有(F.W.Wheaton et al.，“蘭蟹加工廠廢水的性質和處理系統的發展”，WRRC Technical Report No.65，University of Maryland，College Park，Maryland，April 1981)。
在目前發表的專利文獻中也對發展各種有關幾丁質處理的有用方法進行了描述(Austin，U.S.Patents 3，879，377，3，892，731 and 4，286，087;Balassa，U.S.Patents 3，903，268，3，911，116 and 3，914，413;Dunn，U.S.Patent 3，847，897;Casey，U.S.Patent 4，059，097;Muralidhara，U.S.Patent 4，282，351)，這些內容作為參考材料結合在本發明中。有的專利文獻介紹了各種由幾丁質回收脫乙酰殼多糖的成熟技術(Rig-by，U.S.Patent 2，048，879，Penniston，U.S.Patents 3，862，122，4，195，175 and 4，199，496)，這些內容也作為參考材料結合在本發明中。
發明提示本發明的目的是，為了給處理工業有殼水生動物加工廠所產的經濟價值極低的殘留廢料，提供改進和經濟上有利的方法。
本發明的另一目的，是為了將含幾丁質的生物量廢料變成工業有用組成，特別是變成農業、園藝和動物飼料等有用組成和形狀，提供一種方法。
本發明的再另一目的，是為了從自然界存在的、在各種培養基和土壤樣品中具有能產生干擾線蟲和殺線蟲活性的含幾丁質生物量，獲得大量的工業原料，提供一種改進的和廉價的方法。
本發明的一個比較具體的目的，是提供一種新的分離出的幾丁質-蛋白質復合物。這種幾丁質-蛋白質復合物，可從現有的自然資源中獲得，并對原型線蟲類的線蟲，具有切實可靠的活性，不用根據直接毒殺法去消滅線蟲。
對于應用本發明的專業人員，只要學習本專利的說明書和附在后面的權利要求
，就可以較深入和全面地了解本發明的目的、特點和優點。
本專利涉及用經濟易行的稀酸水解甲殼動物廢料法制造具有殺線蟲活性的幾丁質-蛋白質復合物這一新發現。在此法的脫礦質和部分蛋白質降解過程中，可以有，也可以沒有二氧化碳和其他揮發氣體的回收設備。用顯微鏡觀測所得幾丁質-蛋白質復合物在線蟲離體培養基中誘發殺線蟲活性時，可以看出，由于線蟲失去活動能力和死亡而形成的早期衰老和空泡。用亮綠和甲苯基亮蘭染色法對線蟲進行染色，就可以使染上色的死線蟲與活動的線蟲形成鮮明的對照。
由于本文提出的幾丁質-蛋白質復合物可以誘發殺線蟲活性，在工業上容易低成本大量生產，加入農業和園藝用土壤可以控制使植物致病的線蟲，由此可見，本發明為利用價格特別低的有殼水生動物廢料，為避免由于線蟲干擾造成的糧食、纖維和經濟損失，提供了一種在經濟上和環境保護上都具有吸引力的方法。將這種物料并入動物飼料，也為控制腸胃線蟲病和豐富食用蛋白資源，提供了一種方法。
圖的說明對于技術熟練的專業人員，結合以下的，可以對發明有一個較全面的了解。
圖1表示本發明制造幾丁質-蛋白質復合物的過程和可能回收的副產品。
圖2表示按例2所述方法處理蟹殼原料所得蛋白質的亞基組成。
圖3表示用于處理有殼水生動物廢料以生產工業幾丁質和脫乙酰聚多糖產品的一般方法(供與本發明方法作對比之用)，和幾丁質和脫乙酰殼多糖的化學結構。
圖4表示例2、3和4所制得的幾丁質-蛋白質復合物中蛋白組分的亞基組成。
圖5表示用例2所述的酸處理法處理工業赤霉素發酵過程所產干發酵餅所得幾丁質-蛋白質復合物中蛋白組分的亞基組成。
圖6表示幾丁質、脫乙酰殼聚糖和蟹殼幾丁質-蛋白質復合物的交流(AC)電導率與所用電壓的關系。
圖7表示幾丁質(A)、本發明的幾丁質-蛋白質復合物(B)和脫乙酰殼多糖的紅外光譜。
圖8表示未處理的霉菌發酵餅(A)和本發明酸處理霉菌發酵餅產品(B)的紅外光譜。
圖9表示在對比培養基(A和B)中，在接種16～28天后線蟲(Panagrellus類)的顯微照片，和在含本發明幾丁質-蛋白質復合物的試驗基(C和D)中在接種16～20天后線蟲的顯微照片。
圖10表示用亮綠染色的活線蟲和死線蟲。
實現本發明的最佳方法用任何合適的含幾丁質生物量原料，都可以制造本發明的幾丁質-蛋白質復合物。這種原料不限于帶殼的無脊椎動物的生物體，例如，包括甲殼綱動物、軟體動物、海底生物體和鯨食蝦的節肢動物。最好的有殼水生動物廢料，是加工蟹、龍蝦、螯蝦、河蝦和對蝦得到的廢料。包括藻菌目和子囊菌目類在內的真菌細胞壁和絲狀團都含有幾丁質，但是不能為工業加工提供原料，因為所有這類原料都已被利用了。藻菌目和子囊菌目的生物體可能被含在蝸牛(大蝸牛-園口螺屬)消化液內的，或由某些像假草細胞菌屬之類細胞產生的30幾個酶(包括幾丁酶、葡萄糖酶和干露聚糖酶)中的一個或幾個酶消化掉，因此目前最能實現的，是以Chesapeake Bay產的蘭蟹〔蘭泳蟹屬(Callinectes Sapidus)〕殼為原料來制幾丁質-蛋白質復合物。茲將制造方法介紹于下傳統的蘭蟹加工法(E·J·Middlebrooks，“工業污染控制，卷1農業工業”，John Wileyand Sons，New York，206～207，1979)所用的蟹，或從泥漿綱撈而得，或用誘餌陷阱和繩綱捕捉而得，或在蟹脫皮期間從多草的海濱刮得。鄧杰內斯蟹、石蟹和雄蟹是用誘餌罐捕集，然后貯藏在具有循環海水的船上，和(或)在加工以前，一般用干殺法將蟹殺死，貯藏在陸地上的罐內。蘭蟹是在活的情況下被運到加工廠，然后倒入電車，用直接蒸汽，在121℃下蒸煮18～20分鐘，然后將蒸煮過的蟹置冷庫中過夜，然后除爪，保留備下一步使用。在脫下甲殼和爪子后，用機器或人工采摘法對蟹爪，有時蟹殼進行剝肉處理。蟹加工廢料，一般排入水溝，或城市下水道，或埋掉以保衛生，或者送去煉油，通過干燥和切細加工，最后生產出飼料。此飼料特別適用于作雞飼料(P·R·Austin et al.，U·S·Patent 4，320，150;W·P·Uri Yrams，Jr·and T·M·Miller，“根據營養價值來看蟹粉和蟹粉-磷酸用作單胃動物家畜用高蛋白質飼料問題”，Final Report(F15-81-005)to Department of Natural Resouces，Maryland Tidewater Admin，Stration Narch，1982)。
本發明認為，宜優先選用的原料或粗料(圖1)是已烘干和切成小粒的蟹加工廢料。為了降低原料的價格，可以省略干燥步驟。原料的粒度只影響加工速度，但不影響性質。蟹粉原料的組成，因海洋和殼上肉的清除程度而不同，一般原料含40～50%的蛋白質，少量的碳酸鈣和其他的礦物鹽(約50%)以及約含10%的幾丁質。
干燥和切細的蟹殼廢料被磨成或打碎成合乎要求的粒度后，或直接送入加工裝置使用，或在需要的情況下經過熱、冷水洗滌，以除去輸送過程中所造成的污染，然后送入加工裝置。將碎殼料放入攪拌罐式反應器中，應用1.0N HCl之類的稀無機酸，在常溫常壓下進行脫礦質。脫礦質的時間為30～60分鐘。不宜用硫酸和磷酸之類的酸，因為這類酸會產生不溶性鈣鹽，影響產品回收。在脫礦質的反應過程中，伴隨產生明顯的蟹殼蛋白質組分的變性(圖2)釋放出具有可察覺的、鏈烷胺特征的魚味CO2氣，因此可用滴定或測定此放出氣體的方法，對反應進行監視。
應特別注意的是，不溶性反應最終產物是幾丁質-蛋白質復合物。它的凝膠電泳性質不同于用乙二胺四乙酸螯合劑脫礦質脫蟹殼時所得的產品(圖4)和由真菌分離出的幾丁質-蛋白質復合物(圖5)。這種幾丁質-蛋白質復合物的固體電性質也不同于工業上用精細加工過的幾丁質和脫乙酰殼多糖為原料生產的幾丁質-蛋白質復合物(圖3、6)。
在完成脫礦質和蛋白質變性以后，用稀酸水解，水解時間為60分鐘(從水解開始算起)，然后用水或用弱蘇打灰(CaCO3)溶液洗滌所得的幾丁質-蛋白質料，至中性(PH7.0)為止。對于脫礦質和蛋白變性過程以及水洗罐排出的污水，可以將其循環以回收低分子肽、氨基酸和氯化鈣鹽，或簡單地將其排入指定的排水溝或廢水處理裝置。將所產的幾丁質-蛋白質復合物進行干燥和破碎。假若需要，可磨成粒度小于0.5毫米的粒子。所得的產品，可符合一般幾丁質和脫乙酰殼多糖加工(圖3)的需要，不用進一步加工。
所得的幾丁質-蛋白質復合物(圖4、6和7)具有(ⅰ)不溶于中性和稀酸溶液，但溶于濃無機酸，并同時使大量的蛋白質分解;(ⅱ)低灰分量;(ⅲ)由于存在蛋白質部分的原因，所以具有高結合氮含量;(ⅳ)將自然界存在的生物降解物質加入線蟲離體培養基時，結果是活生物體的數量明顯下降(圖9-10)。用由蟹、龍蝦、河蝦或其他殼類水生動物的加工廢料，或用由含幾丁質的真菌、真菌和酵母菌的細胞壁得出的幾丁質和脫乙酰殼多糖，能夠生產這種產品。用工業方法能夠高產率地生產這種產品，而且成本大大降低于上述方法。從原型線蟲類線蟲對幾丁質或脫乙酰殼多糖的反應來看(圖9)，在離體培養基中線蟲培體因誘發而引起的形態變化也是明顯不同的。
本發明的幾丁質-蛋白質復合物應用于植物生成培養基的數量范圍為1～50重%，一般與含有必要營養的植物生長培養基混合使用。較宜的用量范圍2-20重%。最宜的用量范圍為5～10重%。合適的用量因對植物防護技術掌握的程度而不同。這是周所知的。最適合的用量除了受上述變化的影響以外，還受所控制的病、作物的類型、作物的生長階段和使用期間所限制。在1到6個月的間期內，可能需要按規定的用量重復1或數次。可以將本發明幾丁質-蛋白質復合物做成各種形狀供使用，最好制成片狀或粒狀。
將活性組分與表面活性劑(或不用)、粉碎的固體(如滑石粉、天然白土、葉蠟石和硅藻土等)、粉末(如小麥、紅杉和黃豆等的粉)或無機物(如碳酸鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、硅鋁酸鈉、硫等)進行調配，可以制得各種粉狀和塵狀制品。顆粒稀釋的選擇是根據對所需產品的物理和化學要求，活性組分的物化性質和濃度，使用上要求的形狀。
依據調配用的活性組分、稀釋劑和其他加入物的用量可以知道制成品的組成。
用加液體、機械處理和一般干燥的方法，可以將粒狀制品變成粉狀制品。所用的機器有球磨機、混合機和擠壓機。即使混合物中沒有液體也可用成型機成型。在成型的粒子中可以含水溶性粘合劑。例如有機鹽、尿素、木素磺酸鹽、甲基纖維素和其他水溶性聚合物等。在最終的球狀或片狀制品中上述物質的含量約為25重%。這些物質有助于在野外條件下片狀制品的分解，和活性物質的釋放。另一種方法是將活性組分的懸浮液噴在由白土、蛭石、玉米等制成的粒子上。后法還可以使用表面活性劑。
本發明的組成，除含本發明的活性組分外，還可以含通用的殺蟲劑、殺螨劑、殺菌劑、殺線蟲劑、殺真菌劑、固果劑、疏果劑和肥料等農用化學品。所以這種制品除了具有殺線蟲作用外，還可以作許多其他用途。
由于幾丁質-蛋白質復合物含有蛋白質，所以使幾丁質-蛋白質復合物含10%的慢釋性氮。因此它能與促使代謝變化的亞磷酸化合物和(或)鉀源聯合起來幫助肥料平衡。這又是它的一個優點。用眾所周知的技術，進一步加入其他氮肥源，可以使土壤內的氮肥增加。目前最能體現本發明的方法是將上述組成與土壤或像蛭石之類的無機物粒子在罐內混合，例如用于培養溫室或苗圃這樣培養植物之類的地方。在上述制品中加入Harposporium類真菌，可以提高幾丁質-蛋白質復合物的殺線蟲活性。
按照本發明可以控制使植物致病的線蟲，但不排斥用去控制下表中的線蟲。
表Ⅰ致病的植物線蟲線蟲 植物寄主Aphelenchoides besseyi 草
屬Ditylenchus dispari 根作物，莊稼Heterodera rostochiensis 馬鈴薯Ditylenchus dectructor 馬鈴薯Pratylenchus Penetrans 煙葉、蘋果、櫻桃Xiphinema americanum 草、柑桔、番茄Melonidogyne hapla 馬鈴薯Tylenchulus semipenetrans 柑桔Ditylenchus myceliophagus 真菌Tylenchorhynchus claytoni 煙草
Hemicriconemoides chitwoodi 山茶屬Hemicycliophora arenaria 柑桔Paratrichodorus christiei 旱芹Paratylenchus Projectus 草Dratytenchus zeae 玉米Holoaimus columbus 大豆Pratylenchus neglectus 玉米、草
屬等我們相信，任何一個專業人員，不用作進一步的說明，應用上述說明，就可以全面地應用本發明。所以下面的實例只是為了幫助作比較詳細的說明，決沒有限制本發明其余部分的意思。
以下所有的溫度都是未校正的攝氏溫度。除有注明者外，所有的壓力都是常壓。所有的分數和百分數都是重量分數和重量百分數。元素分析數據在一般誤差范圍之內。所有新產品都具有所希望的紅外母體峰。
例1原料制備將市售的蟹粉加工廢料，在經過水洗后，放入空氣干燥箱，在100℃下干燥16小時左右。然后用機械法將它破碎到能通過美國25號標準試驗篩的粒子。這些粒子含5～10%的水分、近40～50%的蛋白質和30～50%的CaCO3(干重量基)。未經任何處理的三批有代表性原料的元素組成見表Ⅱ。蛋白質含量是用Lowry法測得(測量酪氨酸和肽含量)。氮含量是用基于Pregl-Dumas法和Perkin-Elmer型240B元素分析器的燃料分析法測得。
表Ⅱ有殼水生動物原材料的組成元素組成 未分的(1) 篩過的(2) 篩過的(3)鈣(微克/克) 92900.0 94999.0 95900.0鈉(微克/克) 9470.0 12000.0 10500.0鎂(微克/克) 4880.0 5170.0 5030.0鉀(微克/克) 4160.0 3390.0 4420.0蒽(微克/克) 1070.0 1000.0 1170.0鐵(微克/克) 361.0 410.0 716.0鋁(微克/克) 100.0 103.0 206.0鋇(微克/克) 25.5 23.5 34.6硼(微克/克) 4.5 4.5 6.6鎘(微克/克) ＜0.5 ＜0.5 ＜0.5鉻(微克/克) 1.0 1.5 1.6鈷(微克/克) ＜1.0 ＜1.0 ＜3.3銅(微克/克) 27.0 25.0 36.3鉛(微克/克) ＜2.5 ＜2.5 ＜8.2錳(微克/克) 150.0 145.0 228.0鉬(微克/克) ＜1.0 ＜1.0 ＜3.3鋅(微克/克) 69.0 57.5 74.2碳(%) 29.84 34.76 34.01氫(%) 3.96 4.74 5.59氮(%) 5.46 6.29 7.19蛋白質(Lowry法)(%) 32.4 43.0 41.8灰分(%) 45.76 36.65 37.22水分(%) 7.41 10.47 8.11(1)碎殼廢料，作為標準樣品(批號118)。
(2)磨碎殼廢料，通過ASTM40篩目的篩子(批號118)。
(3)磨碎殼廢料，粒度＜0.5毫米。
例2用酸脫礦質法分離蟹殼幾丁質-蛋白質復合物(實驗室規模)用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(含10%的聚丙烯酰胺凝膠，聚丙烯酰胺凝膠內含0.1%的十二烷基硫酸鈉)測定亞基組成。各種蛋白質在用考馬基亮蘭R染色之后的凝膠掃描見圖2。圖中，各箭頭所指的位置是各種具有標準分子量蛋白質的位置。其中(a)為脫漿球蛋白質(200，000);(b)為β-半乳糖甙酚(116，500);(c)為磷酸化酶(97400);(d)為牛血清白蛋白(66，200);(e)為卵白蛋白(45，000);(f)為碳酸酐酶(31000);(g)為大豆胰蛋白抑制劑(21，500);(h)為溶菌酶(14，400)。括號內的數值為分子量，單位為道爾頓。
將100克例1制的原料，在30分鐘的時間內，在連續攪拌下，慢慢地加入2升1.0N的HCl溶液內。根據反應混合物的泡化和釋放出的具有胺味的CO2氣，來判定反應迅速引起原料中CaCO3迅速脫礦質的情況。將40毫升左右的濃HCl分多次，在60分鐘的時間內加入反應混合物，以維持其酸度在PH值為1.5左右。此后不會有泡出現。用美國評定分子篩標準法NO.270，聚集在脫礦質和部分水解步驟之后留下的不溶性剩余物，并用水洗滌，直至產品和洗滌水均呈中性(PH7.0)為止。將此不溶性產品在100℃下干燥一夜，可得128克產品(產率為32%)。將此干燥產品置Wiley實驗室用磨碎機中，磨成顆度小于0.5毫米的粒子，供此后所有的研究之用。
例3用螯合劑處理法分離蟹殼幾丁質-蛋白質復合物(實驗室規模)將10克例1制的原料，放入1升0.1M的乙二胺四乙酸溶液(PH7.5)內，然后在25℃下連續攪拌此混合物72小時。用美國評定分子篩標準法NO.270，聚集留下的不溶性產品，并進行徹底洗滌，然后在100℃下烘干一夜，可得2.75克干燥產品(產率為27%)。
例4幾丁質-蛋白質復合物的制造(小型試驗規模)將15公斤例1制的原料，放入盛有100升1.25N HCl的200升具有攪拌器的不銹鋼反應罐內。以在60分鐘的脫礦質和酸水解反應的時間內盡量少生泡為準，控制加料速度。用設有150篩目自動清洗不銹鋼綱的Sweco(R)Vibro-Energy(R)分離器聚集脫礦質和酸水解后留下的不溶產物，然后對其進行水洗、1%Na2CO3溶液洗，再水洗，以除去所有的可溶性碳酸鹽。置此中性(PH7.0)產物在100℃下干燥一夜，然后將其磨碎成粒度小于0.5毫米的粒子。例2、3和4所得制品、幾丁質和脫乙酰殼多糖的元素組成見表Ⅲ。
用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(含10%的聚丙烯酰胺凝膠，聚丙烯酰胺凝膠內含0.1%的十二烷基硫酸鈉)測定由例2、3和4制得的幾丁質-蛋白質復合物內和工業幾丁質內以及工業脫乙酰殼多糖內蛋白質組分的亞基組成。圖4表示上述各種蛋白質組分在用考馬斯亮蘭染色之后的凝膠掃描。其中樣品(A)是例1制的5毫克米處理蟹殼廢料;樣品(B)是例2用稀酸水解脫礦質法制得的幾丁質-蛋白質復合物。樣品(C)是例2用乙二胺四乙酸脫礦質法制得的幾丁質-蛋白質復合物;樣品(D)是按照例4方法制得的幾丁質-蛋白質復合物;樣品(E)是工業制造的幾丁質，箭頭表示的意思與圖2同。
例5由于真菌生物量分離出幾丁質-蛋白質復合物(實驗室規模)可用由工業赤霉素發酵過程獲得的干發酵罐餅作原料，以代替例1至例4所用的蟹殼原料。將200克干菌生物量放入1000毫升1.0NHcl內。連續攪拌此混合物1小時。在反應過程中沒有明顯的氣體放出，鹽酸溶液也不會明顯中和。用離心法(SorlallCSA旋轉器，轉速為10000轉/分，4℃下，運轉10分鐘)聚集留下的不溶物質。將所得細粒重新懸浮于水，并再進行一次如上所述的分離。重復上述步驟4次，直到留下的不溶性生物質和洗滌水均呈中性(PH7.0)為止。置在經過5次水洗之后所留下的不溶性物質于100℃下，烘干一夜，可得88克固體料(產率為44%)。在使用前，用Wiley實驗室磨碎機將其磨成粒度小于0.5毫米的顆粒。其組成見表Ⅳ。
圖5表示用酸處法處理工業赤霉素發酵過程產的干發酵罐餅所得幾丁質-蛋白質復合物的蛋白組分的亞基組成。掃描(A)表示酸處理過的原料。掃描(B)表示未處理的真菌發酵罐餅。箭頭表示的意思與圖2同。
例6幾丁質-蛋白質復合物的特性對于蟹殼原料樣品和每一評定物質(粒度小于0.5毫米)，都要進行碳、氫、氮、灰分和金屬等含量的分析，總含量和氨基酸含量的分析(表ⅡⅢ和Ⅳ)固態電性質分析(圖6)和紅外光譜分析(圖7～8)應用感應偶合等離子體發射光譜作金屬元素的組成分析。
表Ⅳ真菌制品的組成真菌發 酸處理過的元素組成 酵罐餅 真菌發酵罐餅鈣(微克/克) 766.0 174.0鈉(微克/克) 102.0 160.0鎂(微克/克) 1000.0 23.5鉀(微克/克) 8270.0 132.0鍶(微克/克) 3.2 1.9鐵(微克/克) 106.0 237.0鋁(微克/克) 26.9 28.1鋇(微克/克) 1.1 ＜0.9硼(微克/克) 2.1 3.7鎘(微克/克) ＜1.0 ＜0.9鉻(微克/克) 1.0 ＜1.9鈷(微克/克) ＜2.1 1.9銅(微克/克) 8.6 1.9鉛(微克/克) ＜5.4 ＜4.7錳(微克/克) 8.6 2.8鉬(微克/克) ＜2.1 ＜1.9鋅(微克/克) 22.7 1.9碳(%) 52.74 1.9氫(%) 7.07 7.60氮(%) 6.03 6.20蛋白質(Lowry法)(%) 31.46 29.32
灰分(%) 4.96 30.75水分(%) 4.04 5.33應用Perkin-ELmer240B元素分析儀作碳、氫和氮的分析。應用Perkin-ELmer型1320紅外光譜儀，測量所有物料的紅外光譜。用10NNaoH溶液，在25℃下抽提每種物料48小時，以測定其總蛋白質含量，然后用Lowry法測定溶液中蛋白質含量。在真空下用6NHCl進行樣品水解(110℃，24小時)，以分析氨基酸的含量。按照最近鑒定過的那標準方法(M·W·Dong and J.C.De Cesare Liq.Chrom.1，222-228(1983))，在用高效液體色光譜分離之后，測定氨基酸量。采用標準實驗室電測定法，測定固態電性質。氨基酸的組成見表Ⅴ。
例7幾丁質-蛋白質復合中蛋白質組分的特性在蟹殼廢料酸脫礦質時，用十二烷基硫酸鈉抽提出的高分子量蛋白質減少(圖2)。但是總蛋白質量仍然近乎不變(表Ⅲ)，而且只有用延伸堿水解法才能分出蛋白質。這表明在酸處理過程中，或者是使蛋白質更不溶解，或者是使蛋白質部分降解，或者是使蛋白質同價地聯結在幾丁質上，或者這些同時發生。原材料和幾丁質-蛋白質復合物(表Ⅴ)的氨基酸分析結果證明，在弱酸水解時，氨基酸無明顯變化。這表明，在原料中和最終產品中的相對蛋白量不會有明顯的不同。如圖4所示，在工業幾丁質和脫乙酰殼多糖的制品中，蛋白質含量不是很高的。另一方面應用乙二胺四乙酸脫礦質制得的幾丁質-蛋白質復合物中，含有大量沒有變質的蛋白質。
表Ⅴ蟹殼廢料、酸脫礦質蟹殼廢料和乙二胺四乙酸脫礦質蟹殼廢料的氨基酸組成
a 幾丁質-蛋白質復合物 乙二胺四乙酸氨基酸 原材料 脫礦質批號524 批號118 蟹殼廢料b天冬氨酸 10.8 8.3 10.5 13.3蘇氨酸 3.6 8.6 4.513.6絲氨酸 4.9 5.5 4.8谷氨酸b 9.9 13.4 12.9 12.2甘氨酸 5.0 3.9 3.9 4.2丙氨酸 5.6 5.3 5.4 5.5纈氨酸 3.6 5.2 5.9 6.0甲硫氨酸 1.8 3.3 3.5 3.1異亮氨酸 4.4 5.4 5.5 5.1亮氨酸 10.5 8.5 9.0 7.4酪氨酸 4.9 5.9 5.7 5.9苯丙氨酸 10.8 9.3 9.8 5.9賴氨酸 12.5 7.3 8.3 7.5組氨酸 3.0 2.9 3.2 3.0精氨酸 8.8 7.1 7.0 7.2a 沒有測定半胱氨酸、脯氨酸和色氨酸。
b 天冬酰胺和谷氨酰胺分別包括在天冬氨酸和谷氨酸之內。
c 絲氨酸和蘇氨酸。
例8幾丁質蛋白質復合物中幾丁質組分的特性用紅外光譜分析幾丁質-蛋白質復合物，并與工業用幾丁質和脫乙酰殼多糖的紅外分析結果進行比較(圖7)。除了1738厘米的超吸譜帶以外，幾丁質-蛋白質復合物的光譜與幾丁質的光譜非常相似，這可能是由于蛋白質組分的原因。經過脫乙酰殼多糖化的幾丁質和含幾丁質復合物的吸收譜帶為1550厘米-1。這似乎表明，其與幾丁質中氨基團的乙酰化有關。幾丁質的譜帶較強，幾丁質-蛋白質復合物的譜帶表明，在制造幾丁質-蛋白質復合物的過程中，有非常少量的幾丁質脫乙酰。
真菌法制品的光譜見圖8。此光譜與幾丁質光譜非常相似。不處理法和酸處理法兩者制品的光譜也相似。這表明原料中幾丁質在形式上的變化很小。
幾丁質-蛋白質復合物的溶解性質與幾丁質的溶解性質相似，即不溶于通用的溶劑中。用除垢劑和象尿素、胍鹽之類的蛋白溶劑，或用堿處理，可使蛋白質部分溶解。另一方面，脫乙酰殼多糖可溶于稀有機酸(1%的乙酸、丙酸和甲酸)，并產生明顯的降解。
例9殺線蟲試驗系統的制備將Julius Feldmess博士在美國實驗室(the U.S.Depat-ment of Agriculture Plant Protection Institude，Bel-tsville，Maryland)制得的腐蝕寄生線蟲(Panagrellus類)，放入工業用燕麥粉谷類(Gerber Product Co，Fremont Michi-gon)內培養。線蟲被放在60×22毫米無菌塑料培養皿內，皿內盛有6克經高壓滅菌的燕麥粉谷類，和20毫升無菌蒸餾水。用懸浮有2000個線蟲的2毫升無菌蒸餾水滴入各皿內，進行接種。然后在30℃下孵化21天。按上述比例，控制僅含燕麥粉谷類、蒸餾水和線蟲的培養物。用于評定殺線蟲活性的物料都要經過高壓滅菌，然后按每盤0.2克的標準，將其加入各培養皿內。將對比用和評定用的培養物分成許多組，每組5個樣品。
例10殺線蟲活性的測定按照例9提供的評定系統制備并觀察培養物。從開始后的第6天開始進行觀察，一直延續到第21天，或直至培養物死盡。從含有Panagrellus類線蟲的培養物的活動表面，抽出0.01毫升試樣，用溫計數玻片技術，進行顯微鏡觀測，應用各組每一皿抽出樣品的測定值的平均值，來確定相對群種。從第6天起，開始計算線蟲數，一直連續到第21天。平均結果見表Ⅵ。從這些結果可以看出，在用本發明幾丁質-蛋白復合物處理過的培養基中，線蟲數明顯減少。
表Ⅵ各種制品對培養基活線蟲數的影響a活生物體的數目對比物 1300～1500b幾丁質 600～700b脫乙酰殼多糖 900～400b幾丁質-蛋白質復合物 0～400a-從試板表面取的0.01毫升樣品中算出的活生物體數。
b-具有3%(重/重)的添加。
在第17天后可以看出生動體總數明顯減少，繁殖率下降。雖然在用幾丁質-蛋白質復合物、幾丁質和脫乙酰殼多糖處理過的培養基中，在群體上都有減少，但是用本發明的幾丁質-蛋白質復合物時，線蟲減少最明顯。這也表明，用本發明的幾丁-蛋白質復合物，比用純度較高的幾丁質和脫乙酰殼多糖，在經濟上有明顯優點。目前沒有利用真菌發酵餅，但在數量上是足以考慮用它作本方法的實用原料。
在線蟲群體試驗中的殺線蟲活性見圖9(A～D)中的實情照片。這些照片包括在所有發展階段明顯變化的情況。用亮綠(C.I.42040)和亮甲苯基蘭(C.I.51010)avital染色法，可以提高鑒別死、活線蟲的準確性。染色的方法是，將一滴0.05%的水溶液放到有生物體的顯微鏡玻片上。在3分鐘內，死活生物體清晰可辨(圖10)。活生物體染不上色，死生物體則染上色。線蟲表面破裂情況顯示得相當清楚(圖9)。只有用幾丁質-蛋白質復合物處理過的培養基，早在13天以前的各個階段，就顯示出有大量標志線蟲過早衰老的空泡。這種出現空泡的情況，在用任何其它物質處理過的培養基中，是看不到的。
例11在具有土壤的培養基中幾丁質-蛋白質復合物的干擾線蟲和殺線蟲的活性將由農田隨意選得的土壤與幾丁質-蛋白質復合物，按0.05、0.025和0.01的比例(復合物/土壤，重/重)混合。將相同分子量的這種混合物撤到水內植物中和放在室溫下孵化。此時，腐蝕寄生線蟲的同系交配群體得到發展。可以看出有一些種類的線蟲出現，Panagrellus類線蟲和桿狀線蟲類線蟲占多數。計算培養基中死、活生物體的數目。由表Ⅶ可見，含5%幾丁質-蛋白質復合物的，殺死線蟲量最大。含有幾丁質和脫乙酰殼多糖的對比試驗結果表明，幾丁質和脫乙酰殼多糖的殺線蟲效率很低，在33天時分別僅為33%和49%。顯微鏡測定結果表明，在培養基中含有噬線蟲真菌時，會產生最大的殺線蟲率。這可以反映幾丁質-蛋白質復合物作用的方式，幾丁質-蛋白質復合物可以刺激噬線蟲真菌。
下表表示在關于幾丁質-蛋白質復合物對土壤培養基中線蟲生長的作用的三次重復試驗(每樣品三塊板)中所觀測到的殺線蟲活性。
表Ⅶ離體培養土壤活性試驗板上死生物體的百分數30天 45天 60天對比物 16% 16% 19%1%幾丁質-蛋白質復合物 52% 53% 91%2.5% ″ 49.7% 52% 77%5% ″ 93.6% 96% 80.7%改變上述諸例中所用的一般要求的和特殊要求的反應劑和本發明的操作條件，仍然很好地重復上述諸例中所得的結果。根據前面所作的說明，對于任何與本發明技術有關的專業人員，可以很容易地弄清楚本發明主要特點，不會背離本發明的精神和背景，能作各種改變和改進以適應各種用途和條件。
工業應用的可能性從上述揭示可以看出，本發明在將含幾丁質生物廢料轉變成具有對農業和園藝有用的干擾線蟲和殺線蟲性質的產品方面，在工業上是有用的。
權利要求
1.一種含有由含幾丁質廢料制成的具有殺線蟲活性的幾丁質-蛋白質復合物的，和主要包括不溶性脫礦質幾丁質組分和與之復合的蛋白組分的物質組成。該復合物基本上是上述廢料酸水解時形成的，和脫除了低分子量肽、氨基酸和氯化鈣鹽的復合物。該復合物的特性是a)Lorwy蛋白質含量至少約為50重%，灰分含量不大于15重%，水含量低于10重%(基于總組成)。b)溶解度性質與幾丁質的溶解度性質相似，在稀酸溶液中不溶解，但在濃無機酸溶液中溶解，且使大量蛋白質組分破壞。c)紅外光譜與幾丁質的紅外光譜相似，不同的是特點超吸收譜帶為1738厘米-1。d)水不溶的含乙酰基脫礦質幾丁質組分與幾丁質的基本相同，基本上不含碳酸鹽和含約不大于15%的幾丁質灰分，特征紅外吸收譜帶為1550厘米-1。e)具有氨基酸組成的水不溶蛋白組分基本上與未處理含幾丁質廢料的蛋白組分相同，由十二烷基硫酸鈉凝膠電泳法測得的分子量范圍為10000～50000道爾頓，基本上不溶于普通的蛋白質溶劑。f)該復合物是干的粒子，粒徑約小于0.5毫米。
2.按照權利要求
1的組成，它的Lowry蛋白質含量最低約為70重%，灰分含量不大于5%，水含量約不低于5重%(基于總組成)。
3.按照權利要求
1的組成，它在外形上是磨碎的固體。
4.一種由植物生長培養基和與之混合的、殺線蟲有效量的、合乎權利要求
1的幾丁質-蛋白質復合物配成的物質組成。
5.按照權利要求
4的組成，其中的植物生長培養基是土壤。
6.按照權利要求
5的組成，其中的植物生長培養基是適用作植物營養料的植物用罐裝土壤。
7.按照權利要求
6的組成，其中的植物生長培養基是用于種植對線蟲干擾敏感的活植物。
8.按照權利要求
4的組成，其中的植物生長培養基是粒狀的非有機物質。
9.按照權利要求
8的組成，其中的植物生長培養基是展平的云母。
10.按照權利要求
8的組成，其中的植物生長培養基是用于種植對線蟲干擾敏感的活植物。
11.按照權利要求
8的組成，為了提高該幾丁質-蛋白質復合物的殺線蟲活性，可在其中加入有效量的真菌(Harposp-orium類)。
12.一種抑制在能支持腐蝕寄生線蟲生長的植物生長培養基中腐蝕寄生線蟲生長的方法。這種方法是將合乎權利要求
1的、干擾線蟲有效量的幾丁質-蛋白質復合物與上述植物生長培養基混合，以抑制線蟲生長。
13.按照權利要求
12的方法，其中的植物生長培養基是土壤。
14.按照權利要求
12的方法，其中的植物生長培養基是粒狀的無機物。
15.按照權利要求
12的方法，其中的植物生長培養基是生長營養料。
16.按照權利要求
12的方法，其中的殺線蟲有效量的幾丁質-蛋白質復合物是與植物生長培養基混合使用。
17.按照權利要求
16的方法，其中的干擾線蟲有效量最低約為植物生長培養基的5重%。
18.一種由合乎權利要求
1的、殺線蟲有效量的幾丁質-蛋白質復合物和與之相混合的適用于園藝的載體配成的殺線蟲組成。
19.按照權利要求
18的組成，它在外形上是磨碎的固體。
20.按照權利要求
18的組成，其中的載體是含土壤的調節劑。
專利摘要
由甲殼綱類的含幾丁質生物廢料制造幾丁質-蛋白質復合物。這種復合物不同于幾丁質和脫乙酰殼多糖，具有對農業和園藝有用的干擾和殺線蟲活性。應用方法是將殺線蟲有效量的復合物與植物生長培養基混合。此復合物還提供一種慢性釋放氮源，使得它特別適宜于與肥料和土壤調節劑聯合使用。
文檔編號C05F1/00GK85104021SQ85104021
公開日1987年1月14日 申請日期1985年5月22日
發明者羅伯特·奧斯汀·米爾殊, 拉塞爾·J·麥坎德利什, 巴巴拉·J·伊斯特伍德 申請人:Igi生物科技公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan