專利名稱：堿性海藻多糖裂解酶的發酵生產方法和生產該酶的微生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的微生物，和利用該微生物發酵生產酶的方法。
海藻多糖裂解酶或藻酸鹽裂解酶(Alginate lyase.EC4.2.2.3.)，通過β-消除機制將海藻多糖降解為不飽和糖醛酸寡聚物-海藻酸寡糖(alginicacid oilgosaccharides)和不飽和糖醛酸單體(uronic acid)，根據酶對底物的作用，該酶分為兩種類型即polyM裂解酶及polyG裂解酶。
自90年代以來，海藻酸裂解酶在生物工程產品研發中的應用價值引起關注，它不僅可開發新生理活性物質，更重要的是開拓了一個新的工業應用領域。除了直接作為藥品酶應用于治療由致病菌銅綠假單胞菌引起的肺炎外，海藻多糖裂解酶應用的重要方向是酶法生產海藻寡糖，為新藥、新功能食品的開發提供了新手段。特別是被稱為寡糖素(oligosaccharins)的酶解產物——海藻寡糖的生理功能不斷被揭示，引起了人們更大的興趣。海藻寡糖的生理功能包括促進植物生長、刺激雙歧桿菌的增殖、抑制腫瘤、降低血壓、活化人表皮角質細胞等。1997年英國人又發現海藻寡糖素可使青霉素G產量增加50-150％(Ariyo B.T.et al.，Biotechnol.Bioeng.53∶17-20，1997)。
已經對海藻多糖裂解酶進行了大量研究，包括了海洋微生物及陸生微生物產生的該酶，涉及該酶的產生、純化、基因分析等各方面。主要參考文獻包括Marcello，A.et al.FEMS Microbiol.Lett.；136(1)39-44，1996；Aasen I.M.et al，3755-60，1992；Ostgarol K.et al.EnzymeMicrobiol.Technol.1993，15756-763；Kinoshita，S.et al.J.Ferment.Bioeng.7274-78，1991；Murata，K.et al.Comments Agric.& FoodChemistry，3(2)87-110，1994；Sutherland，Ian W.Polysaccharide lyases，FEMS Microbiology Reviews，16323-347，1995；Sawabe，T.et al.Carbohydr.Res.；304(1)69-76，1997；Shimokawa T.et al.Biosci.Biotech.Biochem.，61(4)636-640，1997；Malissard M.et al.FEMS Microbiol.Lett，126(2)105-111，1995；Dyrset N.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.41523-530，1994；Nakagawa，A.et al.J.Appl.Microbiol.；84(3)328-335，1998；Ertesvag，H.et al.J.Bacteriol.，180(15)3779-3784，1998；Baron，A.J.et al.Gene，143(1)61-66，1994；Brown，B.J.et al.Appl.Environ.Microbiol.57(6)1870-1872，1991；Hicks，S.J.et al.Enzyme Microbiol.Technol.，19(1)68-73，1996。
已經作出了一些努力，試圖將海藻多糖裂解酶應用于海藻寡糖的生產，如JP63039581A2，JP63214192A2，US05516666，US04958016，EP00979301A1等專利，所述裂解酶來自Altermonas sp.，Flavobacterium sp.，Bacillus sp.，Psudomonas sp.等，而且也有開發特性酶的嘗試，如US05139945，WO09002794A1，AU04335189A1等報道的來自Bacillussteraothermophilus的高溫酶，但目前這些酶在酶活力、穩定性、半衰期等方面尚無法滿足應用于寡糖生產的實際需要，現有的海藻多糖裂解酶應用于海藻寡糖生產主要存在兩個問題，即酶活力低及活性復雜。因此實際應用的酶尚非常缺乏。
本發明的目的在于提供一種新的堿性海藻多糖裂解酶的生產菌株及堿性海藻多糖裂解酶的大量生產方法。
嗜堿微生物的極端酶對于海藻多糖裂解酶的發展具特殊意義，首先可避免糖苷酶活性的干擾，克服一般海藻多糖裂解酶活性復雜的缺陷；另外由于海藻多糖的分子特性，酸性條件下變性形成不可逆的凝膠，而堿性條件下其分子易溶脹，也有利于酶的裂解，而且，金屬離子絡合物多在堿性條件下形成，并隨處理過程中pH的不同，金屬離子可相互替代，因此嗜堿菌的堿性藻酸鹽裂解酶具有特殊優勢。在已發現的裂解酶中，其反應pH多在7-11之間，但已報道的海藻多糖裂解酶的反應pH一般是中性，只有一個兼性嗜堿芽孢桿菌Bacillus sp.M-2的報道(日本專利，特公昭52-2997)，其最適反應pH為9，產酶量低，僅有3u/ml，也沒有進行發酵工藝的研究。專性嗜堿的革蘭氏陰性菌尚未見報道。
本發明所涉及的菌種是專性嗜堿革蘭氏陰性菌，該菌種在pH8以下不生長，產生的酶的最適反應pH為9.5，發酵液酶活力高達100單位/毫升發酵液以上。
本發明所采用的菌株為分離自中國沿海的嗜堿菌N19-2(alkaliphilicsp.N19-2)。菌株N19-2不產生芽胞，G-，生長的pH范圍為pH8-11.5，最適生長pH9.5-10，在0.5-8％的NaCl中生長良好，最適為3％。該菌株的培養特征與生理生化特征列于下表。
表1，菌株N19-2的特征
該菌株于2000年6月28日在中國科學院微生物所內的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，地址北京中關村北一條13號微生物所)進行了保藏，保藏號為CGMCC No.0464。
本發明所采用的液體種子培養基含有(克/升)淀粉5，蛋白胨10，酵母粉5，K2HPO41，MgSO47H2O0.15，NaCl30，Na2CO310。固體斜面種子培養基為上述培養基中添加2％的瓊脂粉。發酵培養基(克/升)海藻酸鈉10-18，蛋白胨5-9，酵母粉5-7，K2HPO41-3，MgSO47H2O0.1-0.3，NaCl10-30，Na2CO38-15，豆油2-5ml。
取固體斜面培養基上生長良好的培養物少許，接種于裝有50ml種子培養基的250ml三角瓶中，置37℃，220轉/分的旋轉搖床上培養24小時作為一級種子液。以4％的接種量將一級種子轉接于裝有1000ml種子培養基的3000ml三角瓶中，上述條件培養24小時，作為二級種子液，再以3-5％的接種量，將二級種子液轉接于種子罐或發酵罐中。種子罐為50升罐，裝料體積20-30升，發酵溫度32-37℃，通氣量1∶0.5-1∶1.0，轉速400-450轉/分，時間20-28小時。發酵罐為250升-1噸罐，裝料量120-600升。發酵溫度32-37℃，通氣量1∶0.5-1∶1.0，轉速200-450轉/分。發酵時間36-48小時。
對于按上述方法得到的發酵液，其中堿性海藻多糖裂解酶的酶活力在100u/ml以上，酶活力測定方法參照Horikoshi K..et al.JP877677的方法測定。具體地說，以0.9ml，0.5％(W/V)海藻多糖作底物，用pH10，0.05MOL/L甘氨酸-NaOH緩沖液加入0.1ml稀釋酶液，55℃保溫10分鐘，用二硝基水楊酸試劑測產生的還原糖，1個酶活力單位定義為上述反應條件下，一分鐘釋放1mMOL相當于D-甘露糖的還原糖的酶量。
發酵液經板框過濾、中空纖維柱超濾濃縮即可獲得純凈的濃縮酶液，濃縮倍數10倍，酶收率85％以上。
利用本發明新的嗜堿菌和本發明的方法生產的新型海藻多糖裂解酶，與現有技術披露的酶相比，其酶活性高、專一，熱穩定性好，用于裂解海藻多糖具有顯著的優勢。本發明提供了專性嗜堿海藻多糖裂解酶產生菌，為實現堿性海藻多糖裂解酶大量生產提供了可行的工藝，該酶活力屬世界先進水平，酶的熱穩定性較好。該酶可有效地降解海藻多糖生成不飽和的海藻寡糖，為海洋資源的高價值轉化利用創造了條件。
將菌株N19-2保持并轉移到試管的固體斜面培養基上，該瓊脂培養基組成為(克/升)淀粉5，蛋白胨10，酵母粉5，K2HPO41，MgSO47H2O0.15，NaCl30，Na2CO310，瓊脂粉2％。以蒸餾水配制。
對于每次轉移，均將瓊脂斜面在35℃下培養2天。然后按照如下步驟制備菌種培養物。
發酵液以加濾紙板的板框進行過濾，過濾壓力0-2Kg/cm2，濾液由中空纖維超濾柱進行濃縮，(柱的截留分子量為6000)，基本無需壓力，濃縮10倍左右后，以10mMNa2CO3-NaHCO3緩沖液(pH10)洗滌濃縮酶液，并洗滌超濾柱。最終酶的總收率85％。
將菌株N19-2從斜面上接種于裝有50ml種子培養基的250ml三角瓶中，35℃搖床培養24小時作為一級種子液。以3％的接種量將一級種子液接入一個裝有1000ml種子培養基的3000ml三角瓶中，37℃搖床培養24小時作為二級種子液。將二級種子液接入裝有25升種子培養基的50升種子發酵罐中，發酵溫度35℃±1℃，通氣量1∶1.0，攪拌速度450轉/分，發酵24小時后，將其轉接入裝有600升發酵培養基的1噸罐中。發酵培養基的組成為(克/升)海藻酸鈉12，酵母粉7，大豆粉4.5，味精4.5，K2HPO41.5，MgSO47H2O0.1，NaCl30，Na2CO312，豆油4ml/升，發酵溫度35℃，通氣量1∶0.75，攪拌速度240轉/分，發酵40小時，終止發酵，發酵液酶活力100u/ml以上。
發酵液以加濾紙板的板框進行過濾，并加適當硅藻土作為助濾劑。濾液如例1所述進行超濾濃縮，濃縮10倍左右，總收率85％以上。
權利要求
1.一種嗜堿菌N19-2，其菌種保藏號為CGMCC No.0464。
2.一種通過微生物發酵生產海藻多糖裂解酶的方法，該方法包括以下步驟(1)將權利要求1的嗜堿菌N19-2在種子培養基中，在適合種子生長的培養條件下，進行種子培養；(2)將(1)收獲的培養物在含有海藻酸鈉的發酵培養基中，在適合菌體生長的培養條件下，進行發酵培養；(3)收獲的發酵液通過板框過濾和中空纖維超濾濃縮，制得堿性海藻多糖裂解酶。
3.根據權利要求2所述的方法，其中種子培養基為每升培養液中含有淀粉5克、蛋白胨10克、酵母粉5克、K2HPO41克、MgSO4-7H2O0.1克、NaCl20克、Na2CO310克，發酵培養基為每升培養液中含有海藻酸納5-20克、蛋白胨5-9克、酵母粉5-7克、K2HPO41-3克、MgSO47H2O0.1-0.3克、NaCl10-50克、Na2CO38-15克、豆油2-5ml。
4.根據權利要求2所述的方法，其中所述適合種子生長的培養條件為溫度35℃，搖床轉速220轉/分，振蕩培養24小時；所述適合菌體生長的發酵培養條件為溫度32-37℃，通氣量1∶0.5-1∶1.0，轉速200-450轉/分，發酵時間為32-48小時。
5.根據權利要求2所述的方法，其中獲得的堿性海藻多糖裂解酶最適反應pH為9.5，最適反應溫度為55℃。
全文摘要
本發明提供了一種新的專性嗜堿菌N19－2,以及用該菌種生產堿性海藻多糖裂解酶的微生物發酵生產方法。本發明用新的專性嗜堿菌N19－2以海藻酸鈉、蛋白胨等為原料,發酵生產堿性海藻多糖裂解酶,生產方法簡單,發酵液的酶活力達100u/ml以上,后提取收率80%以上。該酶的最適反應pH為9.5,最適反應溫度為55℃,在海藻寡糖生產方面具有重要的應有價值。
文檔編號C12N1/20GK1335393SQ0012110
公開日2002年2月13日 申請日期2000年7月26日 優先權日2000年7月26日
發明者馬延和, 薛燕芬, 周培瑾, 劉潁, 張志鋼, 劉洪燦 申請人:中國科學院微生物研究所