專利名稱：硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶及其用途的制作方法
硫酸乙酰肝素粘多糖 裂解酶及其用途本申請為申請日為2006年11月3日、申請號為2006800502567、發明名稱為“硫
酸乙酰肝素粘多糖裂解酶及其用途”的分案申請。相關申請的交叉引用本申請是2005年11月3日提交的美國申請序號11/265,908的部分連續申請，并要求該美國申請的優先權。
背景技術：
肝素和硫酸乙酰肝素代表以連接至己糖醛酸的D-葡糖胺的線性多糖為特征的一類粘多糖(Linhardt, R. J. (1991)Chem. Ind. 2,45-50 ;Casu, B. (1985)Adv. Carbohydr.Chem. Biochem. 43，51-134)。肝素和硫酸乙酰肝素是在哺乳動物胞外基質中具有關鍵功能作用的碳水化合物復合物。這些多糖調節和調控重要的生化信號通路，所述信號通路作用于正常的生理過程，例如細胞和組織的形態發生、細胞-細胞相互作用以及生長和分化。這些多糖也在多種病理過程中具有關鍵作用，所述病理過程包括傷口愈合、腫瘤生長和轉移、某些神經變性疾病和微生物引起的發病，在此僅舉幾個例子。現在對肝素和硫酸乙酰肝素序列的理解大多依賴于對其生物合成的研究(Linhardt, R. J. , Wang, H. M. , Loganathan, D. , and Bae, J. H. (1992)Biol. Chem. 267,2380-2387 ；Lindahl, U. , Feingold, D. , and Roden, L. (1986)Trends Biochem.Sci. 11,221-225 Jacobson, I. , and Lindahl U. (1980) J. Biol. Chem. 255, 5094-5100 ；Lindahl, U. , and Kjellen, L. (1987)in The Biology of Extracellular MatrixProteoglycans(Wight,T. N. , and Mecham R. ,eds)pp. 59-104,Academic Press,New York)。硫酸乙酰肝素與肝素在化學上相關，其出現在細胞表面上以及差不多每種哺乳動物細胞類型的胞外基質(extracellular matrix, ECM)中。這些肝素樣粘多糖(heparin-like glycosaminoglycan, HLGAG)作為稱作蛋白聚糖的蛋白-多糖共軛物存在于這種胞外環境中。逐漸認識到HLGAG不僅僅具有結構功能，因為它們以功能性方式與許多胞外機制的蛋白質相互作用，所述蛋白質例如層粘連蛋白、纖連蛋白、整合蛋白和膠原蛋白。這樣，HLGAG(作為蛋白聚糖的一部分)協助限定基質的生物學特性。這些HLGAG也與胞外基質中的一列細胞因子樣生長因子和形態發生素，通過協助其與受體的生化相互作用以及保護它們不被蛋白水解降解而相互作用。例如,如Thornton, et al. , Science 222,623-625(1983)報道的肝素控制aFGF的生物學活性，這可能是如Schreiber，et al. ,Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82，6138-6142 (1985)報道的通過控制aFGF對其細胞表面受體的親和力。根據 Gospodarowicz and Cheng, J. Cell Physiol. 128,475-484(1986) ；Rosengart,et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 152,432-440(1988)；和 Lobb Biochem.27,2572-2578(1988)的報道，肝素保護aFGF和bFGF免于被熱、酸和蛋白酶降解。根據Vlodavsky, et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,2292-2296 (1987)和 Folkman, et al.，Am. J. Pathol. 130, 393-400 (1988)和 Emerson et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (14)4833-8(2004)的報道，bFGF儲存在胞外基質中并可通過酶(例如乙酰肝素酶)的水解活性被動員為生物活性形式。
如Yayon, et al. , Cell 64,841-848(1991)和 Papraeger, et al. , Science 252，1705-1708(1991)報道，FGF結合到硫酸乙酰肝素上是FGF結合到其位于細胞表面上的高親和力受體的先決條件。如 Kiefer，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA87,6985-6989 (1990)描述的，已發現特異的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖調節bFGF對細胞表面的結合。肝素裂解酶，例如肝素酶是能夠特異性切割肝素和硫酸乙酰肝素中的主要糖苷鍵的一類酶。已經在肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)中鑒定了 3種肝素酶,所述肝素黃桿菌作為使用GAG的有機體也生產外切葡糖醒酸糖苷酶(exoglycuronidases)、糖苷酶、硫酸酯酶(sulfoesterases)和氨苯磺胺酶(sulfamidases)以及其他另外作用于裂解酶產生的低聚糖產物的其他酶類(Yang, et al. J. Biol. Chem. 260，1849-1857 (1987)； Galliher, et al. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 15,252-257 (1982)。這些裂解酶被稱為肝素酶1(肝素酶，EC 4. 2. 2. 7)、肝素酶11(肝素酶，沒有EC號)和肝素酶ΠΙ(肝素酶EC 4. 2. 2.8)。這三種純化的肝素酶在其切割肝素和硫酸乙酰肝素的能力上不同肝素酶I主要切割肝素，肝素酶III特異切割硫酸乙酰肝素，而肝素酶II同時作用于肝素和硫酸乙酰肝素。幾個擬桿菌屬(Bacteroides)的種類(Saylers,et al.Appl.Environ.Microbiol.33,319-322(1977) ；Nakamura, et al.J.Clin.Microbiol. 26,1070-1071 (1988))也產生肝素裂解酶。Bohmer, et al. J. Biol. Chem. 265,13609-13617(1990)從一種未鑒定的土壤細菌中，根據明顯同源性也純化了肝素裂解酶。發明概述本發明部分地根據來自多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的粘多糖(glucosaminoglycan, GAG)裂解酶后文中稱為“多形擬桿菌GAG裂解酶”的發現和重組表達，例如多形擬桿菌GAG裂解酶I、多形擬桿菌GAG裂解酶II、多形擬桿菌GAG裂解酶III和多形擬桿菌GAG裂解酶IV，其特別可用于肝素和/或硫酸乙酰肝素的結構特異性切割，并且在某些情況下用于硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的結構特異性切割。因此，本發明包括多形擬桿菌GAG裂解酶或其功能片段以及多形擬桿菌GAG裂解酶或其功能片段的組合的方法、組合物和試劑盒，用于例如對粘多糖(GAG)(例如肝素樣粘多糖(heparin-likeglycoaminoglycans, HLGAG),例如肝素或硫酸乙酰肝素)的表征或修飾,或者例如對非肝素/硫酸乙酰肝素GAG(例如硫酸軟骨素和硫酸皮膚素)的表征或修飾。例如，所述方法、組合物和試劑盒可用于分析和監視GAGUf^BHLGAG)的異源群體。在其他方面，所述方法、組合物和試劑盒可用于修飾GAG (例如HLGAG)的結構和/或活性。因此，一方面，本發明的特征在于多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，例如具有SEQ ID NOs :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列的多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段；基本上與SEQ IDNOs :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列相同的氨基酸；或者由核酸分子編碼的氨基酸，該核酸分子在嚴格雜交條件下與包括SEQ ID NOs :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39中的氨基酸序列的核酸分子雜交，其中所述核酸編碼全長多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質或其功能片段。在另一方面，本發明的特征在于包括一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶或其功能片段的組合物，例如本文描述的一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一個實施方案中，所述組合物進一步包括一種或多種HLGAG降解酶,例如除GAG裂解酶多肽以外的一種或多種肝素酶,和/或一種或多種除多形擬桿菌GAG裂解酶多肽的GAG裂解酶多肽。例如，所述組合物進一步包括一種或多種不飽和葡糖醛酸水解酶(例如，肝素黃桿菌△ 4，5葡糖醛酸糖苷酶(glycuronidase);多形擬桿菌Λ4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡糖醛酸水解酶(例如哺乳動物α-艾杜糖醒酸酶(iduronidase) ; β _葡糖醒酸糖苷梅(glucuronidase));硫酸水解酶(例如肝素黃桿菌2-0-硫酸酯酶、6-0-硫酸酯酶、3-0-硫酸酯酶、多形擬桿菌6-0-硫酸酯酶；粘蛋白脫硫酶；哺乳動物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳動物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；N-氨苯磺胺酶(例如肝素黃桿菌N-氨苯磺胺酶；哺乳動物乙酰肝素-N-硫酸酯酶(heparan-N-sulfatase));芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如內_N_乙酰氨基葡萄糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黃桿菌肝素酶I (flavobacterium heparinumheparinase I)、肝素黃桿菌肝素酶II、肝素黃桿菌肝素酶III、肝素黃桿菌肝素酶IV也稱為來自肝素卩遼胞菌(Cytophaga heparina)或肝素土地桿菌(Pedobacter heparinum)的肝素酶)，哺乳動物乙酰肝素酶(heparinase)、噬菌體K5乙酰肝素裂解酶以及它們的功能片段和變體。這樣的組合物可用于，例如切割HLGAG (例如肝素和/或硫酸乙酰肝素)，例如表征HLGAG(例如肝素和/或硫酸乙酰肝素)的制備。 在另一方面，本發明的特征在于特異切割HLGAG (例如肝素或硫酸乙酰肝素)的方法，其包括將HLGAG與一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接觸，例如本文描述的一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一個實施方案中，所述HLGAG被切割成二-、三-、四-、五-、六_、八-和/或十糖，以及例如所述方法進一步包括確定所述HLGAG的二-、二-、四-、五-、六_、八-和/或十糖的序列。在一個實施方案中，所述方法進一步包括將所述HLGAG與一種或多種HLGAG降解酶(例如除多形擬桿菌GAG裂解酶多肽以外的肝素酶多肽或GAG裂解酶多肽)接觸。例如，所述HLGAG降解酶可以是一種或多種不飽和葡糖醛酸水解酶(例如，肝素黃桿菌△ 4，5葡糖醛酸糖苷酶；多形擬桿菌Λ4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡糖醛酸水解酶(例如哺乳動物α -艾杜糖醛酸酶；β -葡糖醛酸糖苷梅)；硫酸水解酶(例如肝素黃桿菌2-0-硫酸酯酶、6-0-硫酸酯酶、3-0-硫酸酯酶、多形擬桿菌6-0-硫酸酯酶；粘蛋白脫硫酶；哺乳動物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳動物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；Ν-氨苯磺胺酶(例如肝素黃桿菌N-氨苯磺胺酶；哺乳動物乙酰肝素-N-硫酸酯酶)；芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如內-N-乙酰氨基葡糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黃桿菌肝素酶I、肝素黃桿菌肝素酶II、肝素黃桿菌肝素酶III、肝素黃桿菌肝素酶IV也稱為來自肝素噬胞菌或肝素土地桿菌的肝素酶)，哺乳動物乙酰肝素酶、噬菌體Κ5乙酰肝素裂解酶以及它們的功能片段和變體。在另一方面，本發明的特征在于用于分析HLGAG異源群體的方法，所述HLGAG例如肝素(例如UFH、LMWH和合成的肝素)和硫酸乙酰肝素，所述方法包括將所述群體與一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接觸，例如本文描述的一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。因此，在一些方面，本發明涉及與分析和監視HLGAG異源群體相關的方法和產品，所述分析和監視使用一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段從而以鑒定HLGAG異源群體的結構特征(structural signature)和活性,例如本文描述的一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。
在一些實施方案中，所述方法包括測定一組或多組HLGAG產品的結構特征，所述HLGAG與一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接觸，例如本文描述的一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一些實施方案中，所述方法進一步包括選擇一組作為所述測定的結果。在一些實施方案中，所述方法進一步包括將所述測定的結果與預選值例如參考標準進行比較。所述預選值可以是，例如一種或多種與HLGAG的切割相關的二 _、三_、四-、五_、六_、八-和/或十糖的存在與否或者給定值(例如摩爾％或曲線下的區域)，所述HLGAG的切割是用一種多形擬桿菌GAG裂解酶多 肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段進行的，例如本文描述的一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。對于本文描述的任何方法，可分析多形擬桿菌GAG裂解酶多肽(或者多種多肽)完全或部分消化的樣品以一種或多種下列方式測定結構特征多種質譜(例如基質輔助激光解吸電離 / 飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption/ionization massspectroscopy, MALDI-MS)),核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)光譜(例如ID NMR 或 2D NMR)，凝膠電泳，毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE),反相柱色譜(reverse-phase column chromatography,例如HPLC,例如具有用季銨鹽動態涂敷的固定相的HPLC),離子配對HPLC(例如強陰離子交換HPLC(strong anion exchange HPLC,SAX-HPLC))。本文描述的方法進一步包括用一種或多種HLGAG降解酶消化所述樣品，所述HLGAG降解酶例如除多形擬桿菌GAG裂解酶多肽以外的肝素酶或肝素裂解酶多肽。例如，所述HLGAG降解酶可以是一種或多種不飽和葡糖醛酸水解酶(例如，肝素黃桿菌Λ4，5葡糖醛酸糖苷酶；多形擬桿菌△ 4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡糖醛酸水解酶(例如哺乳動物α-艾杜糖醛酸酶；β-葡糖醛酸糖苷梅)；硫酸水解酶(例如肝素黃桿菌2-0-硫酸酯酶、6-0-硫酸酯酶、3-0-硫酸酯酶、多形擬桿菌6-0-硫酸酯酶；粘蛋白脫硫酶；哺乳動物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳動物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；Ν-氨苯磺胺酶(例如肝素黃桿菌N-氨苯磺胺酶；哺乳動物乙酰肝素-N-硫酸酯酶)；芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如內-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黃桿菌肝素酶I、肝素黃桿菌肝素酶II、肝素黃桿菌肝素酶III、肝素黃桿菌肝素酶IV也稱為來自肝素噬胞菌或肝素土地桿菌的肝素酶)，哺乳動物乙酰肝素酶、噬菌體Κ5乙酰肝素裂解酶以及它們的功能片段和變體。在另一方面，本發明的特征在于HLGAG制品(例如肝素或硫酸乙酰肝素制品)，所述HLGAG制品通過將HLGAG制品和一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段相接觸而制備，例如本文描述的一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段。在一個實施方案中，所述HLGAG制品(例如肝素或硫酸乙酰肝素制品)例如與參考標準相比，例如與市售肝素或硫酸乙酰肝素相比，或者與在多形擬桿菌GAG裂解酶多肽接觸前的肝素或硫酸乙酰肝素制品相比，具有一種或多種降低的抗Xa活性和抗IIa活性。在一些實施方案中，當維持或增加抗IIa活性時，降低抗Xa活性。在其他的實施方案中，當維持或增強抗Xa活性時，降低抗IIa活性。在另外的實施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。這樣的制品可用于例如需要降低的抗Xa活性和/或抗IIa活性的應用中，例如將肝素或硫酸乙酰肝素用做另一個試劑例如治療性試齊U、預防性或診斷性試劑的載體劑。因此，在一些實施方案中，所述HLGAG制品還包括除該HLGAG以外的第二試劑，例如該制品還包括一種或多種治療性、預防性或診斷性試劑。在另一個實施方案中，所述HLGAG制品(例如所述肝素或者硫酸乙酰肝素制品)具有一種或多種增加的抗Xa活性和抗IIa活性，例如與參考標準相比，例如與市售肝素或硫酸乙酰肝素相比，或者在與多形擬桿菌GAG裂解酶多肽接觸前與肝素或硫酸乙酰肝素制品相比。這樣的制品可用于例如需要增加的的抗Xa活性和/或抗IIa活性的應用中，例如凝血劑和/或抗血栓形成的試劑。在另一個方面中，該發明的特征在于中和一種或多種HLGAG(例如肝素或硫酸乙酰肝素)活性的方法。該方法包括將HLGAG與一種多形擬桿菌GAG裂解酶、多種多形擬桿菌GAG裂解酶或其功能性片段相接觸，例如本文描述的一種多形擬桿菌GAG裂解酶、多種多形擬桿菌GAG裂解酶或其功能性片段。當所述HLGAG是肝素或硫酸乙酰肝素時，待中和的活性 是一種或多種抗Xa活性和抗IIa活性。在一些實施方案中，當維持或增加抗IIa活性時，降低抗Xa活性。在其他的實施方案中，當維持或增強抗Xa活性時，降低抗IIa活性。在其他的實施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。在其他的實施方案中，維持抗Xa活性和抗IIa活性。所述HLGAG可例如離體(ex vivo)或在體內接觸。因此，在一些實施方案中，該方法包括以中和受試者中抗Xa活性和/或抗IIa活性的有效量，施用一種多形擬桿菌GAG裂解酶、多種多形擬桿菌GAG裂解酶或其功能性片段至受試者，例如已經施用了 HLGAG例如肝素或硫酸乙酰肝素的受試者，例如已經施用了肝素或硫酸乙酰肝素以抑制凝血和/或血栓的受試者。在另一方面，本發明的特征在于在受試者內抑制血管生成的方法。該方法包括向受試者施用有效量的一種多形擬桿菌GAG裂解酶、多種多形擬桿菌GAG裂解酶或其功能性片段，例如本文描述的多形擬桿菌GAG裂解酶I多肽、多形擬桿菌GAG裂解酶II多肽、多形擬桿菌GAG裂解酶III多肽、多形擬桿菌GAG裂解酶IV多肽或其功能性片段，從而以抑制血管生成。在一個實施方案中，所述受試者患有與不需要的血管生成相關的疾病或病癥。這樣的病癥包括，但不局限于關節炎(例如風濕性關節炎)、多種眼病(例如糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy)、新生血管性青光眼(neovascularglaucoma)、炎癥性病癥(inflammatory disorders)、眼瘤(ocular tumors,例如視網膜母細胞瘤(retinoblastoma))、水晶液后囊纖維化(retrolental fibroplasias)、葡萄膜炎(uveitis)，以及與脈絡膜血管新生和虹膜血管新生相關的病癥)和癌癥(例如腫瘤生長和轉移)。在另一方面，本發明的特征在于抑制受試者內不需要的細胞增殖和/或分化的方法。所述方法包括向受試者施用有效量的一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，例如本文描述的一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，從而抑制細胞增殖和/或分化。在一個實施方案中，所述受試者患有癌癥。在另一方面，本發明的特征在于包括一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，例如本文描述的一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段和藥用可接受載體的藥用組合物。在一個實施方案中，所述一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段具有中和一種或多種HLGAG的 活性的有效量。優選地，所述HLGAG是肝素或硫酸乙酰肝素，并且所述多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段有效中和一種或多種抗Xa活性和抗IIa活性的量存在。在一些實施方案中，當維持或增加抗IIa活性時，降低抗Xa活性。優選，HLGAG是肝素或硫酸乙酰肝素，并且多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段是以有效中和一種或多種抗Xa活性和抗IIa活性的量存在。在一些實施方案中，當維持抗IIa活性活性時，抗Xa活性降低。在另外一些實施方案中，當維持或增強抗Xa活性時，降低抗IIa活性。在另外一些實施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。在另一個實施方案中，所述所述多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段以有效抑制血管生成的量存在。在另一方面，本發明的特征在于包含一種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽、多種多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段的組合物的試劑盒。在一個實施方案中，該試劑盒還包括一種或多種HLGAG降解酶，例如一種或多種肝素酶多肽和/或除多形擬桿菌GAG裂解酶多肽以外的一種或多種GAG裂解酶多肽。例如，該試劑盒包含以下中的一種或多種不飽和葡萄糖醛酸水解酶(例如，肝素黃桿菌△ 4，5葡糖醛酸糖苷酶；多形擬桿菌△ 4，5葡糖醛酸糖苷酶)；葡萄糖醛酸水解酶(例如哺乳動物α -艾杜糖醛酸酶；β -葡糖醛酸糖苷梅)；硫酸水解酶(例如肝素黃桿菌2-0-硫酸酯酶、6-0-硫酸酯酶、3-0-硫酸酯酶、多形擬桿菌6-0-硫酸酯酶；粘蛋白脫硫酶；哺乳動物N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶；哺乳動物艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)；Ν-氨苯磺胺酶(例如肝素黃桿菌N-氨苯磺胺酶；哺乳動物乙酰肝素-N-硫酸酯酶)；芳香基硫酸酯酶；氨基己糖苷酶；糖基水解酶(例如內-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶)；肝素酶(例如肝素黃桿菌肝素酶I、肝素黃桿菌肝素酶II、肝素黃桿菌肝素酶III、肝素黃桿菌肝素酶IV也稱為來自肝素噬胞菌或肝素土地桿菌的肝素酶)，哺乳動物乙酰肝素酶、噬菌體Κ5乙酰肝素裂解酶以及它們的功能片段和變體。在一個實施方案中，所述多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，以及一種或多種其他HLGAG降解酶在同一個組合物中。在另一個實施方案中，所述多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段，以及一種或多種其他HLGAG降解酶在不同的組合物中。在另一個實施方案中，所述多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段與藥學上有效的載體一起在藥用組合物中。所述試劑盒還包括HLGAG，例如肝素和/或硫酸乙酰肝素。在一個實施方案中，當該試劑盒包括多形擬桿菌GAG裂解酶或其功能性片段的藥用組合物時，該HLGAG例如肝素和/或硫酸乙酰肝素也在藥學組合物中，并且例如該試劑盒還包括用于中和HLGAG的一種或多種活性的指導性材料。在另一方面，本發明的特征在于編碼多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或其功能片段的核酸分子。在一個實施方案中，所述分離的核酸分子編碼具有SEQ ID NOs :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的氨基酸序列的多肽。在其他的實施方案方案中，本發明提供了具有SEQID NOs :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38所示的核苷酸序列的分離的多形擬桿菌GAG裂解酶核酸分子。在另一個實施方案中，本發明提供與SEQ ID NOs :1、5、28或36所示的核苷酸序列基本上相同的核酸分子(例如天然存在的等位基因變體)，以及在嚴格雜交條件下與包含SEQ ID NOs :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核苷酸序列的核酸分子雜交的核酸分子，其中所述核酸編碼全長多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質或其功能片段。在相關方面，本發明還提供包含本文所述的多形擬桿菌GAG裂解酶核酸分子的核酸構建體。在某些實施方案中，本發明的核酸分子有效連接至天然或異源調控序列。也包括包含本發明的多形擬桿菌GAG裂解酶核酸分子的載體和宿主細胞，例如適宜生產多形擬桿菌GAG裂解酶核酸分子和多肽的載體和宿主細胞。在另一方面，本發明的特征在于抗體及其抗原結合片段，其與多形擬桿菌GAG裂解酶多肽相互作用，或者更優選地與多形擬桿菌GAG裂解酶多肽特異結合。在另一方面，本發明提供篩選調節多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或核酸表達或活性的化合物的方法。以下詳細的說明書和權利要求清晰顯示了本發明的其他特性和優點。
圖IA描繪了編碼多形擬桿菌GAG裂解酶I的DNA序列(SEQ ID NO :1)。起始甲硫氨酸密碼子(ATG)加了下劃線，而第二個內部甲硫氨酸密碼子加了雙下劃線。圖IB描繪了其預測的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)，并以粗體顯示多形擬桿菌GAG裂解酶I的2個變體——稱為M17變體(SEQ ID NO 4)和Q26變體(SEQ ID NO 23)的N-末端氨基酸殘基。圖2描繪了多形擬桿菌GAG裂解酶I (SEQ ID NO. 2)與來自肝素黃桿菌的肝素酶I (SEQ ID NO 24)和共有序列(SEQ ID NO 26)的 BLAST 比對。圖3A描繪了編碼多形擬桿菌GAG裂解酶I的Ml7變體的DNA序列(SEQ ID NO 3)和以陰影顯示的甲硫氨酸17(M17)的ATG密碼子。圖3B描繪了其預測的氨基酸序列(SEQDD NO 4)。圖4A描繪了編碼多形擬桿菌GAG裂解酶I的Q26變體的DNA序列(SEQ ID NO 22)。圖4B描繪了其預測的氨基酸序列(SEQ ID NO :23)。圖5A描繪了編碼多形擬桿菌GAG裂解酶II的DNA序列(SEQ ID NO :5)。圖5A也描繪了編碼多形擬桿菌GAG裂解酶II的核苷酸序列的部分，其未出現在多形擬桿菌GAG裂解酶II的2種變體中，S卩，稱為"Q23變體"(SEQ ID NO :7)其刪除部分以下劃線顯示，和"K169變體"(SEQ ID NO :9)，其刪除部分以陰影顯示。圖5B描繪了多形擬桿菌GAG裂解酶II的預測氨基酸序列(SEQ ID NO 6)，并且顯示Q23變體(SEQ ID NO 8)和K169變體(SEQ ID NO 10)的氨基酸序列的刪除部分。圖6描繪了多形擬桿菌GAG裂解酶II (SEQ ID NO 6)與來自肝素黃桿菌的肝素酶m(SEQ ID NO :25)和共有序列(SEQ ID NO 27)的 BLAST 比對。圖7是MALDI-MS質譜的圖示。A版(panel A)描繪了未處理的ATIII五糖ARIXTRA 的峰，也顯示了其結構。B版描繪了用重組多形擬桿菌GAG裂解酶I消化ARIXTRA .后產生的峰。消化后產生了五硫酸化三糖產物，也顯示了其結構。圖8描繪了編碼從多形擬桿菌克隆到的GAG裂解酶III基因序列的DNA序列(SEQID NO 28)。以粗體標注起始甲硫氨酸(ATG)和終止(TAA)密碼子。對應于谷氨酸23 (Q23)的密碼子(CAG)加了下劃線。圖9描繪了從多形擬桿菌克隆到的GAG裂解酶III的氨基酸序列(SEQ ID NO 29)。預測的輸出信號序列加了下劃線。為氨基末端變體的開端劃定界限的谷氨酰胺23(Q23)涂有灰色陰影。圖10描繪了多形擬桿菌GAG裂解酶III (SEQ ID NO 29)的氨基酸序列——從頂端開始的所列第三項一與相關的肝素/硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶的比對。以深灰色表示相同的殘基，淺灰色表示相似的殘基。BT表示多形擬桿菌，ra表示肝素黃桿菌。
圖11描繪了從多形擬桿菌分離的GAG裂解酶III (BT GAG裂解酶)、從肝素黃桿菌分離的肝素酶II (FH肝素酶II)和從肝素黃桿菌分離的肝素酶III (FH肝素酶III)的酶活性。該酶活性表示為所述3種測試的酶底物的特異性。4種測試的“肝素樣”底物是豬小腸肝素、2種不同的硫酸乙酰肝素(稱為“HI”和HO”，每個在硫酸化作用程度上變化)和低分子量藥用肝素即依諾肝素(enoxaparin)。所示酶活性描繪了根據在232nm處吸收值評估的，在徹底消化中，針對這些底物的總的切割活性。圖12描繪了從多形擬桿菌分離的GAG裂解酶III (BT GAG裂解酶)和從肝素黃桿菌分離的肝素酶II (FH Hep II)的切割活性。該切割活性表示測試酶的底物特異性。實際的切割產物通過毛細管電泳分級，并通過在232nm處的吸收值(Y軸)監視。實線描繪了 BTGAG裂解酶，而虛線描繪了 Hep II。
圖13描繪了編碼多形擬桿菌GAG裂解酶IV的DNA序列(SEQ ID NO 36)。起始甲硫氨酸密碼子(ATG)和終止密碼子為粗體，而對應于天冬氨酸20的第二密碼子(GAC)加了下劃線。圖14描繪了具有加了下劃線的信號序列的其預測的氨基酸序列(SEQ ID NO37)。另外，稱為D20變體(SEQ ID NO 38)的多形擬桿菌GAG裂解酶IV變體的N-端氨基
酸殘基以陰影表示。圖15描繪了多形擬桿菌GAG裂解酶IV (SEQ ID NO 36)的氨基酸序列——從頂端開始的所列第三項一與相關的肝素/硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶的比對。以深灰色表示相同的殘基，淺灰色表示相似的殘基。BT表示多形擬桿菌，ra表示肝素黃桿菌。圖16描繪了多形擬桿菌GAG裂解酶IV對3種不同底物的底物特異性，所述底物即是未分級的肝素Ofeparin)和硫酸乙酰肝素(HS)的2種稱為“H0-HS”和“HI-HS”的級分。詳細描述鐘述本公開描述了來自多形擬桿菌的活性多形擬桿菌GAG裂解酶的重組表達，其對于GAG例如肝素和/或硫酸乙酰肝素粘多糖及其衍生物的修飾和表征特別有用。例如，本文所述的多形擬桿菌GAG裂解酶是現有化學-酶促方法的補充工具，所述方法用于以結構特異的方式切割GAG，例如肝素和硫酸乙酰肝素多糖(以及在一些情況下的其它GAG，例如硫酸軟骨素和硫酸皮膚素)。GAG例如肝素和/或硫酸乙酰肝素的結構特異切割可用于，例如確定異源GAG制品中的GAG結構。另外，切IllJ可用于，例如從GAG中生產較低分子量的多糖。因此，多形擬桿菌GAG裂解酶可用于產生，例如肝素和硫酸乙酰肝素衍生的寡糖。這樣的肝素和硫酸乙酰肝素衍射的寡糖具有診斷、預防和治療潛能。另外，本文所述的多形擬桿菌GAG裂解酶也在例如與血管生成相關的疾病中具有預防和治療潛能。所述多形擬桿菌GAG裂解酶進一步在體外、離體和/或體內可用于中和肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗凝血和/或抗血栓形成活性。所述多形擬桿菌GAG裂解酶I序列(圖1，SEQ ID NO 1)包括潛在的非翻譯區在長度上大約有1251個核苷酸，包含大約1179個核苷酸的預測的甲硫氨酸起始的編碼序列，其中包括終止密碼子(在圖I中指定為SEQ ID NO :1編碼的核苷酸)。該假定的編碼序列編碼392個氨基酸的蛋白質(SEQ ID NO :2)。其中氨基末端開始于殘基17 (M17)的甲硫氨酸的變體可用于生產重組蛋白質。氨基末端開始于殘基17的甲硫氨酸(M17)的變體也可用于產生重組蛋白質。編碼多形擬桿菌GAG裂解酶I的M17變體的氨基酸序列和核苷酸序列分別描繪于圖3B(SEQID NO 4)和3A(SEQ ID NO 3)中。另外，已產生6X組胺酸融合蛋白以利于純化。包含不同的純化標簽，例如GST、MBP、Trx, DsbC, NusA和生物素也可用于獲得該酶。氨基末端開始于殘基Q26的谷氨酰胺的另一個變體也可用于生產重組蛋白質。編碼多形擬桿菌GAG裂解酶I的Q26變體的氨基酸序列和核苷酸序列分別描繪于圖4B(SEQID NO :23)和4A(SEQ ID NO :22)中。另外，已產生6X組胺酸融合蛋白以利于純化。包含不同的純化標簽，例如GST、MBP、Trx, DsbC, NusA和生物素也可用于獲得該酶。多形擬桿菌GAG裂解酶I與從肝素黃桿菌得到的肝素酶I，至少在一級氨基酸序列水平上共享結構特征(圖2)。多形擬桿菌GAG裂解酶II基因序列(圖5，SEQ ID NO 5)包括終止密碼子(在圖5A中指定為SEQ ID NO 5編碼的核苷酸)在內有大約2001個核苷酸長。該編碼序列編碼666個氨基酸的蛋白質(SEQ ID NO 5B)。氨基末端開始于殘基23 (Q23)處的谷氨酰胺的變體也可用于生產重組蛋白質。編碼多形擬桿菌GAG裂解酶I的Q23變體的氨基酸序列和核苷酸序列分別描繪于圖5B(SEQID NO 8)和5A(SEQ ID NO 7)中。另外，已產生6X組胺酸融合蛋白以利于純化。包含不同的純化標簽，例如GST、MBP、Trx、DsbC、NusA和生物素也可用于獲得該酶。缺失開始于殘基169 (K169)處的賴氨酸而結束于殘基186處的谷氨酸的另一個變體也可用于生產重組蛋白質。編碼多形擬桿菌GAG裂解酶II的K169變體的氨基酸序列和核苷酸序列分別描繪于圖5B(SEQ ID NO 10)和5A(SEQ ID NO 9)中。多形擬桿菌GAG裂解酶II蛋白質與從肝素黃桿菌得到的肝素酶III，至少在它們各自的一級氨基酸序列水平共享許多結構特征。多形擬桿菌GAG裂解酶III序列(圖8，SEQ ID NO 28)大約2690個核苷酸長(包括非翻譯序列)并包含大約2622個核苷酸的預測的甲硫氨酸起始的編碼序列，其中包括終止密碼子。起始和終止密碼子以粗體顯示在圖8中。該編碼序列編碼873個氨基酸的蛋白質(在圖9中的SEQ ID NO. 29)。氨基末端開始于谷氨酰胺殘基23 (Q23)的變體也可用于生產重組蛋白質。該變體的核苷酸序列描繪于SEQ ID NO :33中，而該變體的氨基酸序列顯示于SEQ ID N0:34中。谷氨酰胺23殘基在圖9中加了下劃線，而在圖10中顯示為灰色陰影。另外，已產生6X組胺酸融合蛋白，以利于純化。包含不同的純化標簽，例如GST、MBP、Trx、DsbC, NusA和生物素也可用于獲得該酶。多形擬桿菌GAG裂解酶III與從肝素黃桿菌得到的肝素酶II共同包含一些結構特征和底物特異性。多形擬桿菌GAG裂解酶III蛋白質具有對肝素和硫酸乙酰肝素兩者的底物特異性。另外，其能夠切割硫酸軟骨素和硫酸皮膚素。
多形擬桿菌GAG裂解酶IV序列(圖13，SEQ ID NO 36)大約2109個核苷酸長。起始和終止密碼子在圖15中粗體表示。該編碼序列編碼702個氨基酸的蛋白質(圖14中的 SEQ ID NO 37)。
氨基末端開始于氨基酸殘基20(D20)處的天冬氨酸的變體也可用于生產重組蛋白質。該變體的核苷酸序列描繪在SEQ ID NO :38中，而該變體的氨基酸序列顯示在SEQ IDNO 39中。天冬氨酸20殘基的密碼子在圖13中加了下劃線，而天冬氨酸20在圖14中顯示為灰色陰影。另外，已產生6X組胺酸融合蛋白以利于純化。包含不同的純化標簽，例如GST、MBP、Trx、DsbC, NusA和生物素也可用于獲得該酶。多形擬桿菌GAG裂解酶IV蛋白質包含與從多形擬桿菌得到的其它GAG裂解酶或從肝素黃桿菌得到的肝素 酶相似的有限序列。另外，多形擬桿菌GAG裂解酶IV蛋白質具有與從多形擬桿菌得到的其它GAG裂解酶或從肝素黃桿菌得到的肝素酶不同的底物特異性。例如，其切割在科學文獻中報道的、通常在大部分天然肝素和/或硫酸乙酰肝素通常不出現的二或四糖。由于本發明的多形擬桿菌GAG裂解酶多糖可以調節肝素和/或硫酸乙酰肝素介導的活性，因此，它們可用于多種預防性和治療性應用，以及開發用于肝素和/或硫酸乙酰肝素介導的或和相關疾病的新的預防和治療試劑。如本文中所用的，“GAG裂解酶活性”、“GAG裂解酶的生物活性”或“GAG裂解酶的功能活性”指多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質、多肽或核酸分子在生理環境中發揮出的活性。例如GAG裂解酶活性可以是由多形擬桿菌GAG裂解酶對例如GAG裂解酶底物例如肝素或硫酸乙酰肝素中的糖苷鍵發揮出的活性。可在體內或體外測定GAG裂解酶的活性。預測本發明的多形擬桿菌GAG裂解酶分子具有與從肝素黃桿菌得到的多種肝素酶相似的生物活性。例如，本發明的多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質具有一種或多種以下活性(I)結合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一種或多種糖鍵，例如以與在切割位點產生具有C4和C5位置之間的不飽和鍵的糖醛酸(例如Λ 4，5)相同的方式；(3)調節，例如增加或降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性；以及(4)降低或消除血管生成。在一些方面，多形擬桿菌GAG裂解酶I具有與從肝素黃桿菌得到的肝素酶I相似，但不相同的生物活性。例如，多形擬桿菌GAG裂解酶I具有一種或多種以下活性(I)結合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一種或多種糖苷鍵，例如切割與硫酸化糖醛酸有關的一種或多種糖苷鍵，例如2-0糖醛酸；切割與硫酸化的氨基己糖有關的一種或多種糖苷鍵，例如6-0-硫酸酯和/或N-磺胺；(3)例如與參考標準比較時，降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，參考標準例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些實施方案中，當維持抗IIa活性時，降低抗Xa活性。在一些實施方案中，降低抗Xa活性和抗IIa活性。在一些方面中，多形擬桿菌GAG裂解酶III具有與從肝素黃桿菌得到的肝素酶II相似，但不相同的生物活性。例如，多形擬桿菌GAG裂解酶III具有一種或多種以下活性(I)結合肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素和/或硫酸皮膚素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一種或多種糖苷鍵，例如切割硫酸化氨基己糖例如N-硫酸化的和/或6-0硫酸化的或未硫酸化的但乙酰化的氨基己糖(例如HNAc)和硫酸化的糖醛酸例如2-0硫酸化的糖醛酸或者未硫酸化的糖醛酸之間的一種或多種糖苷鍵；⑶例如與參考標準比較時，降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，參考標準例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些實施方案中，當可能維持抗IIa活性時，降低抗Xa活性。在其它的實施方案中，同時降低抗Xa活性和抗IIa活性。因此，多形擬桿菌GAG裂解酶分子，例如多形擬桿菌GAG裂解酶I和/或多形擬桿菌GAG裂解酶III分子可作為新型治療性試劑用于控制肝素相關的疾病。這樣的疾病的實例包括肝素誘導的抗凝血和/或血管生成。例如，多形擬桿菌GAG裂解酶分子，例如多形擬桿菌GAG裂解酶I和/或多形擬桿菌GAG裂解酶III分子，可用于例如在手術中或手術后降低或消除(例如中和)肝素和/或硫酸乙酰肝素的一種或多種抗凝血特性。在其它的實施方案方案中，多形擬桿菌GAG裂解酶分子，例如多形擬桿菌GAG裂解酶I和/或多形擬桿菌GAG裂解酶III，可用于對血液去肝素化，例如在生物反應器中，例如在心肺和/或腎透析中使用的生物反應器。在一些方面，多形擬桿菌GAG裂解酶II具有與從肝素黃桿菌得到的肝素酶III相似，但不相同的生物活性。例如，多形擬桿菌GAG裂解酶II具有一種或多種以下活性(I)結合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一種或多種糖苷鍵，例如切割硫酸化的和未硫酸化的一種或多種糖苷鍵；(3)例如與參考標準比較時，增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，參考標準例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些實施方案中，當降低抗IIa活性時,維持或可能增加抗Xa活性。在其它實施方案中，當維持抗Xa活性時，增加抗IIa活性。在一些方面，多形擬桿菌GAG裂解酶IV具有與其他從多形擬桿菌得到的GAG裂解酶和從肝素黃桿菌得到的肝素酶不同的生物活性，例如底物特異性。例如，多形擬桿菌GAG裂解酶IV具有一種或多種以下活性(I)結合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一種或多種糖苷鍵，例如切割低至中等硫酸化密度的一種或多種糖苷鍵，特別是與2-0-硫酸化的糖醛酸和鄰近的乙酰化有關的鍵葡糖胺(在多數天然肝素和/或硫酸乙酰肝素制品中不經常發現)；(3)例如與參考標準比較時，增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，參考標準例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些實施方案中，當維持或降低抗IIa活性時，增加抗Xa活性。在其它實施方案中，當維持抗Xa活性時，增加抗IIa活性。因此，這樣的多形擬桿菌GAG裂解酶分子，例如多形擬桿菌GAG裂解酶II和多形擬桿菌GAG裂解酶IV分子可用于制備用于治療凝血和/或血栓形成的肝素和/或硫酸乙酰肝素制品。這樣的疾病的實例包括溶解或抑制血栓的形成，治療和預防以下所產生的病癥心臟和中央神經系統血管梗塞、動脈硬化、血栓形成、心肌梗塞、心律不整(arrythmias)、心房震顫(atrial fibrillation)、心絞痛、不穩定性心絞痛、頑固性心絞痛、充血性心力衰竭、彌散性血管內凝血、經皮冠狀動脈干預(percutaneous coronary intervention,PCI)、冠狀動脈旁路移植手術(coronary artery bypass graft surgery, CABG)、再灌注的冠狀旁路的再閉塞或再狹窄(reocclusion or resenosis of reperfused coronary arteries)、 風濕熱、中風、暫時性缺血性發作、血栓性中風、栓塞性中風(embolic stroke)、深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis)、肺栓塞(pulmonary embolism)、偏頭痛、過敏癥、哮喘、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory stree syndrome, ARDS)、囊腫性纖維化、眼部的新血管生成、骨質疏松癥、牛皮癬、關節炎(風濕性或成骨性)、阿爾茨海默癥、骨折、大手術/外傷、燒傷、外科過程、移植(例如骨髓移植)、臀部替換(hip replacement)、膝蓋替換(knee replacement)、敗血病、敗血病性休克、懷孕、遺傳性疾病例如血友病。在其他實施方案中，多形擬桿菌GAG裂解酶分子，例如多形擬桿菌GAG裂解酶II和/或多形擬桿菌GAG裂解酶IV分子，可用于治療或預防細胞增殖性或分化性疾病，例如通過阻止或抑制表現出不需要的增殖和/或分化或者另外與不需要的增殖和/或分化相關的細胞的血管生成。細胞增殖性或分化性疾病的實例包括糖尿病；關節炎，例如風濕性關節炎；眼病，例如眼部新血管生成，糖尿病視網膜病變，新生血管性青光眼，晶體后纖維增生癥(retrolental fibroplasia),色素膜炎(uveitis),與脈絡膜新生血管(choroidalneovascularization)有關的眼病，與虹膜新血管生成相關的眼病；癌，例如腫瘤、肉瘤、轉移疾病或造血瘤疾病，例如白血病。
在其他實施方案中，多形擬桿菌GAG裂解酶分子，例如多形擬桿菌GAG裂解酶III分子，可用于制備硫酸軟骨素和/或硫酸皮膚素制品。多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質，其片段，以及其SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :6、SEQID N0:29或SEQ ID NO :37中序列的衍生物和其它變體都稱為“本發明的多肽或蛋白質”或“多形擬桿菌GAG裂解酶多肽或蛋白質”。編碼這些多肽或蛋白質的核酸分子都稱為“本發明的核酸”或“多形擬桿菌GAG裂解酶核酸”。“多形擬桿菌GAG裂解酶分子”指多形擬桿菌GAG裂解酶核酸、多肽和抗體。如本文中所用的，術語“核酸分子”包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)，RNA分子(例如mRNA)和DNA或RNA的類似物。可從核苷酸類似物合成DNA或RNA類似物。DNA分子可以是單鏈的或者雙鏈的，但優選是雙鏈DNA。術語“分離的核酸分子”或“純化的核酸分子”包括與核酸的天然來源中的其它核酸分子分離的核酸分子。例如，對于基因組DNA，術語“分離的”包括從該基因組DNA與之天然相關的染色體上分離的核酸分子。優選地，“分離的”核酸在該核酸來源的有機體的基因組DNA內，沒有天然位于其側翼的序列(例如，位于該核酸5’和/或3’端的序列)。例如，在多個實施方案中，所述分離的核酸分子包含小于5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb的5'和/或3'核苷酸序列，在該核酸來源的細胞基因組DNA中，所述核苷酸序列天然位于該核酸分子的側翼。而且，“分離的”核酸分子，例如cDNA分子，可基本上沒有通過重組技術生產時的其它細胞材料或培養基，或者當化學合成時，基本上沒有化學前體或化合物。如本文所用的，術語“在嚴格條件下雜交”描述了雜交和洗滌條件。嚴格雜交條件是在6 X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，在大約45°C下的雜交，其后在65°C的0.2 X SSC、0. I % SDS中洗漆2次。雜交條件是本領域技術人員已知的，并可在Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6 中找到。水相和非水相方法(aqueous and nonaqueous methods)描述在該參考文獻中，并可使用其中任一種。雜交條件的其它實例如下1)低嚴格性，在6XSSC中，在大約45°C下雜交，其后在55°C的0. 2XSSC.0. 1% SDS中洗滌一次或多次；2)中等嚴格性，在6XSSC中，在大約45°C下雜交，其后在60°C的0. 2XSSC、0. I % SDS中洗滌一次或多次；以及優選的3)高嚴格性，在6X SSC中，在大約45 °C下雜交，其后在65 °C的0. 2 X SSC、0. I % SDS中洗滌一次或多次。特別優選的嚴格條件(以及如果實施者不確定應該使用使用什么樣的條件來測定分子是否在本發明的雜交限制內，應使用的條件)是在65°C、0. 5M磷酸鈉、7% SDS，其后在65°C的0. 2XSSC、0. 1% SDS中洗滌一次或多次。優選，本發明的分尚的核酸分子，其在嚴格條件下雜交與SEQ ID N0:l、5、28或36的序列雜交，對應于天然存在的核酸分子。如本文中 所用的，“天然的存在的”核酸分子指具有在天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子。例如天然存在的核酸分子可編碼天然蛋白質。如本文所用的，術語“基因”和“重組基因”指包括至少一個編碼多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的可讀框的核酸分子。該基因任選地還包括非編碼序列，例如調控序列和內含子。“分離的”或“純化的”多肽或蛋白質基本上沒有來自該蛋白質來源的細胞或組織的細胞材料或其它污染蛋白質，或者基本上沒有化學合成時的化學前體或其它化合物。“基本上沒有”表示多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的制品至少是10%純的。在優選的實施方案中，多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的制品中少于大約30%、20 %、10%并且更優選地是5%(干物質重量比)的非多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質(在本文中也引述為“污染蛋白質”)，或者化學前體或非多形擬桿菌GAG裂解酶化學品。當多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質或其生物活性部分重組生產時，其也優選基本上沒有培養基，即培養基占蛋白質制品的體積少于大約20%、更優選地少于10%，并且最優選地少于5%。本發明也包括干重至少為0. 01、
0.1、1. 0和10毫克的分離的或純化的制品。“非必需”氨基酸殘基是可從多形擬桿菌GAG裂解酶的野生型序列中改變而不破壞或實質上改變GAG裂解酶活性的殘基。優選地，所述改變不實質上改變GAG裂解酶的活性，例如該活性至少是野生型的20 %、40 %、60 %、70 %或80 %。“必需”氨基酸殘基是當從多形擬桿菌GAG裂解酶的野生型序列中改變時，導致GAG裂解酶活性破壞從而具有少于20%野生型活性的殘基。例如，預測多形擬桿菌GAG裂解酶的保守氨基酸殘基特別經不起改變。“保守氨基酸取代”是其中該氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基所取代。本領域定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組胺酸)、具有酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、3-分支側鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組胺酸)。因此，多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質中預測的的非必需氨基酸殘基優選被來自相同側鏈家族的另一個氨基酸殘基替換。可選地，在另一個實施方案中，可在多形擬桿菌GAG裂解酶編碼序列的全長或部分中通過例如飽和誘變引入突變，并以GAG裂解酶生物活性篩選所得突變體以鑒定保留活性的突變體。SEQ ID NO USEQ ID NO :5、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :36 誘變后，重組表達所編碼的蛋白質并確定該蛋白質的活性。如本文所用的，多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的“生物活性部分”包括多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的片段，其參與相互作用例如分子間相互作用。分子間相互作用可以是結合相互作用或酶促相互作用(例如該相互作用可以是瞬時的，并且形成或破壞共價鍵)。分子間相互作用可在GAG裂解酶多形擬桿菌分子和非多形擬桿菌GAG裂解酶分子例如肝素、硫酸乙酰肝素及其片段之間。多形 擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的生物活性部分包括含有與多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質基本上同源或由其衍生的氨基酸序列的肽，例如SEQ IDNO :2、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :29和SEQ ID NO :37所示的氨基酸序列，其包括少于全長多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的氨基酸，并且表現出至少一種GAG裂解酶蛋白質活性。通常，生物活性部分包括具有至少一種GAG裂解酶蛋白質活性的結構域或基序，例如肝素、硫酸乙酰肝素及其片段的解聚作用(例如，以位點特異性方式)，肝素、硫酸乙酰肝素及其片段對糖苷鍵的切割，降低或消除抗凝血活性，例如肝素、硫酸乙酰肝素及其片段的抗凝血活性。多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的生物活性部分可以是例如長度為10、25、50、100、200、300、400、500或更過多個氨基酸的多肽。如下進行序列間的同源性或序列同一性(這兩個術語在本文中可交換使用)的計
笪為確定兩個氨基酸序列或兩個氨基酸序列的百分比同一性，比對所述序列獲得最佳比較目的(例如缺口(gap)引入至第一和第二氨基酸和核酸序列的一個或兩個中用于最佳比對，而針對比較目的，忽視非同源序列)。兩個序列間的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的數量的函數，其中考慮到缺口的數量，以及對于兩個序列的最佳比對而需要弓IA的每一個缺口的長度。為了確定分子是否在本文的序列同一性或同一性限制范圍內，通過Needleman and Wunsch ((1970) J. MoI. Biol. 48 :444-453)的數學算法確定百分比同一性，通過在GCG軟件套裝(來自http://www.gcg.com)的GAP程序完成,并使用下述參數缺口罰分為12的Blossum 62得分矩陣、缺口延伸罰分為4，并且移碼缺口罰分是5。在優選的實施方案中，出于比較目的而比對的參考序列的長度是該參考序列的長度的至少30%，優選至少40%、更優選至少50%、60%，以及更優選地至少70%、80%、90%、100%。隨后比較在相應氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸。當第一序列中某一位置被第二序列上相應位置的相同氨基酸殘基或核苷酸占據時，則該分子在此位置上是相同的(如本文所用的，氨基酸或核酸“同一性”與氨基酸或核酸“同源性”是等價的)。為了分析有關多形擬桿菌GAG裂解酶分子的生物序列，除了上述的Needleman和Wunsch算法外使用以下對比程序。兩個氨基酸或核苷酸序列間的百分比同一性可使用E. Meyers and ff. Miller ((1989) CABI0S, 4 :11-17)的算法來測定，使用 PAM120 加權殘基表、缺口長度罰分是12、并且缺口罰分是4，其已經被并入ALIGN程序(2.0版)。本文所述的核酸和蛋白質序列可用作“查詢序列”以執行針對公共數據庫的搜索，以例如鑒定其它家族成員或相關的序列。可使用Altschul，et al. (1990) J. MoI. Biol. 215 403-10的NBLAST和XBLAST程序(2. 0版)進行這樣的搜索。BLAST核苷酸搜索可使用NBLAST程序(得分=100，字長=12)進行，以獲得與本發明的多形擬桿菌GAG裂解酶核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可使用XBLAST程序(評分=50，字長=3)進行，以獲得與本發明的多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白分子同源的氨基酸序列性。為了獲得用于比較目的的缺口比對，如 Altschul et al, (1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402 的描述使用缺口的BLAST。當使用BLAST和缺口的BLAST程序時，使用各個程序(例如XBLAST和 NB LAST)的缺省參數。參見 http://www. ncbi. nlm. nih. gov。本發明的具體的多形擬桿菌GAG裂解酶多肽具有與SEQ ID Nos :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的氨基酸序列充分相同的氨基酸序列。在氨基酸序列中，本文使用術語“充分相同”或“基本上相同”指包含足夠的或最小數量的氨基酸殘基的第一氨基酸，所述氨基酸殘基i)與第二氨基酸序列中的比對氨基酸殘基相同，或者ii)是第二氨基酸序列中的比對氨基酸殘基的保守替換，從而該第一和第二氨基酸序列具有共同的結構折疊和/或共同的功能性活性。例如，含有具有至少大約60 %或65 %同一性，可能是75 %同一性，更可能是85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的共同結構性結構域的氨基酸序列被稱作充分或基本上相同。在核苷酸序列中，本文使用術語“充分相同”或“基本上相同”指包含足夠的或最小數量的核苷酸的第一核酸，所述核苷酸與第二核酸序列中比對的核苷酸相同，從而該第一和第二核苷酸序列具有相同的功能活性或編碼共同的結構性多肽折疊或共同的功能多肽活性。本文所教導的方法有時根據肝素樣粘多糖(HLGAG)來描述，但本文所教導的特性可擴展到其它多糖。如本文所用的，術語“HLGAG”和“糖氨聚糖”(GAG)可交換地用于指具有肝素樣結構和特性的分子家族，其通常在本文中稱為“肝素”。這些分子包括，但不局限 于低分子量肝素(low molecular weight heparin,LMWH)、未分級肝素、生物技術制備的肝素、化學修飾的肝素、合成肝素如五糖(例如ARIXTRATM)、肝素模擬物和硫酸乙酰肝素。術語“生物技術肝素”包括從經過化學修飾的多糖的天然來源制備的肝素，并描述于Razi etal.，Bioche. J. 1995 JuI 15 ；309(Pt 2) :465-72 中。化學修飾的肝素描述于 Yates et al.，Carbohydrate Res (1996) Nov 20 ；294 :15-27中，并且是本領域技術人員已知的。合成的肝素是本領域技術人員熟知的并描述于Petitou, M. et al.，Bioorg Med Chem Lett. (1999)Apr 19 ；9 (8) :1161-6和 Vlodavsky et al. , Int. J. Cancer, 1999,83 :424-431 中。合成肝素的實例是磺達肝癸鈉(Fondaparinux)。磺達肝癸鈉(ARIXTRATM)是對應于AT-III結合位點的5個單位的合成的粘多糖。硫酸乙酰肝素指包含與肝素相似的二糖重復單位的粘多糖(Glycoaminoglycan),但其具有更多的N-乙酰基團和更少的N-和O-硫酸基團。肝素模擬物是具有至少一種肝素的生物活性(即，抗凝血、抑制癌癥、治療肺病等)的單糖(例如硫糖鋁)、寡糖和多糖。優選，這些分子是高度硫酸化的。肝素模擬物可以是天然存在的、合成的或化學修飾的(Barchi，JJ.，Curr. Pharm. Des. , 2000,Mar, 6 (4) :485-501)。術語“HLGAG”也包括上述HLGAG分子的功能性變體。這些功能性變體具有相似的結構，但包括對該結構的輕微修飾，從而使得該分子保留其大部分生物活性或者具有提高的生物活性。如本文所用的“LMWH”指具有平均分子量小于8000Da的硫酸化粘多糖(GAG)的制品，LMWH制品的大約至少60%的寡糖鏈具有小于8000Da的分子量。幾種LMWH可購買獲得，但也可例如使用HLGAG降解酶從肝素中制備LMWH。HLGAG降解酶包括，但不局限于肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、肝素酶IV、乙酰肝素酶、D-葡醛酸糖苷酶和L-艾杜糖醛酸酶。這3種來自肝素黃桿菌的肝素酶是已經用于產生LMWH(5，000-8, OOODa)和超低分子量肝素(_3，OOODa)的酶工具。另外，可使用例如本文所述的多形擬桿菌GAG裂解酶多肽制備LMWH。市售的LMWH包括，但不局限于依諾肝素(enoxaparin)(商標名稱為 Lovenox ；Aventis Pharmaceuticals)、達月干素(dalteparin) (Fragmin,Pharmacia and Upjohn)、舍托月干素(certoparin) (Sandobarin, Novartis)，阿地月干素(ardeparin)(Normiflo, Wyeth Lederle)、那屈月干素(nadroparin) (Fraxiparine,Sanofi-ffinthrop),帕月干素(parnaparin)(Fluxum, Wassermann)> 瑞月干素(reviparin)(Clivarin,Knoll AG)和亭扎月干素(tinzaparin) (Innohep,Leo Laboratories，Logiparin，Novo Nordisk)。LMWH的一些優選形式包括依諾肝素(Lovenox)和達肝素(Fragmin)。如本文所用的術語"戊聚糖鈉(Arixtra)"指包括甲基0_2_脫氧-6-0-硫代-2-(磺胺基)-a-D-吡喃葡糖基-(I — 4)-0-0-D-吡喃葡糖基-(I — 4)-0-2-二氧-3，6-二-硫代-2-(磺胺基)-a -D-批喃葡糖基-(I — 4) -0-2-0-硫代-a -L-艾杜吡喃葡糖基(idopyranuronosyl) - (I — 4)_2_ 二氧-6-0-硫代 _2_(磺胺基)_ a -D-卩比喃葡糖苷、其十鈉鹽和衍生物的的合成的五糖的組合物，如本文所用的，“合成的肝素”或“合成的HLGAG”指HLGAG示合成的化合物，并且不是由肝素的片段衍生的。制備肝素的方法提供于，例如Petitou et al. (1999)Nature 398 :417中，其內容通過引用并入本文。如本所用的，“錯誤表達或異常表達”指在RNA或蛋白質水平上基因表達的非野生型形式。其包括非野生型水平的表達，即過量表達或低表達；在該基因表達的時間或階段 方面，不同于野生型的表達形式，例如在預定的發育時期或階段增加或降低的表達(與野生型相比)；在預定的細胞類型或組織類型中在改變的表達(與野生型相比)方面，不同于野生型的表達形式；，在所表達的多肽的剪接長度、翻譯的氨基酸序列、翻譯后修飾或生物活性方面，不同于野生型的表達形式；在該基因表達的環境刺激或細胞外刺激的作用方面，不同于野生型的表達形式，例如在該刺激的強度增加或降低的情況下增加或降低的形式(與野生型相比)。如本文所用的，“受試者”指哺乳動物生命體。在優選的實施方案中，受試者是人。在另一個實施方案中，受試者是試驗動物或適于作為疾病模型的動物。這些受試者的非限定性實例包括小鼠(mice)、大鼠(rates)和兔(rabbits)。受試者也可以是非人動物,例如馬(hourse)、牛(cow)、山羊(goat)和其它家畜(domestic animal)。以下更詳細地描述本發明的多個方面。分離的核酸分子一方面，本發明提供了分離的或純化的的核酸分子，其編碼本文描述的多形擬桿菌GAG裂解酶多肽，例如多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質或其片段，例如多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的生物活性部分。也包括適用于作為雜交探針的核酸片段，其用于，例如鑒定編碼本發明的多肽的核酸分子、多形擬桿菌GAG裂解酶mRNA和適用于作為探針的片段例如用于擴增和突變核酸分子的PCR引物。在一個實施方案中，本發明的分離的核酸分子包括SEQ ID NO U SEQ ID NO :5、SEQ ID N0:28或SEQ ID NO :37所示的核苷酸序列或任何這些核苷酸序列的一部分。在一個實施方案中，該核酸分子包括編碼多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的序列(即，SEQ ID NOUSEQ ID NO :5、SEQ ID NO :28或SEQ ID NO 36的“編碼區”)，以及5，非翻譯序列。可選地，該核酸分子不包括正常伴隨該目標序列(subject sequence)的側翼序列。在另一個實施方案中，本發明的分離的核酸分子包括為SEQ ID NO U SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :28或SEQ ID NO :36所示的核苷酸序列或任何這些核苷酸序列的一部分互補物(complement)的核酸分子。在其它實施方案中，本發明的核酸分子與SEQ ID N0U SEQ ID NO :5、SEQ IDN0:28或SEQ ID NO :37所示的核苷酸序列充分互補，從而其可與SEQ ID NO USEQ ID NO:5、SEQ ID NO 28或SEQ ID NO 37所示的核苷酸序列雜交，而形成穩定的雙鏈體。在一個實施方案中，本發明的分離的核酸分子包括與SEQ ID NO USEQ ID NO :5、SEQ ID NO :28或SEQ ID NO :36所示的核苷酸序列的全長或任何這些序列的一部分優選相同長度的部分具有至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%、99%或更高的同源性。本發明的核酸分子可僅包括SEQID NO USEQ ID NO :5、SEQ ID NO :28或SEQ IDNO 36的核酸序列的一部分。核酸包括那些包括編碼序列的部分或全部并延長至5’或3’非編碼區域之一(或兩者)的核苷酸序列。其它的實施方案包括片段，其包括編碼本文所述氨基酸片段的核苷酸序列的片段，特別是其在長度上具有至少100個氨基酸的片段。片段也包括對應于上述具體氨基酸序列或其片段的核酸序列。核酸片 段不應直譯為包括那些在本發明前已公開的片段。可通過分離SEQ ID NO :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核苷酸序列的一部
分一所述核苷酸序列的一部分編碼具有GAG裂解酶生物活性(例如在本文中描述的GAG裂解酶蛋白質的生物活性)的多肽、通過表達多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的編碼部分(例如通過體外重組表達)以及通過評估多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的編碼部分的活性，來制備編碼“多形擬桿菌GAG裂解酶多肽的生物活性部分”的核酸片段。編碼多形擬桿菌GAG裂解酶多肽的生物活性部分的核酸片段包括長度上大于300或更多個核苷酸的核苷酸序列。在優選的實施方案中，核酸分子其在長度上包括大約100、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900 或更多個核苷酸，在嚴格雜
交條件下與SEQ ID NO :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核酸分子的核苷酸序列雜交。本發明包括不同于SEQ ID NO :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38所示的核苷酸序列的核酸分子。這些差異源于遺傳密碼的兼并性(并產生編碼與本文所公開的核苷酸序列編碼的蛋白質相同多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的核酸)。在另一個實施方案中，本發明的分離的核酸分子具有編碼蛋白質的核苷酸序列，所述蛋白質具有至少I個，但少于5、10、20、50或100個SEQ ID N0:2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸殘基不同的氨基酸序列。如果對這種比較需要進行比對，則應當針對最大同源性比對該序列。認為來自缺失或插入或錯配的“成環”序列是不同的。對于具有具體表達系統的優選或非優選的密碼子，可選擇發明人的核酸。例如，該核酸可以是這樣一種核酸，即，在該核酸中，至少一個密碼子，優選地至少10%%或20%%的密碼子被改變，使得該序列對于在大腸桿菌、酵母、人、昆蟲或CHO細胞中表達是最佳的。核酸變體可以是天然存在的，例如等位基因變體(相同的基因座)和同系物(不同的基因座)，或者可以是非天然存在的。非天然存在的變體可通過誘變技術產生，其中包括那些應用于多核苷酸、細胞或生命體的技術。所述變體可包含核苷酸取代、缺失、倒置和插入。變體可發生在編碼和非編碼區域之一或兩者上。所述變體既可產生保守的氨基酸取代也可產生非保守的氨基酸置換(如在所編碼的產物中比較的)。在優選的實施方案中，該核酸不同于SEQ ID NO :1、3、5、7、9、22、28、33、36或38的核酸在于如下至少一個，但不多于10、20、30或40個核苷酸；至少一個，但不多于1%、5 %、10 %或20 %的目標核酸中的核苷酸。如果對于該分析，此是必須需，則應當針對最大同源性比對該序列。認為來自缺失或插入或錯配的“成環”序列是不同的。可使用本領域已知的方法鑒定同系物和等位基因變體。這些變體包括編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列或這些序列的片段具有50%、至少大約70-75%，通常至少大約70-75%，更典型地至少大約80-85 %，并且最通常至少大約90-95 %的同一性。由于這些核酸分子能夠在嚴格條件下，與編碼 SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :6、SEQ ID、NO :29 或 SEQ ID NO 37 所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者所述序列的片段雜交，所以這些核酸分子易于鑒定。對應于本發明的多形擬桿菌GAG裂解酶DNA的同系物和等位基因變體的核酸分子可通過定位于與多形擬桿菌GAG裂解酶基因相同的染色體或基因座進行分離。優選的變體包括那些與本文所述的GAG裂解酶活性相關的變體。多形擬桿菌GAG裂解酶的等位基因變體包括功能性和非功能性蛋白質兩者。功能性等位基因變體是維持一種或多種GAG裂解酶活性的群體中的多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的天然氨基酸序列變體。功能性等位基因變體通常僅包含SEQ ID N0:2、6、29或37的一個或多個氨基酸的保守取代，或者包含該蛋白質的非關鍵區域內非關鍵殘基的取代、缺失 或插入。功能性變體的實例包括本文所述的M17、Q26、Q23、K169和D20變體(即分別是SEQID NOs :4、23、8、10和39)，以及GAG裂解酶III的Q23變體(SEQ ID NO :34)。非功能性等位基因變體是不具有一個和多個本文所述的GAG裂解酶活性的群體中的多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的5個天然氨基酸序列。非功能性等位基因變體通常包含SEQ ID N0:2、SEQ IDNO :6、SEQ ID NO 29或SEQ ID NO 37的氨基酸序列的非保守取代、缺失或插入，或未成熟的截短，或者包含該蛋白質的關鍵殘基或者關鍵區域中的取代、插入、或缺失。而且，本發明包括編碼其它多形擬桿菌GAG裂解酶家族成員的核酸分子，并且，其因此其有不同于SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :29或SEQID NO :37的多形擬桿菌GAG裂解酶序列。分離的多形擬桿菌GAG裂解酶多肽另一個方面，本發明的特征在于分離的多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質及其片段，例如其生物活性部分。可使用標準蛋白質純化技術從細胞或組織來源分離多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質。可通過重組DNA技術或化學合成來產生多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質及其片段。本發明的多肽包括那些產生自多重基因的存在、選擇性轉錄事件、選擇性RNA剪接事件和選擇性翻譯和翻譯后事件的那些多肽。多肽可在系統中表達，例如培養的細胞，其導致基本上與當該表達的多肽在天然細胞中表達時具有的相同的翻譯后修飾；或者多肽在導致翻譯后修飾的改變或省略的系統中表達，例如當在天然細胞中表達時存在的糖基化或切割。在優選的實施方案中，多形擬桿菌GAG裂解酶多肽具有一種或多種以下特征(I)結合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一種或多種糖苷鍵；
(3)調節，例如增加或降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性；以及
(4)降低或消除血管生成。在一些實施方案中，多形擬桿菌GAG裂解酶是多形擬桿菌GAG裂解酶I，并且多形擬桿菌GAG裂解酶I具有一種或多種以下活性⑴結合肝素和/或硫酸乙酰肝素；⑵切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一種或多種糖苷鍵，例如切割一種或多種硫酸化糖醛酸的糖苷鍵，例如2-0糖醛酸；切割一種或多種涉及硫酸化的氨基己糖的糖苷鍵，例如6-0-硫酸酯和/或N-磺胺；(3)降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如與參考標準比較時，參考標準例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些實施方案中，維持當抗IIa活性時，抗Xa活性降低。在其它的實施方案中，同時降低抗Xa活性和抗IIa活性。在一些實施方案中，多形擬桿菌GAG裂解酶是多形擬桿菌GAG裂解酶II，并且多形擬桿菌GAG裂解酶II具有一種或多種以下活性(I)結合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一種或多種糖苷鍵，如切割一種或多種硫酸化的和未硫酸化的糖醛酸的糖苷鍵；(3)增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如與參考標準比較時，參考標準例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些實施方案中，當降低抗IIa活性時，維持或增加抗Xa活性。在其它的實施方案中，當維持抗Xa活性時，增加抗IIa活性。在一些實施方案中，多形擬桿菌GAG裂解酶是多形擬桿菌GAG裂解酶III，并且多形擬桿菌GAG裂解酶III具有一種或多種以下活性(I)結合肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素和/或硫酸皮膚素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一種或多種糖苷鍵，例如切割硫酸化的氨基己糖(例如N-硫酸化的和/或6-0硫酸化的)或未硫酸化的、但乙酰化的氨基己糖(例如HNAc)和硫酸化的糖醛酸例如2-0硫酸化的糖醛酸或者未硫酸化的糖醛酸之間的一種或多種糖苷鍵；(3)降低肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性，例如與參考標準比較時，參考標準例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些實施方案中，當維持抗IIa活性時，降低抗Xa活性。在其它的實施方案中，同時降低抗Xa活性和抗IIa活性。在一些實施方案中，多形擬桿菌GAG裂解酶是多形擬桿菌GAG裂解酶IV，并且多形擬桿菌GAG裂解酶IV具有一種或多種以下活性(I)結合肝素和/或硫酸乙酰肝素；(2)切割肝素和/或硫酸乙酰肝素的一種或多種糖苷鍵，例如切割低至中等硫酸化密度的一種或多種糖苷鍵，特別是涉及2-0硫酸化的糖醛酸和鄰近的乙酰化葡糖胺的鍵(在大多數天然存在的肝素和/或硫酸乙酰肝素制品中不經常發現)；(3)增加肝素和/或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性,例如與參考標準比較時,參考標準例如是市售肝素或硫酸乙酰肝素或者切割前的肝素或硫酸乙酰肝素的抗Xa活性和/或抗IIa活性。在一些實施方案中，當維持或降低抗IIa活性時，增加抗Xa活性。在其它的實施方案中，當維持抗Xa活性時，增加抗IIa活性。在優選的實施方案中，多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質或其片段不同于SEQ ID NO2、4、6、8、10、23、29、34、37或39中的相應序列。在一個實施方案中，其至少有一個氨基酸不同，但不同的氨基酸不多于15、10或5個。在另一個實施方案中，其與SEQ ID N0:2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的相應序列至少有一個氨基酸不同，但不同的氨基酸不多于其殘基的20%、15%、10%或5% (如果此比較需要比對，應當針對最大同源性比對該序列。認為來自缺失或插入或錯配的“成環”序列是不同的)。所述不同優選是在非必需殘基或者保守取代處的不同或變化。其他實施方案包括在氨基酸序列中含有一種或多種變化的蛋白質，例如在對活性不是必須的氨基酸殘基中的變化。這樣的多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質在氨基酸序列上不同于 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37 或 39，但保留了生物活性。、
在一個實施方案中，該蛋白質包括與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39至少具有 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或更高同源性的
氨基酸序列。其中該蛋白質的區域被刪除的生物活性部分可通過重組技術制備，并評估其天然多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的一種或多種功能性活性。在優選地實施方案中，該多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質具有SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39所示的氨基酸序列。在其他的實施方案中，該多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39基本上相同。仍然在另一個實施方案中，該多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39基本上相同，并且保留了如在上文的部分中詳細描述的SEQ ID NO :2、4、6、8、10、23、29、34、37或39的蛋白質的功能性活性。 另一方面，本發明提供了多形擬桿菌GAG裂解酶嵌合或融合蛋白質。如本文所用的，多形擬桿菌GAG裂解酶“嵌合蛋白質”或“融合蛋白質”包括連接與非多形擬桿菌GAG裂解酶多肽的多形擬桿菌GAG裂解酶多肽。“非多形擬桿菌GAG裂解酶多肽”指具有具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列對應于基本上不與多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質同源的蛋白質，例如不同于多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質并且來自相同或不同的生命體的蛋白質。所述融合蛋白質的多形擬桿菌GAG裂解酶多肽相當于多形擬桿菌GAG裂解酶氨基酸序列的全部或一部分，例如本文描述的片段。在優選的實施方案中，多形擬桿菌GAG裂解酶融合蛋白質包括多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的至少一個(或兩個)生物活性部分。所述非多形擬桿菌GAG裂解酶多肽可與所述多形擬桿菌GAG裂解酶多肽的N末端或C末端融合。該融合蛋白質包括對配體具有高親和力的部分。例如，該融合蛋白質是GST-多形擬桿菌GAG裂解酶融合蛋白質，其中所述多形擬桿菌GAG裂解酶序列融合到GST序列的C末端。這樣的融合蛋白質有助于重組多形擬桿菌GAG裂解酶的純化。可選地，該融合蛋白質是在其N末端含有異源信號序列的多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質。在某些宿主細胞(例如哺乳動物宿主細胞)中，可通過使用異源信號序列來提高多形擬桿菌GAG裂解酶的表達和/或分泌。而且，本發明的多形擬桿菌GAG裂解酶-融合蛋白質可用作免疫原以在受試者中生產抗多形擬桿菌GAG裂解酶抗體，從而純化多形擬桿菌GAG裂解酶配體，并在篩選分析中鑒定抑制多形擬桿菌GAG裂解酶與多形擬桿菌GAG裂解酶底物相互作用的分子。表達載體可購買獲得的，并且已經編碼融合部分(例如GST多肽)。可以將編碼多形擬桿菌GAG裂解酶的核酸克隆入這樣的表達載體，使得該融合部分框內連接至多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質。在另一方面，本發明的特征也在于多形擬桿菌GAG裂解酶多肽的變體，例如其可作為拮抗劑(模擬物)發揮作用的突變體。多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的變體可通過誘變產生，例如多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的序列或平截的不連續點突變、插入或缺失。多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的拮抗劑基本上保留多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的天然存在形式的相同的或其中部分的生物活性。多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的變體可通過以拮抗劑活性篩選突變體例如多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的截斷突變體的組合物文庫來鑒定。多形擬桿菌GAG裂解酶I的突變體包括SEQ ID NO :4所示的Ml7突變體和SEQ ID NO 23所示的Q26突變體。多形擬桿菌GAG裂解酶II的突變體包括SEQ ID NO :8所示的Q23突變體和SEQ ID NO: 10所示的K169突變體。多形擬桿菌GAG裂解酶III的突變體包括SEQ ID NO 34所示的Q23突變體。多形擬桿菌GAG裂解酶III的突變體包括SEQ ID NO 39所示的D20突變體。多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白編碼序列的片段例如N末端、C末端或內部片段的文庫可用于產生片段的多種群體，用于篩選和隨后選擇多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的變體。特別優選其中添加或刪除半胱氨酸殘基，或者添加或刪除被糖基化的殘基的變體。用于篩選通過點突變或平截產生的組合物文庫的基因產物，和用于篩選具有選擇的特性的基因產物的cDNA文庫的方法在本領域中是已知的。這些方法適于快速篩選通過多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的組合誘變產生的基因文庫。遞歸式整體誘變(Recursiveensemble mutagenesis, REM),是一種增強文庫中功能性突變頻率的新技術,其可用于與該篩選分析組合使用，來鑒定多形擬桿菌GAG裂解酶變體(Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA S9 :7811-7815 ；Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6:327-331)。可開發基于細胞的分析試驗以分析多種多形擬桿菌GAG裂解酶文庫。例如，可將表達載體的文庫轉染到細胞系中，例如通常以底物依賴模式響應多形擬桿菌GAG裂解酶的細胞系。隨后，將該轉染的細胞與多形擬桿菌GAG裂解酶接觸，可通過例如測量肝素或硫酸乙酰肝素的切割來檢測該突變體的表達對多形擬桿菌GAG裂解酶底物的作用。其后從細胞中回收質粒DNA，所述細胞對抑制評分或可選地增強多形擬桿菌GAG裂解酶底物的信號，其后進一步表征這些個別的克隆。在另一個方面，本發明的特征在于制備天然存在的多形擬桿菌GAG裂解酶多肽的片段或類似物的方法。該方法包括例如通過一個或多個殘基的取代或刪除，來改變多形擬桿菌GAG裂解酶多肽的序列，例如改變本文描述的非保守區域的序列、或結構域或殘基，并且測試該改變的多肽的所需活性，例如上文所述的活性。重組表汰載體、宿主細胞和遺傳改造的細胞在另一發明，本發明包括載體，優選表達載體，其包含編碼本文所述多肽的核酸。如本文所用的，術語“載體”指能夠運輸其連接的另一個核酸的核酸分子，其包括質粒、粘粒或病毒載體。該載體能夠自主復制或其能整合到宿主DNA中。病毒載體包括，例如復制缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒(adeno-associated viruses) 載體可以包括具有適于在宿主細胞中表達的核酸形式的多形擬桿菌GAG裂解酶核酸。優選，該重組表達載體包括有效連接至待表達的核酸分子的一種或多種調控序列。術語“調控序列”包括啟動子、增強子和其他表達控制元件(例如多聚腺苷化信號)。調控序列包括那些指導核酸序列組成性表達序列，以及組織特異性調控和/或誘導的序列。表達載體的設計依賴如待轉染宿主細胞的選擇、所需蛋白質的表達水平等這類因素。可將本發明的表達載體引入宿主細胞，從而生產蛋白質或多肽，其中包括由本文描述的核酸編碼的融合蛋白質或多肽(例如多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質、多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質的突變體形式、融合蛋白質等)。設計本發明的重組表達載體用于在原核或真核細胞中表達多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質。例如，本發明的多肽可在大腸桿菌、昆蟲細胞(例如使用桿狀病毒表達載體)、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。適宜的宿主細胞進一步在Goeddel，(1990)GeneExpression Technology Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA中討論。可選地，該重組表達載體可在體外轉錄和翻譯，例如使用T7啟動子調控序列和T7聚合酶。在原核生物中的蛋白質表達最經常在大腸桿菌中使用載體進行，所述載體包含指導融合或非融合蛋白質表達的組成性或誘導性啟動子。融合載體將一定數量的氨基酸添加到其所編碼的蛋白質中，通常是加入到重組蛋白質的氨基末端。這樣的融合載體通常具有三個目的1)增加重組蛋白質的表達；2)增加該重組蛋白質的可溶性；以及3)通過作為親和純化中的配體來協助該重組蛋白質的純化。常常將蛋白質水解切割位點引入至該融合部分和該重組蛋白質的結合處，以能夠在純化該融合蛋白質后，從該融合部分分離該重組蛋白質。這些酶類以及它們的同源識別序列包括因子Xa、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達載體包括 pGEX (Pharmacia Biotech Inc ；Smith, D. B.和 Johnson, K. S. (1988) Gene 67 31-40)>pMAL(New England Biolabs, Beverly,MA)和 pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，其分別將谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖E結合蛋白質或蛋白質A融合至靶重組蛋白質上。純化的融合蛋白質可用于多形擬桿菌GAG裂解酶活性分析中(例如下文更詳細描述的直接分析或競爭性分析)，或者用來產生多形擬桿菌GAG裂解酶蛋白質特異性的抗體。在優選地實施方案中，在本發明的逆轉錄病毒表達載體中表達的融合蛋白質可用于感染其后被移植到受輻射處理的受體中的骨髓細胞。在經過足夠的時間(例如6周)后，檢查該受試者受體的病理學。使重組蛋白在大腸桿菌中表達最大化是在以蛋白水解方式切割該重組蛋白質的能力受損的宿主細菌中表達該蛋白質(Gottesman, S. , (1990)Gene ExpressionTechnology Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California119-128)。另一種策略是改變待插入到表達載體中的核酸的核酸序列，使得每個氨基酸的個別密碼子是在大腸桿菌中優先使用的密碼子(Wada et al, (1992)Nucleic AcidsRes. 20 :2111-2118)。本發明的核酸序列的此類改變可通過標準的DNA合成技術來進行。所述多形擬桿菌GAG裂解酶表達載體可以是酵母表達載體、在昆蟲細胞表達的載體例如桿狀病毒表達載體，或適于在哺乳動物細胞中表達的載體。當用于哺乳動物細胞中時，可通過病毒調控元件提供該表達載體的控制功能。例如，常用的啟動子來自多瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40 (Simian Virus 40)。在另一個實施方案中，該啟動子是可誘導的啟動子，例如被留類激素、多肽激素(例如，通過信號轉導通路的方式)、或異源多肽(例如四環素-誘導系統、"Tet-On"和"Tet-Off';參見例如 Clontech Inc. , CA, Gossen and Bujard (1992) Proc. Natl. Acad.ScL USA 89 :5547 和 Paillard(1989)Human Gene Therapy 9 :983)調控的啟動子。仍然在另一個實施方案中，該重組哺乳動物表達載體能夠指導該核酸優先在特定細胞類型中表達(例如，組織特異性調控元件用于表達該核酸)。適宜的組織特異性啟動子 的非限制性實例包括白蛋白啟動子(肝臟特異的性；Pinkert et al. (1987)Genes Dev. I 268-277)、淋巴特異性的啟動子(Calame and Eaton(1988)Adv. Immunol. 43 :235-275)、特別是T細胞受體啟動子(Winoto and Baltimore (1989)EMBO J. 8 :729-733)和免疫球蛋白啟動子(Banerji et al. (1983) Cell 33 :729-740 ;Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748)、神經元特異性的啟動子(例如，神經纖維啟動子；Queen and Baltimore (1983)Cell 33 :741-748)、胰臟特異性的啟動子(Edlund et al. (1985) Science 230:912-916)和乳腺特異性的啟動子(例如，乳清啟動子；美國專利號4，873，316和歐洲申請
發明者詹姆斯·邁特 申請人:莫曼塔醫藥品有限公司