專利名稱：用磁穩定流化床培養貼壁依賴性動物細胞生產病毒的方法
技術領域：
本發明屬于動物細胞培養技術，特別是涉及一種用磁穩定流化床培養貼壁依賴性動物細胞生產病毒的方法。
動物細胞大規模培養在現代生物技術及醫藥產業中具有越來越重要的意義，已用于生產乙肝、乙腦、狂犬等病毒進而制備疫苗。
磁穩定流化床(Magnetically stabilized fluidized bed)是給普通流化床加上磁場，流化床中的顆粒也有磁性。顆粒在磁場中形成鏈，液體通過流化床時顆粒層均勻膨脹，液體呈活塞流動。磁穩定流化床既有普通流化床的壓降和流化特性，又有填充床的液體流動和固液接觸特性。此外，通過調節磁場強度，可以調節磁穩定流化床的液體流速上限，因而磁穩定流化床操作范圍寬、適應面廣。磁穩定流化床中固體顆粒相對靜止，消除了顆粒間的碰撞和摩擦，同時磁穩定流化床中的顆粒密度可達40％(體積分率)以上，僅略低于填充床，比用于動物細胞培養的氣升式反應器高1-2個數量級。因此，如果將微載體做成磁性顆粒，用磁穩定流化床培養動物細胞，有望將細胞密度提高1-2個數量級，從而提高反應器生產病毒的能力。
磁穩定流化床由于具有獨特的優點，已在生化工程中得到了多方面的應用。在固定化生物反應器方面，正如文獻《生物技術與生物工程》(Biotech.Bioeng.1981,23,2561-2567)一文所述的將脲酶與四氧化三鐵顆粒共包埋于聚甲基丙烯酸甲酯中，在外加磁場作用下，液體流速達24厘米/分鐘而顆粒層仍保持穩定，同期轉化率可與填充床相比。文獻《化工學報》1988(1),120-126所述的以含磁粉的聚甲基丙烯酸甲酯為載體，包埋熱帶假絲酵母，在恒定磁場中用于含酚廢水的處理，提高了反應速度，使單位體積反應器的降解量明顯增加。文獻《生物技術進展》(Biotech.Prog.,1990,6,452-457)所述的將磁穩定流化床應用于固定化植物細胞的培養，將細胞與磁粉共包埋制成磁性顆粒，生產次生代謝物，以培養基為流化基質，培養基循環充氧，消除了因顆粒碰撞造成的損失。而對用磁穩定流化床培養動物細胞生產病毒至今未見報道。
本發明的目的在于克服運用微載體培養動物細胞生產病毒時，微載體顆粒在反應器中的互相碰撞，提高微載體的裝填密度，減少細胞的損傷，提高動物細胞培養的密度進而提高反應器生產病毒的效率，提供一種用磁穩定流化床培養貼壁依賴性動物細胞生產病毒的方法。
本發明的目的是這樣實現的在普通的液固流化床中加上縱向磁場，流化床內裝有磁敏性微載體。細胞培養基或病毒培養基從下端進入流化床，從上端離開；離開的培養基可以經過充氧后全部返回入口，實現批式培養；也可以部分返回或不返回，以實現灌注培養。磁場用Helmholtz線圈實現，線圈內通直流電。磁場方向包括向上和向下，磁場可以是均勻磁場，也可以是有梯度的自上而下增強的磁場。床體下端有濾網，以防止顆粒泄露；濾網下有支撐板；支撐板下有液體分布板，使液體均勻分布；床體下端為錐形底，以消除流化床的死角，該錐角為40°-120°；濾網、分布板和支撐板的材質以能蒸汽滅菌且不污染培養液為準，如陶瓷或不銹鋼。床體上端面有接種口。床體上端有顆粒入口，用以加入磁敏性微載體顆粒。床體上端面或側壁有開孔，用來安裝傳感器(如測定溫度、溶液酸堿度的pH值范圍、溶解氧范圍)。床體上下端有滅菌蒸汽的出入口。
本發明所用磁穩定流化床培養貼壁依賴性動物細胞生產病毒的方法如下(1)在磁場關閉的狀態下，清洗磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統內的所有容器、管路；在啟動磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的控制裝置之前設定細胞培養所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍及反應溫度。
(2)將磁敏性微載體預處理后由微載體加入口加入到磁穩定流化床中，然后由滅菌蒸汽入口向系統內通入蒸汽滅菌，或在通入蒸汽前加入緩沖液至浸沒磁敏性微載體再通入蒸汽滅菌；所述的緩沖液為磷酸緩沖液。或將磁敏性微載體單獨滅菌后在無菌環境下加入到已經滅菌的磁穩定流化床中；其中磁敏性微載體的加入量按視體積計為磁穩定流化床工作體積的10％～95％，磁敏性微載體的矯頑力低于200安培/米，粒徑為50μm～2mm，濕比重為1.1～2.5g/cm3，磁穩定流化床的液體表觀流速為5厘米/分鐘～25厘米/分鐘，磁場強度為3～100mT；滅菌時遵循一定的次序，保證所有容器、管路、元件及微載體都充分滅菌。
(3)冷卻后將磁穩定流化床內的液體由排水口排出；經過微孔濾膜由磁穩定流化床培養基入口向磁穩定流化床內注入細胞培養基至浸沒磁敏性微載體但不超過磁穩定流化床的工作體積的95％，浸泡磁敏性微載體適當時間。
(4)由磁穩定流化床的接種口加入已制備好的細胞種子液。
(5)經過氣體過濾裝置由磁穩定流化床的滅菌蒸汽入口通入能使磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣，持續5秒鐘以上，使磁敏性微載體顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣，20-30分鐘后關閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣；以后每隔20-30分鐘重復關閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣的過程，直至細胞在磁敏性微載體上貼壁完全；其中的通氣是指前述的經過氣體過濾裝置通入能使磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣并持續5秒鐘以上；經過微孔濾膜補足細胞培養基使之充滿充氧裝置和管路。
(6)啟動磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的控制裝置和充氧裝置，讓細胞培養基循環，進行細胞培養過程；根據實際操作的需要，經過微孔濾膜連續或分批補充新鮮細胞培養基，定時取樣分析，直至達到所需的細胞密度或預定的培養時間；關閉磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的控制裝置和充氧裝置，停止細胞培養基的循環；在細胞培養過程中，每隔2-12小時將磁場關閉一下，再重新開啟。
(7)將磁穩定流化床培養系統中的細胞培養基排出，經過微孔濾膜由培養基入口加入洗滌液至充滿培養系統，用洗滌液浸泡培養系統或使洗滌液在培養系統中循環一定時間，對磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統進行洗滌，然后排出洗滌液；根據培養過程的需要決定洗滌液的配方和洗滌次數1-5次或更多次；設定病毒培養過程所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍、反應溫度；經過微孔濾膜加入病毒培養基至浸沒貼有細胞的磁敏性微載體但不超過磁穩定流化床的工作體積的95％；啟動磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的溫度控制裝置，接入種毒；關閉磁場，經過氣體過濾裝置由磁穩定流化床的滅菌蒸汽入口通入能使貼有細胞的磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣，持續5秒鐘以上，使貼有細胞的磁敏性微載體顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣，20-30分鐘后關閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣；以后每隔20-30分鐘重復關閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣的過程，直至病毒在細胞上吸附完全；其中的通氣是指前述的經過氣體過濾裝置通入能使貼有細胞的磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣并持續5秒鐘以上；經過微孔濾膜補足病毒培養基使之充滿充氧裝置和管路；啟動磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的溶解氧控制裝置、pH控制裝置和充氧裝置，讓病毒培養基循環；適時將磁穩定流化床培養基出口流出的液體切換至收獲液出口至收獲液儲罐，連續或分批收獲病毒，并同時經過微孔濾膜補充病毒培養基，直至病毒收獲結束；關閉相應的管路。
(8)經過微孔濾膜由磁穩定流化床培養基入口泵入無菌水將磁穩定流化床內的殘液由上端收獲液出口頂出至收獲液儲罐，或由下端的培養基入口將殘液直接放至收獲液儲罐，或將殘液由排水口排出；關閉磁場，向系統內通入蒸汽滅菌；將貼有細胞的磁敏性微載體由收獲液出口或微載體加入口水洗排出進行后處理，培養過程完成。
所述的病毒培養基是指適合病毒增殖的培養基。
本發明為了提高動物細胞培養的密度和反應器的效率，所使用的用于動物細胞培養的磁敏性微載體既要對磁場有響應，又要適于細胞的貼壁、生長，還不能有磁粉的泄露，以免污染培養液和傷害細胞。
用于動物細胞培養的磁敏性微載體是核殼式結構，內核為磁敏核，磁敏核由磁粉和包裹磁粉的高分子聚合物構成，殼層為適于細胞貼壁、生長的基質。
所用磁粉的平均粒徑為0.1-5微米，所說的磁粉為γ-Fe(OH)2、γ-Fe2O3或Fe3O4。所說的高分子聚合物可由常用的可經懸浮聚合形成球狀顆粒的單體、引發劑和交聯劑制備，其中單體包括可經懸浮聚合形成球狀顆粒的單體，如苯乙烯系列，如苯乙烯、對乙烯基甲苯、間乙烯基甲苯或α-甲基苯乙烯，和甲基丙烯酸甲酯。引發劑包括懸浮聚合常用的引發劑，如過氧化苯甲酰(BPO)或偶氮二異丁腈(AIBN)。交聯劑包括懸浮聚合常用的交聯劑，如二乙烯基苯和異氰尿酸三烯丙酯。殼層基質包括適合不同種類的細胞貼壁和生長的基質，如明膠、葡聚糖等。
上述微載體的制備是將聚合單體、交聯劑、引發劑和磁粉按一定比例混合均勻進行聚合，以明膠溶液為分散劑，經懸浮聚合得到含磁粉的顆粒，經洗滌、烘干后得所需磁核；將磁核與殼層基質混合，懸浮于甲苯液中，使裹有明膠的磁核充分分散，之后降溫、交聯、還原、洗滌，得磁敏性微載體。所制得的微載體可以進一步進行包括DEAE修飾或衍生化的表面修飾，以改變其電荷分布、親水性等。
制備出的磁敏性微載體的平均粒徑為50微米～2毫米，濕比重1.1-2.5g/cm3，磁粉含量為30％-50％(wt)。微載體具有剛性致密結構。殼核式結構的微載體，其殼層為有利于細胞貼壁、生長的基質，這種結構既使微載體對磁場有響應，又隔絕了磁粉與細胞的直接接觸，還防止了在培養基中磁粉的泄露、污染培養液和對細胞的傷害，培養結果表明適于Vero細胞貼壁生長。
本發明所用的其它附屬裝置包括培養基儲罐、收獲液儲罐、滅菌裝置、充氧裝置、溫度控制裝置、溶液pH值控制裝置、溶解氧控制裝置及必要的連接管路。培養基儲罐、收獲液儲罐和滅菌裝置為常規設計。充氧裝置是為了向培養基供氧，它連接在培養基的循環途中，可以直接向充氧裝置內的液體通入富氧空氣或無菌空氣，或在充氧裝置內采用氣體交換膜向培養基供氧，由溶解氧傳感器和溶解氧控制裝置控制供氧的通氣量。溫度控制裝置和溶液pH值控制裝置(包括傳感器)可選購商品設備。溫度控制方式有多種，對小型磁穩定流化床可以在下端安裝冷卻棒和加熱棒，冷卻棒為套管結構，內通冷水；加熱棒可以是套管結構，內通熱水或蒸汽，或采用電熱絲加熱。溫度控制也可以采用水夾套控制溫度的方式。對大型磁穩定流化床，可以在磁穩定流化床內壁安裝縱向排管，也可以用水夾套，或安裝多根冷卻棒和加熱棒，也可以在培養基循環途中安裝換熱器。控制溶液pH值范圍的關鍵是避免溶液中的酸或堿過濃，對大型磁穩定流化床可以采用噴淋的方式。最方便的控制方式是將控制元件全部安裝在充氧裝置上，這樣既可以簡化流化床主體的結構，又可以避免局部的溫度過高以及酸或堿濃度的過高對細胞的傷害，其控制方式可以采用上述的各種方法，取決于充氧裝置的規模、制造工藝、成本和控制策略。
磁穩定流化床所用的材質，以能滅菌、不污染培養基、不損傷細胞、易加工為宜。對小型磁穩定流化床，罐體可以用玻璃，頂蓋、接口、附屬管路、濾網、分布板等可用不銹鋼。對大型磁穩定流化床可以都采用不銹鋼材質。
對小型磁穩定流化床，罐體上端不需要擴大段。對大型磁穩定流化床，上端最好接有擴大段，以減少顆粒的夾帶。擴大段的內徑為主體內徑的1.0-2.0倍，高度為主體內徑的0.5-3.0倍，擴大段下部錐段的錐角為40°-120°。
磁穩定流化床截面的形狀為圓形、方形等。以圓形最佳，因為可以充分利用磁場的均勻部分，而且床內的壁效應最小。
磁穩定流化床的高徑比為1∶1-20∶1，內徑為1厘米-100厘米。
本發明使用磁敏性微載體，顆粒相對靜止，消除了顆粒間的碰撞和摩擦，提高了微載體的裝填密度，減少了細胞的損傷，磁敏性微載體的體積分率可以達到40％以上，從而提高了細胞培養的密度和單位磁穩定流化床體積生產病毒的能力。用本發明的培養技術培養Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)生產乙腦病毒，使用自制的磁敏性微載體，細胞密度達到108個細胞/ml以上，遠高于用攪拌式或氣升式反應器所達到的細胞密度，病毒收獲液中病毒滴度達到8.5TCID50。
下面結合附圖及實施例對本發明的技術方案作進一步的說明。
圖1．本發明的磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統示意圖；圖2．本發明的磁穩定流化床結構示意圖。1．流化床主體2．濾網3．支撐板4．液體分布板5．培養基入口6．滅菌蒸汽入口 7．排水8．培養基出口 9．廢棄培養基出口 10．壓力平衡口11．排氣口 12．微載體加入口13．接種口14．Helmholtz線圈15．充氧裝置16．充氧裝置的培養基入口17．充氧裝置的培養基出口18．富氧空氣或純氧入 19．溶液pH值傳感器 20．溶解氧傳感器21．溫度傳感器 22．控制裝置 23．酸或堿儲罐24．控溫執行機構25．富氧空氣或純氧源 26．恒流泵 27．空氣過濾器28．氣路閥門29．液面 30．新鮮培養基 31．蒸汽 32．空氣圖2是本發明磁穩定流化床結構示意圖。培養基從下端進入流化床，從上端離開。磁穩定流化床1內裝有磁敏性微載體，用Helmholtz線圈14加上縱向磁場。磁穩定流化床主體1的上部為錐形擴大段，目的是使液體離開顆粒層后速度降低，減少顆粒夾帶；磁穩定流化床主體1的下部為錐形，以消除死角；磁穩定流化床主體1的下端有濾網2，以防止顆粒泄露；濾網2下有支撐板3，以支撐濾網2；支撐板3下有液體分布板4，使液體均勻分布；濾網2、支撐板3和液體分布板4的材質以能蒸汽滅菌且不污染培養液為準，如陶瓷或不銹鋼。磁穩定流化床主體1的下端設有5、6、7三個接口，5是培養基入口，6是滅菌蒸汽入口，7是排水口。磁穩定流化床擴大段的側面設有8、9兩個接口，8是培養基出口，9是含病毒的收獲液出口(去收獲液儲罐)。磁穩定流化床的上端面設有蒸汽或空氣的排氣口11，設有微載體加入口12，用以加入微載體顆粒，設有接種口13，手工接種時可用12作接種口。
磁穩定流化床的結構和操作工藝參數如下磁穩定流化床主體內徑10厘米，高50厘米；擴大段內徑15厘米，高15厘米；擴大段與主體的連接部分高5厘米；主體下端的錐部高4厘米；培養的細胞為137代Vero細胞，擬收獲的產物是乙腦病毒；細胞培養基為添加8％胎牛血清的M199培養基，病毒培養基為添加1％人血清白蛋白的MEM培養基；所用的微載體的粒徑為100μm-150μm，矯頑力為20安培/米，濕比重為1.3g/cm3；用氧氣鋼瓶供氧；磁場的磁感應強度為12mT；床內的表觀液速為15厘米/分鐘；細胞接種密度為5×106個細胞/ml；培養細胞時溫度設定為37℃，溶液pH值設定為7.0，溶解氧設定為30％空氣飽和度；種毒滴度為8.0TCID50，接毒量為1∶100；培養病毒時溫度設定為37℃，溶液pH值設定為7.3，溶解氧設定為30％空氣飽和度。
(1)在磁場關閉的狀態下，清洗磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統內的所有容器、管路；設定細胞培養所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍及反應溫度；(2)將1.6公斤磁敏性微載體用溶液pH值7.0的磷酸緩沖液于37℃溶脹3小時，用磷酸緩沖液洗三次，然后由12號口加入磁穩定流化床，再加入1升pH值7.0的磷酸緩沖液。向系統內通入滅菌蒸汽，滅菌30分鐘；
(3)系統冷卻后將磁穩定流化床內的液體由7號口排出；經微孔濾膜由5號口向磁穩定流化床內注入細胞培養基2升，浸泡磁敏性微載體12小時；(4)由13號口加入已制備好的Vero細胞懸液(種子液)；(5)經過微孔濾膜由6號口按0.2升/分鐘的流量通入氧氣3分鐘，使顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣；每隔半小時重復“關閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣”的過程，至接種后3小時；其中的“通氣”是指前述的“經過微孔濾膜由6號口按0.2升/分鐘的流量通入氧氣3分鐘”；經過微孔濾膜補足細胞培養基使充滿充氧裝置和管路；(6)啟動控制裝置和充氧裝置，讓細胞培養基循環；12小時后開始連續補充新鮮的細胞培養基，同時棄去等量的由培養基出口流出的細胞培養基；培養基補充速率每隔12小時遞增一次，依次為10ml/分鐘、15ml/分鐘、20ml/分鐘、30ml/分鐘、40ml/分鐘、60ml/分鐘、80ml/分鐘、120ml/分鐘、160ml/分鐘。接入細胞120小時后停止補充細胞培養基，關閉磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的控制裝置和充氧裝置，停止細胞培養基的循環；在細胞培養過程中，每隔6小時將磁場關閉一下，再重新開啟；此時細胞密度為1.2×108個細胞/ml；(7)將磁穩定流化床培養系統內的細胞培養基排空，用Earle’s液洗滌系統2次，再用MEM洗滌系統1次；洗滌過程為注入洗滌液體將系統充滿并使洗滌液體在磁穩定流化床內以10cm/分鐘的速度循環2分鐘，停止循環并排空，然后將磁場關閉5秒再開啟。設定病毒培養過程所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍、反應溫度；經微孔濾膜由5號口向磁穩定流化床內注入病毒培養基2升，啟動磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的溫度控制裝置，由接種口接入乙腦病毒的種毒；關閉磁場，經過微孔濾膜由6號口按0.2升/分鐘的流量通入氧氣3分鐘，使顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣；每隔25分鐘重復前述的“關閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣”的過程至接毒后24小時，然后補足病毒培養基使充滿充氧裝置和管路；啟動磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的溶解氧控制裝置、pH控制裝置和充氧裝置，讓病毒培養基循環；接入種毒72小時后開始經過微孔濾膜連續補充新鮮的病毒培養基，同時由9號口收獲等量的流出液體(含病毒)至收獲液儲罐。病毒培養基的補充速率為20ml/分鐘，連續收獲病毒。接入種毒72小時后停止收獲病毒。關閉相應的管路。收獲液的病毒滴度為8.5TCID50。
(8)將磁穩定流化床內的殘液由5號口排至收獲液儲罐；關閉磁場，向系統內通入滅菌蒸汽滅菌；將微載體由12號口水洗排出，進行后處理；培養過程結束。
權利要求
1．一種用磁穩定流化床培養貼壁依賴性動物細胞生產病毒的方法，其特征在于該方法的步驟為(1)在磁場關閉的狀態下，清洗磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統內的所有容器、管路；在啟動磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的控制裝置之前設定細胞培養所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍及反應溫度；(2)將磁敏性微載體預處理后由微載體加入口加入到磁穩定流化床中，然后由滅菌蒸汽入口向系統內通入蒸汽滅菌；或在通入蒸汽前加入緩沖液至浸沒磁敏性微載體再通入蒸汽滅菌，所述的緩沖液為磷酸緩沖液；或將磁敏性微載體單獨滅菌后在無菌環境下加入到已經滅菌的磁穩定流化床中；其中磁敏性微載體的加入量按視體積計為磁穩定流化床工作體積的10％～95％，磁敏性微載體的矯頑力低于200安培/米，粒徑為50μm～2mm，濕比重為1.1～2.5g/cm3，磁穩定流化床的液體表觀流速為5厘米/分鐘～25厘米/分鐘，磁場強度為3～100mT；(3)冷卻后將磁穩定流化床內的液體由排水口排出；經過微孔濾膜由磁穩定流化床培養基入口向磁穩定流化床內注入細胞培養基至浸沒磁敏性微載體但不超過磁穩定流化床的工作體積的95％，浸泡磁敏性微載體適當時間；(4)由磁穩定流化床的接種口加入已制備好的細胞種子液；(5)經過氣體過濾裝置由磁穩定流化床的滅菌蒸汽入口通入能使磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣，持續5秒鐘以上，使磁敏性微載體顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣，20-30分鐘后關閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣；以后每隔20-30分鐘重復關閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣的過程，直至細胞在磁敏性微載體上貼壁完全；其中的通氣是指前述的經過氣體過濾裝置通入能使磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣并持續5秒鐘以上；經過微孔濾膜補足細胞培養基使之充滿充氧裝置和管路；(6)啟動磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的控制裝置和充氧裝置，讓細胞培養基循環，進行細胞培養過程；根據實際操作的需要，經過微孔濾膜連續或分批補充新鮮細胞培養基，定時取樣分析，直至達到所需的細胞密度或預定的培養時間；關閉磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的控制裝置和充氧裝置，停止細胞培養基的循環；在細胞培養過程中，每隔2-12小時將磁場關閉一下，再重新開啟；(7)將磁穩定流化床培養系統中的細胞培養基排出，經過微孔濾膜由培養基入口加入洗滌液至充滿培養系統，用洗滌液浸泡培養系統或使洗滌液在培養系統中循環一定時間，對磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統進行洗滌，然后排出洗滌液；設定病毒培養過程所需的溶液pH值范圍、溶解氧范圍、反應溫度；經過微孔濾膜加入病毒培養基至浸沒貼有細胞的磁敏性微載體但不超過磁穩定流化床的工作體積的95％；啟動磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的溫度控制裝置，接入種毒；關閉磁場，經過氣體過濾裝置由磁穩定流化床的滅菌蒸汽入口通入能使貼有細胞的磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣，持續5秒鐘以上，使貼有細胞的磁敏性微載體顆粒懸浮并與液體充分混合，然后開啟磁場，停止通氣，20-30分鐘后關閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣；以后每隔20-30分鐘重復關閉磁場——通氣——開啟磁場——停止通氣的過程，直至病毒在細胞上吸附完全；其中的通氣是指前述的經過氣體過濾裝置通入能使貼有細胞的磁敏性微載體懸浮的無菌空氣或富氧空氣并持續5秒鐘以上；經過微孔濾膜補足病毒培養基使之充滿充氧裝置和管路；啟動磁穩定流化床動物細胞和病毒培養系統的溶解氧控制裝置、pH控制裝置和充氧裝置，讓病毒培養基循環；適時將磁穩定流化床培養基出口流出的液體切換至收獲液出口至收獲液儲罐，連續或分批收獲病毒，并同時經過微孔濾膜補充病毒培養基，直至病毒收獲結束；關閉相應的管路；(8)經過微孔濾膜由磁穩定流化床培養基入口泵入無菌水將磁穩定流化床內的殘液由上端收獲液出口頂出至收獲液儲罐，或由下端的培養基入口將殘液直接放至收獲液儲罐，或將殘液由排水口排出；關閉磁場，向系統內通入蒸汽滅菌；將貼有細胞的磁敏性微載體由收獲液出口或微載體加入口水洗排出進行后處理，培養過程完成。
2．如權利要求1所述的用磁穩定流化床培養貼壁依賴性動物細胞生產病毒的方法，其特征在于所述的病毒培養基是指適合病毒增殖的培養基。
3．如權利要求1所述的用磁穩定流化床培養貼壁依賴性動物細胞生產病毒的方法，其特征在于所述的步驟(7)中的洗滌次數為1-5次。
全文摘要
本發明涉及一種用磁穩定流化床培養貼壁依賴性動物細胞生產病毒的方法。將培養系統和經預處理的微載體清洗、滅菌后,注入細胞培養基浸泡微載體適當時間;接種,讓細胞在微載體上貼壁,讓培養基循環、充氧,廢棄部分培養基同時補充新鮮培養基,進行細胞培養過程。更換病毒培養基,接入種毒;讓病毒在細胞上吸附完全;讓培養基循環,適時將磁穩定流化床培養基出口流出的液體切換至收獲液出口至收獲液儲罐,連續或分批收獲病毒。用本發明培養Vero細胞生產乙腦病毒,細胞密度達到10
文檔編號C12N7/00GK1303924SQ00100230
公開日2001年7月18日 申請日期2000年1月10日 優先權日2000年1月10日
發明者叢威, 呂秀菊, 高紅亮, 歐陽藩 申請人:中國科學院化工冶金研究所