專利名稱：不結球白菜晚抽薹基因的分子標記方法
技術領域：
本發明涉及不結球白菜晚抽薹基因的分子標記方法，屬于分子生物學領域，涉 及不結球白菜晚抽薹系的分子育種，專用于不結球白菜晚抽薹基因品種的篩選和鑒 定。二、 技術背景不結球白菜(ca附戸^l5.ssp. c/z/"卿/s. Makino)又名小白菜、青菜、油菜,是我國長江中下游及其以南地區的一種四季栽培的蔬菜,近年來在我國北方也有較大 面積的引種栽培和推廣。但由于抽薹早，其產量和質量都有明顯的下降,因此,晚抽薹 成為不結球白菜的重要育種目標。Hidetoshi等利用分離組群法BSA(bulked segregant analysis)對散葉大白菜的抽薹 性狀進行QTL鑒定和定位,發現了 1個與控制抽薹性狀緊密連鎖的RAPD標記一 RA1255(530bp),并將該基因定位于BN007-1上。SSR標記是以SSR多態性為基礎的遺傳標記，已廣泛應用于遺傳圖譜構建、品 種指紋圖譜繪制、品種純度檢測及目標性狀分子標記篩選等領域。本發明采用BSA 方法和SSR技術，篩選與不結球白菜晚抽薹基因緊密連鎖的標記，以實現不結球白 菜晚抽薹性狀的標記輔助育種，加速我國不結球白菜晚抽薹性品種的選育進程。三、 發明內容技術問題本發明的目的是篩選出一個或幾個與不結球白菜晚抽薹基因緊密 連鎖的分子標記，這些分子標記用于不結球白菜輔助選擇育種和品種鑒定，可大大 提高不結球白菜晚抽薹系的選擇鑒定效率。技術方案本發明的實施方案如下不結球白菜晚抽薹基因的分子標記方法，其特征在于 用標記引物DBC16,DBC16+: 5，一AAAGTCGTGGGAAGTATCGT—3'， DBC16—: 5，一 AGGTGTAAGGATGGTGGTAGT—3'
擴增不結球白菜晚抽薹系或育種材料DNA，如果能夠擴增出252bp的晚抽薹 LB片段，則標志著不結球白菜晚抽薹基因的存在。有益效果本發明選用的是不結球白菜晚抽薹系和早抽薹系為材料開展不結球白菜晚抽薹分子標記的篩選。與目前技術相比，其優點是-(1) 標記穩定。本研究采用標記穩定的SSR，其標記帶型簡單，記錄的條帶一 致，還具有實驗程序簡單等優點。(2) 輔助選擇方便，節約成本。不結球白菜晚抽薹系的常規選育方法周期長， 成本高，費時又費力。通過本發明篩選出的與不結球白菜晚抽薹基因緊密連鎖的分 子標記用于輔助選擇，可以實現苗期選擇，減少工作量，大大提高不結球白菜晚抽 薹系的選擇效率，從而加快育種進程。(3) 本發明提供的分子標記，生產上可用于對不結球白菜晚抽薹品種的純度鑒定。四
圖l父母本及F卜F2代DNA的提取泳道1~3分別為P卜P2、 F!，泳道4~6為F2單株。圖2親本間的多態性篩選M為分子量marker, A為引物DBC1， B為引物DBC12， C為引物DBC18,— 代表親本間的差異條帶。圖3特異引物的擴增結果M為分子量marker, A為母本，B為父本，C為F^戈。 圖4連鎖標記對F2代單株的擴增結果M為分子量marker, 1~18為晚抽薹單株，19~36為早抽薹單株，一代表特異帶。五具體實施方式
利用SSR等分子標記技術尋找與晚抽薹基因連鎖的標記，為定位及克隆這些 基因提供了極其有用的工具，并為分子標記輔助育種打下良好的基礎。分子標記輔 助選擇不受環境條件的限制，可實現苗期選擇，減少工作量，加快育種進程。目前 國內外在不結球白菜晚抽薹基因分子標記方面研究較少。本發明的實施程序是
(一) 材料與方法不結球白菜晚抽薹系Y5，即上海四月慢和早抽薹系P120， 即南京矮腳黃，(見參考文獻曹壽椿，李式軍.白菜地方品種的初歩研究II.主要生 物學特性的研究.南京農學院學報，1981， (1): 1~11)，這兩個自交系來自南京農業大學白菜課題組。晚抽薹系、早抽薹系和雜交Fi代及自交F2代148株進行田間抽薹期調査、分子標記的篩選及連鎖分析。(二) 分子標記分析主要利用SSR標記。采用CTAB法(見參考文獻M.G.Murray，W.F.Thompson.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.Nucleic Acids Research, 1980,8(19):4321~4325)，提取(提 取方法見參考文獻史公軍，侯喜林.不結球白菜RAPD反應體系的優化.江西農業大 學學報，2004, 26(1): 1 5)不結球白菜晚抽薹系Y5和早抽薹系P120及F!、 F2的單株 DNA (見圖1)。首先用182對特異引物(引物序列105對來源崔秀敏,侯喜林,董玉秀.ISSR-PCR和 鏈親和素磁珠吸附法開發白菜SSR引物.園藝學報，2006,33 (1):155 157;引物54對來 源Suwabe K, Tsukazaki H,Iketani H et a/.Identification of two loci for resistance to clubroot (尸/asm0(i/0/7/wra 6row/cae W^rom'w) in rqpa L,2003,107:997~1002等，由上海英駿生物技術有限公司合成)對不結球白菜晚抽薹系和早抽薹系的DNA 多態性進行初歩分析。在PTC-10()tm擴增儀上進行PCR擴增，PCR反應體系為10uL， 其中10XPCR buffer 1.0 u L,引物(IOO ng/u L) 1.0 u L, dNTP(2.5 mmol/L) 0.8 y L, Mg2+(25mmol/L) 0.8 p L， DNA(60 ng) 0.5 " L， Taq酶(2.5 U/ u L) 0.1 u L,ddH20 5.8 u L。 PCR反應程序為:95°C 2min;94。C 40S，57。C 45 S, 72°C lmin; 32個循環；72°C 延長7min。 PCR產物在8。/。的的變性聚丙烯酰胺凝膠200V電壓電泳2h左右。電泳后， 用含10%乙醇、0.5。/。乙酸200ml的ddH2O固定12-20min;然后用ddH20洗一次，放入 200ml0.2%AgNO3中銀染12-20min;用ddH20洗兩次，倒入200ml( 1.5%NaOH+0.4%甲 醛+1 %NaS203)ddH20中顯色10- 12min,顯色后可進行拍照，篩選出在不結球白菜晚抽 薹基因系和早抽薹系間的多態性片段(見圖2)。(三) 結果與分析分子標記篩選結果表明，1個SSR標記與不結球白菜晚抽薹基因緊密連鎖，擴 增出(252bp)的片段晚抽薹LB (見圖3)。 該標記引物為DBC16 DBC16+: 5 ，一AAAGTCGTGGGAAGTATCGT—3', DBC16— 5,— AGGTGTAAGGATGGTGGTAGT—3'即用引物DBC16擴增不結球白菜晚抽薹系或育種材料DNA，如果能夠擴增出 (252bp)的片段晚抽薹LB，則標志著不結球白菜晚抽薹基因的存在。通過對不結 球白菜晚抽薹系、早抽薹系雜交和自交得到的F2代148個單株田間調査結果和分子 標記圖譜數據進行連鎖分析(分析軟件MAPMAKER (Version 3.0))，發現所篩選到的 標記與不結球白菜晚抽薹基因緊密連鎖(見圖4)，連鎖距離為5.7cM。篩選到的不 結球白菜晚抽薹基因緊密連鎖的分子標記用于輔助選擇，可有效開展不結球白菜晚 抽薹系的選育，大大提高選擇效率，從而加快育種進程，生產上可用于對不結球白 菜晚抽薹品種的純度鑒定。
權利要求
1、不結球白菜晚抽薹基因的分子標記方法，其特征在于用標記引物DBC16DBC16+5’-AAAGTCGTGGGAAGTATCGT-3’，DBC16-5’-AGGTGTAAGGATGGTGGTAGT-3’擴增不結球白菜晚抽薹系或育種材料DNA，如果能夠擴出252bp的晚抽薹LB片段，則標志著不結球白菜晚抽薹基因的存在。
全文摘要
本發明涉及不結球白菜晚抽薹基因的分子標記方法，屬于分子生物學領域。用標記引物DBC16擴增不結球白菜晚抽薹系或育種材料DNA，如果能夠擴出252bp的晚抽薹LB片段，則標志著不結球白菜晚抽薹基因的存在。則標志著不結球白菜晚抽薹基因的存在。本發明對不結球白菜晚抽薹系Y5及早抽薹系P120進行SSR分子標記的篩選，獲得不結球白菜晚抽薹基因的一個標記晚抽薹LB。通過本發明提供的分子標記，可有效開展不結球白菜晚抽薹品種的選育，大大提高選擇效率，從而加快育種進程，生產上可用于對不結球白菜晚抽薹品種的純度鑒定。
文檔編號C12N15/11GK101117645SQ20071002485
公開日2008年2月6日 申請日期2007年7月5日 優先權日2007年7月5日
發明者侯喜林, 史公軍, 波 張, 王建軍 申請人:南京農業大學