甘藍型油菜全基因組scar分子標記及制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種甘藍型油菜全基因組SCAR分子標記及制備方法和應用，人工創造的甘藍型油菜全基因組的SCAR標記110個，其步驟：（1）在白菜基因組序列數據庫和甘藍基因組序列數據庫，每間隔一段長度挑選序列；（2）搜索與所得序列同源性最高的甘藍型油菜序列；（3）比較與所得Tapidor和Ningyou7同源序列的差異；根據差異序列設計PCR擴增引物；（4）利用所得PCR引物，擴增Tapidor和Ningyou7基因組DNA，產生SCAR分子標記；（5）篩選得到在油菜品種穩定擴增的陽性標記PS3+21和RAC1-P3+4，作為SCAR標記檢測體系的陽性對照；（6）利用所得SCAR分子標記鑒別冬油菜品種。本發明極大地節約人力物力、縮短鑒定周期、提高新品種鑒定效率，提供了一種方便快速鑒定甘藍型油菜不同品種的方法。
【專利說明】甘藍型油菜全基因組SCAR分子標記及制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于油菜育種【技術領域】，具體涉及一種甘藍型油菜全基因組SCAR分子標 記，同時還涉及一種甘藍型油菜全基因組SCAR分子標記的制備方法，還涉及一種甘藍型油 菜全基因組SCAR分子標記在甘藍型油菜品種鑒定中的應用。
【背景技術】
[0002] 糧食安全是我國國民經濟的基礎和人民生活的重要保障，種子是糧食生產的最核 心要素。我國消費的植物油60%以上依靠進口，自給率不足40% ;國產植物油約60%的原料 來自于油菜籽。雜交種的選育和推廣促進了我國油菜品種產量的大幅度提高，品種更新換 代速度加快。開發鑒別品種和鑒定雜種純度的技術體系用于種子質量管理非常必要和緊 迫。
[0003] 現有的油菜品種鑒定和雜種純度檢測方法主要包括傳統的形態學方法和分子檢 測方法。形態學方法依據的是油菜全生育期的表型性狀如葉型、葉色、株高、株型、生長勢、 花期、產量性狀、品質性狀等，目標性狀有限、且易受外界環境影響(劉華等，1997)。另外，形 態學鑒定方法需要田間種植、并在油菜全生育期多次進行觀察，非常費時費力。分子檢測方 法是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎、在分子水平檢測生物間的差異。分子檢 測方法能對各個發育時期的個體、各個組織甚至細胞做檢測，標記數量多、不受環境影響。
[0004] 自 1980 年第一個分子標記技術 一RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism,限制性片段長度多態性，）產生以來，已經出現的分子標記技術有幾十種，它 們的原理為DNA分子雜交、DNA分子擴增，以及DNA分子雜交結合分子擴增。每一種分子標 記技術在檢測的基因序列、多態性水平、位點的特異性、重復性、技術要求以及檢測成本等 方面各有差異和優缺點。我國自2003年啟動甘藍型油菜品種DNA指紋檢測以來，相繼經歷 了 AFLP (Amplified Fragment Length Polymophism，擴增片段長度多態性）、SSR (Simple Seque nce Repeats，簡單重復序列）和 ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats，簡單重復 間隔序列）三種標記技術，其中SSR標記技術由于重復性好而得到重視。盡管如此，SSR標 記技術檢測油菜品種DNA指紋存在兩大不足：（1)年份、品種、不同操作者所得數據不能整 合；（2)分子擴增的品種DNA指紋需要利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術進行檢測，操作程序復 雜、花費時間長、對操作者技術水平要求高。
[0005] SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions，序列特征性擴增區域)，是 1993年Paran (Sartorato et al.，2000)提出的分子標記，基本原理是將特異擴增產物進行 回收測序，根據測序結果重新設計特異引物，對基因組DNA進行特異PCR擴增(趙軍勝等， 2012)。SCAR技術只擴增特定DNA區域，結果僅僅是標記"t'或'無'，判別容易，可用瓊脂 糖凝膠電泳技術進行檢測，操作簡單，不需要DNA測序儀等精密儀器。SCAR技術可以克服 SSR技術的缺點，但是開發SCAR標記的前提是已知差異擴增片段及其序列，由于特異擴增 產物回收測序成本高，因而SCAR標記的數量受到限制，規模化開發SCAR標記的報道尚無。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的之一在于提供了一種甘藍型油菜全基因組SCAR分子標記，該標記 具有可用瓊脂糖凝膠電泳技術進行檢測、操作簡單，擴增結果為"有"或"無"、判別容易、便 于統計等優點，適用對象廣泛。
[0007] 本發明的目的之二在于提供了一種甘藍型油菜全基因組SCAR分子標記的制備 方法。該方法利用了白菜和甘藍、以及甘藍型油菜的基因組序列信息，具有覆蓋油菜全基 因組、數量多、成本低等優點，另外利用在任何油菜品種均能有擴增產物的標記作為陽性對 照，保證了 SCAR分子標記結果正確。
[0008] 本發明的目的之三在于提供了一種甘藍型油菜全基因組SCAR分子標記在甘藍型 油菜品種鑒定和雜種種子純度檢測中的用途，具有操作程序簡單、周期短等技術優勢，不同 年份、不同品種、不同操作者所得數據均能整合，因而，可以構建歷年和當前油菜品種的DNA 指紋數據庫，并利用指紋庫信息進行雜種種子純度檢測。
[0009] 本發明通過以下技術方案實現：
[0010] 申請人:通過序列查詢、比對和引物設計，篩選到分布甘藍型油菜全基因組的SCAR 標記110個；得到兩個陽性標記？53+21和狀(：1-?3+4以確保檢測結果正確；檢測2011-2012 年國家區域試驗冬油菜品種（172份)以驗證可用于SCAR分子標記鑒定油菜品種；創建SCAR 標記技術體系應用于品種鑒定和雜種純度檢測的方法。
[0011] 一種甘藍型油菜全基因組SCAR分子標記的制備方法，其步驟如下：
[0012] (1)在白菜基因組序列數據庫（http://brassicadb. org/brad/)和甘藍基因組序 列數據庫（http://122. 205. 95. 67/blast/blast. php)，每間隔 IOOkb 挑選一段 IOkb 長度的 序列。
[0013] (2)搜索與步驟1)所得序列同源性最高的甘藍型油菜Tapidor序列和Ningyou7 序列。
[0014] (3)比較與步驟2)所得Tapidor和Ningyou7同源序列的差異；根據差異序列設 計P CR擴增引物。
[0015] (4)利用步驟3)所得PCR引物，擴增Tapidor和Ningyou7基因組DNA ;篩選能產 生清晰、穩定、在Tapidor和Ningyou7中有差異擴增帶的引物110對，產生110個SCAR分 子標記。引物序列和標記的詳細信息列于表1。
[0016] 表1本發明篩選的特異引物
[0017]
【權利要求】
1. 一種甘藍型油菜全基因組SCAR分子標記，其特征在于：人工創造的甘藍型油菜全基 因組的SCAR標記110個：
2.權利要求1所述的一種甘藍型油菜全基因組SCAR分子標記的制備方法，其步驟是： (1) 在白菜基因組序列數據庫和甘藍基因組序列數據庫，每間隔l〇〇kb挑選一段10kb 長度的序列； (2) 搜索與步驟1)所得序列同源性最高的甘藍型油菜Tapidor序列和Ningyou7序列； (3) 比較與步驟2)所得Tapidor和Ningy〇u7同源序列的差異；根據差異序列設計PCR 擴增引物； (4) 利用步驟3)所得PCR引物，擴增Tapidor和Ningyou7基因組DNA ;篩選能產生清 晰、穩定、在Tapidor和Ningyou7中有差異擴增帶的引物110對，產生110個SCAR分子標 記； (5) 篩選得到在油菜品種穩定擴增的陽性標記PS3+21和RAC1-P3+4,長度分別為 1300bp和200bp，作為SCAR標記檢測體系的陽性對照： 陽性SCAR標記PS3+21 : 正向引物 5' -ATGAAAGGGGTACAGAACAT-3'， 反向引物 5' -CTCAAGTCCCACTGCTGCGG-3' ； 陽性 SCAR 標記 RAC1-P3+4 : 正向引物 5' -CTATCCTCCGTCTCGATCTCGC-3'， 反向引物 5' -CTTAGCCGTCTCCAGCTCTTGC-3' ； (6) 利用步驟4)所得SCAR分子標記鑒別冬油菜品種。
3. 權利要求1所述的一種甘藍型油菜全基因組SCAR分子標記在甘藍型油菜品種鑒定 中的應用。
4. 權利要求1所述的一種甘藍型油菜全基因組SCAR分子標記在甘藍型油菜雜種種子 純度檢測中的應用。
【文檔編號】C12N15/10GK104278025SQ201310288826
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月10日 優先權日:2013年7月10日
【發明者】馬朝芝, 張彤, 高長斌, 孫紅偉, 王津津 申請人:華中農業大學