專利名稱：利用秀麗隱桿線蟲休眠作為生物標志物甄別地溝油的方法
技術領域：
本發明涉及一種地溝油甄別方法。
背景技術：
秀I 隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans,縮寫為C. elegans)為線蟲動物門泄管綱動物，作為一種典型模式生物在科研領域被廣泛應用。秀麗隱桿線蟲通體透明，易于觀察形態和行為；生命周期短，培養方便且廉價，易于保存和便于試驗操作，秀麗隱桿線蟲的實驗研究已形成一系列國際標準化與規范化操作。在食物不足如重要營養因子匱乏等不適宜環境條件時，秀麗隱桿線蟲會停止正常的生長發育，進入休眠階段(dauer stage)。進入休眠狀態的幼蟲與正常發育的秀麗隱桿線蟲在行為、形態和生理上存在顯著差異，表現為活動行為顯著減緩或者靜止，停止進食，體型改變為瘦長，體色增黑，表皮(cuticle)增厚，生殖細胞停止分裂等。這種低代謝、保能量的狀態，使其能夠在惡劣環境條件下的存活時間遠遠高于秀麗隱桿線蟲的正常生命周期壽命(約20天)。地溝油，泛指在社會生活中普遍存在的各類劣質油，如回收的食用油、反復使用的炸油，以及通過過濾、加熱、沉淀、分離等方法對城市下水道里的垃圾加工而成的“食用油”。 “地溝油”是一種質量極差、極不衛生的非食用油。一旦食用“地溝油”，它會破壞人們的白血球和消化道黏膜，引起食物中毒，甚至致癌的嚴重后果。地溝油回流到餐桌的現象在中國普遍存在并在近年被廣泛關注，而鑒定地溝油成為難題。目前國內尚未有檢測地溝油的統一標準。單憑人的感官，地溝油的色、香、味與普通食用油幾乎沒有分別。即便是能探明底細的儀器也常常難以辨別真假。見諸報道的地溝油檢測方法都存在一定盲區，準確率也有待提高，尚不足以對地溝油進行充分有效的鑒定。常規的通過膽固醇檢測鑒定地溝油的方法存在操作復雜，儀器依賴度大，造成鑒定成本高。
發明內容
本發明目的是為了解決現有地溝油鑒定方法存在靈敏度低、精確度差、操作復雜、 成本高的問題，而提供一種利用秀麗隱桿線蟲休眠作為生物標志物甄別地溝油的方法。利用秀麗隱桿線蟲休眠作為生物標志物甄別地溝油的方法，具體是按以下步驟完成一、制備培養基采用NaCl、瓊脂粉、蛋白胨、O. 8mol/L I. 2mol/L的CaCl2水溶液、
O.8mol/L I. 2mol/L的MgSO4水溶液、磷酸鹽緩沖液和蒸餾水混合均勻得到培養液，密封后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，并在120°C下滅菌處理15min 25min,然后降溫至50°C 60°C，并在無菌環境下加入待檢測食用油，再轉移至培養皿中，最后在溫度為20°C的無菌環境下干燥8h 12h，即得到培養基；二、培養向步驟一制備的培養基中均勻涂入濃度為 I X IO9個/mL 2 X IO9個/mL大腸桿菌0P50菌液，然后37°C培養8h 12h，再將接入秀麗隱桿線蟲幼蟲進行培養46h，在培養24h時秀麗隱桿線蟲幼蟲發育為秀麗隱桿線蟲成蟲并產卵；繼續培養12h時產卵發育成第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲；再繼續培養10h，若第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲進入休眠狀態，則待檢測食用油不是地溝油；若第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲不進入休眠狀態，與正常培養基生長的秀麗隱桿線蟲子代無明顯差別，則待檢測食用油是地溝油；步驟一中所述的培養液中NaCl的濃度為2X 10_3g/mL 3 X 10_3g/mL，瓊脂粉的濃度為 15X lCT3g/mL 20X lCT3g/mL,蛋白胨的濃度為 2X lCT3g/mL 3X lCT3g/mL, CaCl2 的濃度為 O. 8 XlO-VmL I X l(T6g/mL，MgSO4 的濃度為 O. 8X l(T6g/mL I X l(T6g/mL ;步驟一中所述的培養液中加入的磷酸鹽緩沖液占培養液總體積的20%。 25%。;步驟一中所述加入的待檢測食用油與培養液的體積比為(I 10) 1000;步驟二中所述濃度為I X IO9個 /mL 2X IO9個/mL大腸桿菌0P50菌液的涂入量為2mL/cm2 3mL/cm2 ;步驟二中所述的秀麗隱桿線蟲幼蟲的接種量為5只/cm2 10只/cm2。本發明優點本發明檢測方法與傳統的利用分析儀器鑒定地溝油的方法相比，彌補了常規膽固醇檢測方法5mg/g檢出限較高的不足，對特異成分痕量低的高精煉地溝油可以有效鑒定；利用秀麗隱桿線蟲休眠狀態指標，可以直觀高效的甄別食用油的質量優劣； 此外，本發明檢測方法對實驗條件要求低，不需要特殊的高精分析儀器和檢測設備，實驗操作方便，成本低廉，易于培訓和掌握。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式是一種利用秀麗隱桿線蟲休眠作為生物標志物甄別地溝油的方法，具體是按以下步驟完成一、制備培養基采用NaCl、瓊脂粉、蛋白胨、O. 8mol/L I. 2mol/L的CaCl2水溶液、O. 8mol/L I. 2mol/L的MgSO4水溶液、磷酸鹽緩沖液和蒸餾水混合均勻得到培養液， 密封后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，并在120°C下滅菌處理15min 25min,然后降溫至50°C 60°C，并在無菌環境下加入待檢測食用油，再轉移至培養皿中，最后在溫度為20°C的無菌環境下干燥8h 12h，即得到培養基；二、培養向步驟一制備的培養基中均勻涂入濃度為 1\109個/1^ 2\109個/1^大腸桿菌0卩50菌液，然后37°C培養8h 12h，再將接入秀麗隱桿線蟲幼蟲進行培養46h，在培養24h時秀麗隱桿線蟲幼蟲發育為秀麗隱桿線蟲成蟲并產卵；繼續培養12h時產卵發育成第二代秀I 隱桿線蟲幼蟲；再繼續培養IOh,若第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲進入休眠狀態，則待檢測食用油不是地溝油；若第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲不進入休眠狀態，與正常培養基生長的秀麗隱桿線蟲子代無明顯差別，則待檢測食用油是地溝油。本實施方式步驟一中所述的培養液中NaCl的濃度為2X 10_3g/mL 3X 10_3g/mL， 瓊脂粉的濃度為15X 10_3g/mL 20X 10_3g/mL，蛋白胨的濃度為2X 10_3g/mL 3X 10_3g/ mL, CaCl2 的濃度為 O. 8X 10 6g/mL IX 10 6g/mL, MgSO4 的濃度為 O. 8X 10 6g/mL I X l(T6g/mL ;本實施方式步驟一中所述的培養液中加入的磷酸鹽緩沖液占培養液總體積的 20%。 25%。；步驟一中所述加入的待檢測食用油與培養液的體積比為(I 10) 1000。本實施方式步驟二中所述濃度為I X IO9個/mL 2X IO9個/mL大腸桿菌0P50菌液的涂入量為2mL/cm2 3mL/cm2 ;本實施方式步驟二中所述的秀麗隱桿線蟲幼蟲的接種量為5只/ cm2 10只/ cm2。地溝油中含有膽固醇及其膽固醇衍生物，而植物油中沒用這類具有動物油屬性的成分；即使地溝油經過數級精煉，膽固醇及其膽固醇衍生物也會痕量存在。膽固醇是秀麗隱桿線蟲繁殖與發育的必需營養，是秀麗隱桿線蟲培養基中不可或缺的成分。在不添加膽固醇的培養基中生長的秀麗隱桿線蟲，其繁衍的第二代幼蟲發育停滯進入休眠狀態。而在培養基中添加極微量的膽固醇便，秀麗隱桿線蟲繁殖的后代可正常生長發育。本實施方式檢測方法與傳統的利用分析儀器鑒定地溝油的方法相比，彌補了常規膽固醇檢測方法5mg/g檢出限較高的不足，對特異成分痕量低的高精煉地溝油可以有效鑒定；利用秀麗隱桿線蟲休眠狀態指標，可以直觀高效的甄別食用油的質量優劣；此外，本實施方式檢測方法對實驗條件要求低，不需要特殊的高精分析儀器和檢測設備，實驗操作方便，成本低廉，易于培訓和掌握。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同點的是步驟一中所述的磷酸鹽緩沖液是由KH2P04、KOH和蒸餾水配置而成，磷酸鹽緩沖液中KH2PO4的濃度為
I.36 X 10 VmL, KOH的濃度為O. 18 X 10_3g/mL，且磷酸鹽緩沖液的pH值為6. O。其它與具體實施方式
一相同。采用下述試驗驗證本發明效果試驗一一、制備培養基采用NaCl、瓊脂粉、蛋白胨、lmol/L的CaCl2水溶液、 lmol/L的MgSO4水溶液、磷酸鹽緩沖液和蒸餾水混合均勻得到培養液，密封后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，并在120°C下滅菌處理20min，然后降溫至55°C，并在無菌環境下加入待檢測食用油，再轉移至培養皿中，最后在溫度為20°C的無菌環境下干燥10h，即得到培養基；二、培養向步驟一制備的培養基中均勻涂入濃度為I. O X IO9個/mL大大腸桿菌0P50菌液，然后 37°C培養10h，再將接入秀麗隱桿線蟲幼蟲進行培養46h，在培養24h時秀麗隱桿線蟲幼蟲發育為秀麗隱桿線蟲成蟲并產卵，繼續培養12h時產卵發育成第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲， 再繼續培養IOh。本試驗步驟一中所述的培養液中NaCl的濃度為3X10_3g/mL，瓊脂粉的濃度為 17X 10_3g/mL，蛋白胨的濃度為2. 5 X 10 VmL, CaCl2的濃度為I X W6gMU MgSO4的濃度為IX l(T6g/mL ;本試驗步驟一中所述的培養液中加入的磷酸鹽緩沖液占培養液總體積的 25%。；本試驗步驟一中所述加入的待檢測食用油與培養液的體積比為5 1000，且所述的待檢測食用油為植物油。本試驗步驟一中所述的磷酸鹽緩沖液是由KH2P04、KOH和蒸餾水配置而成，磷酸鹽緩沖液中KH2PO4的濃度為I. 36 X 10 VmL, KOH的濃度為O. 18 X 10_3g/mL，且磷酸鹽緩沖液的pH值為6.0。本試驗步驟二中所述濃度為I. OX IO9個/mL大腸桿菌0P50菌液的涂入量為2mL/ cm2 ;本試驗步驟二中所述的秀麗隱桿線蟲幼蟲的接種量為10只/cm2。本試驗步驟二中再繼續培養IOh后第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲進入休眠狀態，表現為行為顯著減緩甚至靜止，不攝食，體型瘦長，體色增黑，表皮增厚，因為植物油中不含有秀麗隱桿線蟲生長需要的膽固醇，因此第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲進入休眠狀態。試驗二 一、制備培養基采用NaCl、瓊脂粉、蛋白胨、lmol/L的CaCl2水溶液、 lmol/L的MgSO4水溶液、磷酸鹽緩沖液和蒸餾水混合均勻得到培養液，密封后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，并在120°C下滅菌處理20min，然后降溫至55°C，并在無菌環境下加入待檢測食用油，再轉移至培養皿中，最后在溫度為20°C的無菌環境下干燥10h，即得到培養基；二、培養向步驟一制備的培養基中均勻涂入濃度為I. O X IO9個/mL大大腸桿菌0P50菌液，然后 37°C培養10h，再將接入秀麗隱桿線蟲幼蟲進行培養46h，在培養24h時秀麗隱桿線蟲幼蟲發育為秀麗隱桿線蟲成蟲并產卵，繼續培養12h時產卵發育成第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲， 再繼續培養IOh。本試驗步驟一中所述的培養液中NaCl的濃度為3X10_3g/mL，瓊脂粉的濃度為 17X 10_3g/mL，蛋白胨的濃度為2. 5 X 10 VmL, CaCl2的濃度為I X W6gMU MgSO4的濃度為IX l(T6g/mL ;本試驗步驟一中所述的培養液中加入的磷酸鹽緩沖液占培養液總體積的 25%。；本試驗步驟一中所述加入的待檢測食用油與培養液的體積比為5 1000，且所述的待檢測食用油為動物油。本試驗步驟一中所述的磷酸鹽緩沖液是由KH2P04、KOH和蒸餾水配置而成，磷酸鹽緩沖液中KH2PO4的濃度為I. 36 X 10 VmL, KOH的濃度為O. 18 X 10_3g/mL，且磷酸鹽緩沖液的pH值為6.0。本試驗步驟二中所述濃度為I. OX IO9個/mL大腸桿菌0P50菌液的涂入量為2mL/ cm2 ;本試驗步驟二中所述的秀麗隱桿線蟲幼蟲的接種量為10只/cm2。本試驗步驟二中再繼續培養IOh后第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲不進入休眠狀態，與正常培養基生長的秀麗隱桿線蟲子代無明顯差別，因為動物油中含有秀麗隱桿線蟲生長需要的膽固醇，因此第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲不進入休眠狀態，與正常培養基生長的秀麗隱桿線蟲子代無明顯差別。試驗三一、制備培養基采用NaCl、瓊脂粉、蛋白胨、lmol/L的CaCl2水溶液、 lmol/L的MgSO4水溶液、磷酸鹽緩沖液和蒸餾水混合均勻得到培養液，密封后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，并在120°C下滅菌處理20min，然后降溫至55°C，并在無菌環境下加入待檢測食用油，再轉移至培養皿中，最后在溫度為20°C的無菌環境下干燥10h，即得到培養基；二、培養向步驟一制備的培養基中均勻涂入濃度為I. O X IO9個/mL大大腸桿菌0P50菌液，然后 37°C培養10h，再將接入秀麗隱桿線蟲幼蟲進行培養46h，在培養24h時秀麗隱桿線蟲幼蟲發育為秀麗隱桿線蟲成蟲并產卵，繼續培養12h時產卵發育成第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲， 再繼續培養IOh。本試驗步驟一中所述的培養液中NaCl的濃度為3X 10_3g/mL，瓊脂粉的濃度為 17X 10_3g/mL，蛋白胨的濃度為2. 5 X 10 VmL, CaCl2的濃度為I X W6gMU MgSO4的濃度為IX l(T6g/mL ;本試驗步驟一中所述的培養液中加入的磷酸鹽緩沖液占培養液總體積的 25%。；本試驗步驟一中所述加入的待檢測食用油與培養液的體積比為5 1000，且所述的待檢測食用油為地溝油。本試驗步驟一中所述的磷酸鹽緩沖液是由KH2P04、KOH和蒸餾水配置而成，磷酸鹽緩沖液中KH2PO4的濃度為I. 36 X 10 VmL, KOH的濃度為O. 18 X 10_3g/mL，且磷酸鹽緩沖液的pH值為6.0。本試驗步驟二中所述濃度為I. OX IO9個/mL大腸桿菌0P50菌液的涂入量為2mL/ cm2 ;本試驗步驟二中所述的秀麗隱桿線蟲幼蟲的接種量為10只/cm2。本試驗步驟二中再繼續培養IOh后第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲不進入休眠狀態，與正常培養基生長的秀麗隱桿線蟲子代無明顯差別，因為地溝油中含有秀麗隱桿線蟲生長需要的膽固醇及其膽固醇衍生物，因此第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲不進入休眠狀態，與正常培養基生長的秀麗隱桿線蟲子代無明顯差別。
權利要求
1.利用秀麗隱桿線蟲休眠作為生物標志物甄別地溝油的方法，其特征在于利用秀麗隱桿線蟲休眠作為生物標志物甄別地溝油的方法是按以下步驟完成一、制備培養基采用NaCl、瓊脂粉、蛋白胨、O. 8mol/L I. 2mol/L的CaCl2水溶液、O.8mol/L I. 2mol/L的MgSO4水溶液、磷酸鹽緩沖液和蒸餾水混合均勻得到培養液，密封后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，并在120°C下滅菌處理15min 25min,然后降溫至50°C 60°C，并在無菌環境下加入待檢測食用油，再轉移至培養皿中，最后在溫度為20°C的無菌環境下干燥8h 12h，即得到培養基；二、培養向步驟一制備的培養基中均勻涂入濃度為 I X IO9個/mL 2 X IO9個/mL大腸桿菌0P50菌液，然后37°C培養8h 12h，再將接入秀麗隱桿線蟲幼蟲進行培養46h，在培養24h時秀麗隱桿線蟲幼蟲發育為秀麗隱桿線蟲成蟲并產卵；繼續培養12h時產卵發育成第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲；再繼續培養10h，若第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲進入休眠狀態，則待檢測食用油不是地溝油；若第二代秀麗隱桿線蟲幼蟲不進入休眠狀態，與正常培養基生長的秀麗隱桿線蟲子代無明顯差別，則待檢測食用油是地溝油；步驟一中所述的培養液中NaCl的濃度為2X 10_3g/mL 3 X 10_3g/mL，瓊脂粉的濃度為 15X lCT3g/mL 20X lCT3g/mL,蛋白胨的濃度為 2X lCT3g/mL 3X lCT3g/mL, CaCl2 的濃度為 O. 8 X 10 6g/mL I X 10 6g/mL, MgSO4 的濃度為 O. 8 X 10_6g/mL I X 10 6g/mL ;步驟一中所述的培養液中加入的磷酸鹽緩沖液占培養液總體積的20%。 25%。;步驟一中所述加入的待檢測食用油與培養液的體積比為(I 10) 1000;步驟二中所述濃度為I X IO9個 /mL 2X IO9個/mL大腸桿菌0P50菌液的涂入量為2mL/cm2 3mL/cm2 ;步驟二中所述的秀麗隱桿線蟲幼蟲的接種量為5只/cm2 10只/cm2。
2.根據權利要I所述的利用秀麗隱桿線蟲休眠作為生物標志物甄別地溝油的方法，其特征在于步驟一中所述的磷酸鹽緩沖液是由KH2P04、KOH和蒸餾水配置而成，磷酸鹽緩沖液中KH2PO4的濃度為I. 36 X 10 VmL, KOH的濃度為O. 18 X 10 VmL,且磷酸鹽緩沖液的pH值為 6. O。
全文摘要
利用秀麗隱桿線蟲休眠作為生物標志物甄別地溝油的方法，它涉及一種地溝油甄別方法。本發明目的要解決現有地溝油鑒定方法存在靈敏度低、精確度差、操作復雜、成本高的問題。方法，一、采用NaCl、瓊脂粉、蛋白胨、CaCl2水溶液、MgSO4水溶液、磷酸鹽緩沖液和蒸餾水混合均勻得到培養液，然后滅菌處理，最用經干燥處理即得到培養基；二、先向步驟一制備的培養基中涂入大腸桿菌OP50菌液，并培養一定時間，再將接入秀麗隱桿線蟲幼蟲進行培養46h。優點一、實現對特異成分痕量低的高精煉地溝油可以有效鑒定；二、操作方便，成本低廉，易于培訓和掌握。本發明主要用于甄別地溝油。
文檔編號C12Q1/02GK102586387SQ201210051560
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者唐占輝, 張雁慧, 王云彪 申請人:中國科學院東北地理與農業生態研究所