在高pH下蛋白質的回收的制作方法

專利名稱：在高pH下蛋白質的回收的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種從培養液中回收糖苷酶或者肽酶的方法，所述酶在該培養液中是從不溶狀態到溶解狀態。
背景技術：
由于顯著量的目標蛋白不是處于溶解狀態，可能會阻礙從培養液中回收該蛋白。
該問題可能發生在如下情況中，比如當目標蛋白結合在沉積物的成分上，同樣地或者由于顯著量的目標蛋白在從培養液中回收前已經沉淀或結晶。
目標蛋白與沉積物的結合是指該蛋白結合在培養基中的固形物上，比如細胞類的固形物或培養基中的其他固體成分。
在蛋白質的有效回收上，這是一個重要問題。
已經有幾種方法可以解決或者減小該問題。
在許多情況下，低或不穩定的回收率被接受，其他情況下通過添加如下物質可消除這個問題，比如離子型或非離子型表面活性劑，鹽類，消/去泡劑，醇類，目標酶的底物或其類似物。
在許多情況下這些技術是低效的，其他情況下，采取了復雜的步驟(如液-液分離系統)，這需要添加大量的(可能不只一種的)試劑。
在脂肪酶類的回收上可以找到這樣的一些例子，脂肪酶很容易附著在發酵液中的固形物和/或在回收中可能用到的助濾劑上。
WO 97/23604描述了一種從發酵液中回收脂肪酶的方法。
所述方法的必要步驟包括非離子表面活性劑和醇的使用，這樣得到的終產物含有微生物蛋白(優選脂肪酶)，所述非離子表面活性劑和所述醇。參見WO 97/23604的權利要求1。
EP 0574050A1描述了一種方法，用于從發酵液中回收疏水性產物，優選脂解酶(參見第3欄，47-50行)。該方法的必要步驟包括非離子表面活性劑和鹽的一同使用。參見例如權利要求1。
生物技術雜志(Journal of biotechnology)，26(1992)111-142是一篇綜述性文章，文章記述了關于脂肪酶不同純化策略的現有技術。在129頁提到脂肪酶的純化通常受其溶解性問題的阻礙。該文章總結了現有技術對此問題的解決方案，其中包含著非常復雜的純化策略，比如液-液提取，雙水相提取，特異性膜加工和免疫純化。
對于在回收發酵液前蛋白質出現沉淀或結晶，至今沒有真正有效的方法。通常嘗試使用大量的助溶劑(如尿素)。其他例子中采取了固-固分離技術，其中該沉淀或結晶的目標蛋白與發酵液中其他固體分離—這些分離經常是不可能的并且總是復雜的。
發明概述本發明要解決的問題是提供一個簡單而有效的方法，用于從培養液中回收糖苷酶或者肽酶，其中顯著量的目標糖苷酶或肽酶在培養液中不是處于溶解狀態。
發明人的解決方案是培養液中所含顯著量的目標糖苷酶或肽酶因pH在7.5而沒有處于溶解狀態時，通過使用極端pH條件，即pH9.5～13，目標蛋白可以得到有效的回收。
因此，本發明涉及從培養溶液回收目標糖苷酶或肽酶的方法，該培養溶液含有可產生目標糖苷酶或肽酶的細胞，并且在pH7.5下，其中少于80％的目標糖苷酶或肽酶在該培養溶液中處于溶解狀態，該方法包括a)通過調節該培養液的pH到9.5～13，使目標糖苷酶或肽酶溶解；并且b)將細胞與溶解了的產物相分離，得到含有目標糖苷酶或肽酶的溶液。
所述“培養液”在此指包含目標蛋白和產生該目標蛋白的細胞的溶液。該培養液可能含有其他任何成分，尤其是通常被用于細胞發酵的成分。按照本發明，培養液將優先指發酵培養液。
所述“培養液在pH7.5下，其中少于80％的目標糖苷酶或肽酶處于溶解狀態”指本文要解決的主要問題，即當顯著量的目標蛋白為不溶狀態時回收該目標蛋白。
“培養液”是否符合此標準可由如下事實確定，培養液的上清液中目標蛋白濃度低于該培養溶液中目標蛋白總濃度的80％。上清液是水相培養液，可通過例如，在足以去除細胞的條件下離心而得到。
所述濃度指每一升中蛋白的量(干重)(如g/L)，或者是每一升中的蛋白活性。
所述“在pH7.5下”在此指上清液從pH7.5的培養溶液中分離(優選離心)得到。
上清液和培養液中的目標蛋白濃度可以隨后在此pH7.5或另一pH下測定。
這取決于目標蛋白和培養液的特性，可以由技術人員的常識決定(可參見下面對此的進一步討論)。
可以選擇另一種表示為“培養液”符合本文標準的前提是Prot.Conc.sup./Prot.Conc.Cul-sol×100＜80，pH7.5；其中Prot.Conc.sup.是培養液的上清液中目標蛋白濃度。
Prot.Conc.Cul-sol是該培養液中目標蛋白總濃度。
優選地，上清液中該目標蛋白的濃度在該培養液蛋白濃度中所占比率低于70％；更優選地低于55％，甚至40％；最優選地低于25％。
測定目標蛋白濃度的實際方法遵循在本領域熟知的標準方法，并依目標蛋白的特性而做調整。
當測定該培養液中酶的濃度時，所用方法當然應該在檢測培養液中的目標蛋白濃度前使目標蛋白的不溶部分溶解。
有許多這樣的為本領域所熟知的方法，例如疏水蛋白或沉淀蛋白的提取方法，該方法包括進行高倍稀釋添加去污劑，尿素等。
依據上面列出的標準挑選特定的方法是技術人員的常識。
應在此提起注意的是，公開在WO 97/20921中的培養液沒有一種符合這些標準，這是由于該公開文本中沒有回收不溶狀態下蛋白的方法。
因此，公開在WO 97/20921中的所有特定培養液的上清液中，目標蛋白濃度都高于該培養液中蛋白總濃度的80％。
正如在此描述的，本方法的一個優點就是調節pH到9.5～13可直接引起目標蛋白的溶解。
因此，通過簡單的離心分離可以沉積固形物(例如細胞)，回收上清液，這樣就可以將固形物與目標蛋白分離。在此描述的方法不用添加化合物，如離子型/非離子型表面活性劑，鹽類，消/去泡劑，特定的醇類，而這些都是在WO97/23604和EP 0574050A1中所提方法的必要步驟。
而且，正如本發明實施例1中說明的，此方法可以獲得很高的目標蛋白終產率。
本發明的實施方案如下所述。
發明詳述在含有可以產生糖苷酶或肽酶的細胞的培養液中，其中多于20％的目標蛋白，在pH7.5下，在該培養液中不是處于溶解狀態(不溶狀態)。
正如在上面背景部分描述的，培養液中的目標蛋白不是處于溶解狀態是由于，比如目標蛋白與沉積物中的成分相結合，和/或是由于在從培養液中收集前顯著量的目標蛋白已經沉淀或結晶。
目標蛋白與沉積物的結合是指蛋白結合在培養液中的固形物上，如細胞類的固形物，或溶液中的其他固體物質。
因此，在本發明的優選實施方案中涉及，一種方法，其中有多于20％的在pH7.5下在該培養液中處于不溶狀態的目標蛋白是與培養液中固形物相結合的目標蛋白，結合的固形物可以是細胞類的固形物或者培養液中其他固體物質；或一種方法，其中多于20％的在pH7.5培養液中處于不溶狀態的目標蛋白是在該培養液中沉淀或結晶的目標蛋白。
培養液通常由分批發酵中得到。
具體的發酵如何進行對本發明的回收方法而言相對不重要。
因此，發酵時間，pH或其他具體發酵條件可以按照為本領域熟知的方法進行。優選地，應調整發酵條件以獲得最大的目標蛋白產率。
此外，該培養液可以是一種培養液的離心分離(離心)的級分。
所述“培養液的離心分離級分”指培養液被離心分離下來的部分，比如細胞，不溶物質，不溶的發酵產物。不溶的發酵產物可能包括沒溶解的目標蛋白。
因此，在本發明的進一步實施方案中涉及到本發明的一種方法，其中的培養液是培養液的離心分離下來的部分。
在依照本文所述方法回收目標蛋白前，所述培養液的離心分離級分可以懸浮或稀釋在水性溶液，如水中。可以依據技術人員常識進行上述懸浮或稀釋。
此外，為技術人員所熟知的任何利于不溶蛋白溶解的其他試劑或組分都可以加入到培養液中。這些組分可以是那些能阻止目標蛋白的沉淀或結晶的成分。
這樣的成分的例子有，鹽類，鈣，多元醇，去污劑，除泡劑，消泡劑，或目標蛋白的底物類似物/抑制劑。可參考WO 97/23604，EP 0574050A1或生物技術雜志，26(1992)，其中有這些適合成分的描述。
此外，這里所指的培養液優選含有化學成分確定的培養基的溶液。參見WO 98/37179中對這樣的基本由化學成分確定的培養基組成的培養液的進一步描述。
pH的調整可以使用技術人員所熟知的任何合適策略進行培養液pH的調整。
如可以使用任何合適的堿進行pH調整。優選的堿有氫氧化鈉，氫氧化鉀和氫氧化銨，尤其是氫氧化鈉。
優選地，依照本發明的步驟a)，培養液pH被調整到9.75～13；更優選地到pH10～13；進一步優選地到pH10.25～13；最優選地pH到10.5～13。
如上所述，培養液可以是從分批發酵中獲得的。
因此，pH可以在發酵過程中已經作出調整，從而使這批發酵液具有本發明步驟a)設定的pH值。何時以及如何進行pH的調整在此描述的方法中并不重要。重要的是培養液的pH在所述范圍內。
回收期間如本發明所述進行了調整的pH應優選維持一段時間，這取決于目標蛋白的特性，特別是蛋白質的穩定性。
這也就是說，如果目標蛋白在高pH下相對不穩定，應依照此處的描述優先調整pH使蛋白溶解；再依照本發明的第一部分b)項較快地回收已溶解的蛋白；接著馬上調節pH到一個蛋白質可以較長時間穩定的值，或者可以選擇首先調整到高pH值，接著在分離前在蛋白溶解后馬上調整pH到較低值。
相反地，如果目標蛋白在高pH相對較為穩定，依照本發明第一部分條款a)的描述調整了的pH可以維持相對長的時間。
如何根據要回收的目標蛋白的特性優化維持此調整后pH的時間長短是技術人員的常識。
此外，在此要解決的主要問題，即要對顯著量處于不溶狀態的目標蛋白進行回收時，如果目標蛋白的表達產量相對較高尤為突出。
所以，在本發明的優選實施方案中優選培養液中目標蛋白的表達量至少達到2g蛋白(干重)/kg培養基；優選至少3g蛋白(干重)/kg培養基；更優選至少5g蛋白(干重)/kg培養基；最優選至少10g蛋白(干重)/kg培養基。
能夠生產目標蛋白的細胞能夠生產目標蛋白的細胞原則上可以是任何細胞，比如微生物細胞，植物細胞或者動物細胞。
這里優先指微生物細胞，特別是細菌或真菌細胞。本發明特別適合于細菌細胞。
細菌細胞優先指芽孢桿菌細胞，真菌細胞優先指絲狀真菌細胞，例如曲霉屬或鐮刀菌屬的絲狀真菌細胞。
絮凝劑的使用優選地，在本發明的步驟a)中的培養液可以進一步用一種或多種絮凝劑處理。
在實際的pH調整之前，期間或之后，可以在培養液和/或發酵液/發酵培養基中加入絮凝劑。
絮凝劑為本領域所熟知，均特別用于提供一種蛋白質溶液(例如在此所指的含有能產生目標蛋白的細胞的培養液)，此溶液特別適于離心，過濾，或膜濃縮/過濾，使所述蛋白的流通量和蛋白質純度都得以提高。
優選地，絮凝劑是可溶性的鐵和/或鋁化合物。
這些作為絮凝劑的可溶性的鐵和/或鋁化合物的使用由WO 96/38469得知。
然而，在WO 96/38469公開內容的第7頁，第13-14行，寫著“保持發酵液pH4～9之間是重要的”。
因此，WO 96/38469的公開內容描述了一種培養液，其必要條件是pH在4～9之間，這樣的pH范圍超出了本發明中回收方法的pH范圍。
優選地，以每升培養液0.02mol～1.2mol鋁/鐵化合物處理培養液，更優選地，用每升培養液0.04mol～1.0mol鋁/鐵化合物處理培養液。
依照本發明任何可溶性鐵或鋁的化合物或它們的任何混合物均可使用，例如Al2(SO4)3，NaAlO2，K2Al2O4，Al(NO3)3，AlCl3，醋酸鋁，甲酸鋁，Fe2(SO4)3，甲酸鐵，醋酸鐵，甲酸亞鐵，和醋酸亞鐵。
優選的化合物是氯化氫氧化鋁(aluminiumhydroxychloride)聚合物(例如從Boliden得到的EKOFLOCK)，水合氯化鋁聚合物(來自Calgon公司)，或NaAlO2。
穩定劑依照本發明在某些情況下優選加入穩定劑(這樣目標蛋白能提高對高pH值的耐受性)或加入蛋白酶抑制劑(這樣目標蛋白不會降解)。可以使用的蛋白酶抑制劑可以是硼酸或boronic acid，特別是在WO 96/41859中描述的4-甲酰基-苯基-boronic acid。
將細胞與溶解的產物分離并得到含目標蛋白的溶液依照本發明步驟b)的分離可參照任一已知的標準方法。
這樣的方法可能是一種或多種固/液分離技術，例如離心，過濾，或微濾。
目標蛋白本發明的方法可用于回收任何目標蛋白。
優選地，目標蛋白是一種酶，特別是糖苷酶(EC 3.2)或肽酶(EC 3.4)；(EC-編號依照國際生物化學和分子生物學命名委員會推薦的酶命名法(1992))。特別優選的酶選自淀粉酶(特別是α-淀粉酶(EC 3.2.1.1))，纖維素酶(EC3.2.1.4)，乳糖酶(EC3.2.1.108)，木葡聚糖酶，甘露聚糖酶(mannanase)(EC3.2.1.25)和蛋白酶；特別選自淀粉酶，甘露聚糖酶和蛋白酶。此組優選酶在回收中經常由于沉淀和/或結晶而出現問題。
尤其優選目標蛋白質(優選目標酶)通過DNA重組技術產生的蛋白質工程變體。
這是由于在回收這些變體時能多次出現意想不到問題，比如沉淀或結晶。
這些蛋白質工程變體可以是，例如蛋白酶或淀粉酶的變體，特別是提高了疏水性和/或降低了在培養液中的溶解性的變體。
優選地，目標蛋白應該是在5攝氏度，pH9.5下孵育20分鐘后，有至少80％的殘余活性的蛋白；更優選地，應在5攝氏度，pH10.0下孵育20分鐘后，有至少80％的殘余活性的蛋白；最優選地，應在5攝氏度，pH11下孵育20分鐘后，有至少80％的殘余活性的蛋白。
實施例1對WO96/23873所述α-淀粉酶變體進行發酵生產。
發酵后，在顯微鏡(400×)下可以看到培養液中有酶結晶。
培養液中α-淀粉酶活性經測定為100％。
培養液在pH7.5下離心。
離心后，上清液中α-淀粉酶活性為20.4％。
溶解的/(溶解的＋不溶的)的關系式因此是(參見第4頁)(Prot.Conc.sup./Prot.Conc.Cul-sol)*100＜80)＝20.4％/100％*100＝20.4，(遠低于80的限度)。
絮凝如下的化學劑添加到(在攪拌狀況下)兩個各100g的培養樣品中200％水；1％CaCl2·2H2O；0.2％NaAlO2；0.3％Superfloc C 521和0.3％Superfloc A130。在添加這些化學物質時，一個樣品保持pH7.5，第二個保持在pH10.5-pH在7.5/10.5保持10分鐘；溫度為室溫(接近20℃)。
接著兩個樣品進行離心，測定上清部分中α-淀粉酶的活性產率實驗1(pH7.5)產率＝45％實驗2(pH10.5)產率＝80％上述實驗清楚地表明對樣品的堿性處理可以顯著提高產物產率。
權利要求
1.一種從培養液中回收糖苷酶(EC 3.2)或肽酶(EC 3.4)的方法，該培養液中含有能產生糖苷酶或肽酶的細胞，并且其中不到80％的糖苷酶或肽酶在pH7.5的該培養液中處于溶解狀態，所述方法包括a)通過調整培養液的pH到9.5～13，使目標糖苷酶或肽酶溶解；b)將細胞與溶解態的所述糖苷酶或肽酶分離，得到含有所述糖苷酶或肽酶的溶液。
2.權利要求1中的方法，其中在pH7.5的該培養液中不處于溶解狀態的所述糖苷酶或肽酶結合在該培養液中的固形物如細胞類固形物或者溶液中的其它固體成分上。
3.權利要求1中的方法，其中在pH7.5的該培養液中不處于溶解狀態的目標糖苷酶或者肽酶在該培養液中沉淀和/或結晶。
4.權利要求1～3中任一項的方法，其中所述培養液的pH被調節到9.75～13；更優選地，pH被調節到10～13；更進一步優選的，pH被調節到10.25～13；最優選地，pH被調節到10.5～13。
5.權利要求1～4中任一項的方法，其中在權利要求1的步驟a)中的所述培養液在pH調整之前，期間，或之后進一步用一種或多種絮凝劑處理。
6.權利要求5中的方法，其中絮凝劑是可溶性的鐵和/或鋁化合物，特別是氯化氫氧化鋁的聚合物，水合氯化鋁聚合物，或NaAlO2。
7.權利要求1～6中任一項的方法，其中所述糖苷酶或肽酶是蛋白質工程變體。
8.權利要求1～7中任一項的方法，其中所述糖苷酶是淀粉酶或甘露聚糖酶。
9.權利要求1～7中任一項的方法，其中所述肽酶是蛋白酶。
10.權利要求1中的方法，其中步驟b)中培養液的pH在分離前被調節到更低。
全文摘要
本發明涉及一種從培養液中回收糖苷酶或者肽酶的方法,所述酶在該培養液中是從不溶狀態到溶解狀態。
文檔編號C12N9/50GK1337999SQ00803065
公開日2002年2月27日 申請日期2000年1月24日 優先權日1999年1月25日
發明者梅斯·A·勞斯特森, 柯倫·M·辛普森, 邁克爾·J·奧雷利 申請人:諾維信公司