L－山梨糖的制備方法

專利名稱：L－山梨糖的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種制備L-山梨糖的改進方法，該方法使該物質的工業生產特別方便，本發明還涉及能夠特別有利地應用于該制備方法中的特異性非重組微生物。
L-山梨糖為制備2-酮-L-古洛糖酸的起始產物，由此以工業規模合成L-抗壞血酸。通過發酵以微生物方法制備抗壞血酸或其前體，例如L-山梨糖，具有以對映異構純形式制備所需產物的優點。
然而，至今用于制備L-山梨糖的發酵方法伴隨有許多缺陷。至今已知的方法中最嚴重的缺陷之一是起始產物，D-山梨醇，它僅能以相對低的濃度使用，即約1-15％(重量)的范圍。發酵結束后的L-山梨糖濃度相應較低，甚至在完全反應的情況下也如此。第二個嚴重缺陷是要求反應必需間歇地進行。這意味著對每個生產批次而言必需首先在許多步驟中制備新的接種物。這樣勞動特別密集并且費時，而且是工業生產L-山梨糖的嚴重缺陷。這些缺陷的主要原因在于發酵所需的微生物，特別是氧化葡糖桿菌種的細菌，它在工業規模發酵的條件下僅具有極有限的生存期，這些工業規模的發酵條件例如有高D-山梨醇濃度、廉價的非復合營養培養基、約3-7的pH波動、0.1-1.5升O2/升培養基/小時的氧供應波動。此外，由于反應條件與理想參數的偏差才縮短了細菌培養物的生存期，特別在大的發酵罐中。經常在發酵結束時所用的大量細菌不再能生存或者能繁殖。為了為下一個反應批次創造理想的起始條件，即能夠制備高細胞密度的接種物，因此現有技術需要新接種物的培養物。
EP-A-0758679描述了一種L-山梨糖-生產的氧化葡糖桿菌菌株G624(保藏號FERM-BP 4415)，它可以在20％濃度山梨醇培養基中培養。培養4天之后，該菌株以高產率將D-山梨醇轉化成L-山梨糖。而且該菌株還用載有編碼L-山梨糖脫氫酶和L-山梨酮脫氫酶的DNA的表達構建體轉化。將所得轉化體用于由D-山梨醇生產2-酮-L-古洛糖酸。然而，該發酵所用的培養基僅有5％的D-山梨醇濃度。必需培養5天才能使反應完成。因此整體上說，必須說明EP-A-0758679所公開的細菌在D-山梨醇耐受性方面和L-山梨糖合成性能方面都沒有令人滿意的性能。同樣沒有提出將那里所述的微生物應用于D-山梨醇的半連續或連續轉化。
因此本發明的目的是創造更有效地發酵制備L-山梨糖的前提條件。
我們已發現，尤其是通過使用氧化葡糖桿菌種的微生物提供一種由D-山梨醇制備L-山梨糖的半連續發酵方法實現了該目的。而且，通過提供最佳化氧化葡糖桿菌菌種實現了該目的。
因此本發明首先涉及，通過在濃度逐漸增加的D-山梨醇中培養氧化葡糖桿菌菌株，使該菌株逐漸適應培養基中增加的D-山梨醇濃度，使低耐性的氧化葡糖桿菌菌株得到調理，從而獲得對D-山梨醇具有高度耐受性的氧化葡糖桿菌菌種。
如果氧化葡糖桿菌能夠在范圍為約20-40％(重量)，例如約25-38％(重量)或者28-35％(重量)的初始D-山梨醇濃度的培養基中培養的話，那么存在本發明的“高耐受性”氧化葡糖桿菌菌株，即適應高D-山梨醇濃度的。顯然同樣可以在低于20％(重量)的D-山梨醇濃度下生長。優選這類菌株還應在生長過程中以高產率如70-100％將培養基中存在的D-山梨醇發酵成L-山梨糖。
例如，在調理過程中通過逐步將D-山梨醇濃度從最初的約5-10％(重量)增加到約20-40％(重量)，如約25-38％(重量)或者28-35％(重量)的最終濃度，可以獲得本發明的高耐受性菌株。例如可以進行如下調理制備適合氧化葡糖桿菌生長且本身已知的無菌液體培養基，調整最初D-山梨醇含量，以便接種之后D-山梨醇含量例如為約5-15％(重量)，例如約10％(重量)。培養基的適宜配方描述在例如“IndustrielleMikrobiologie”[Industrial Microbiology]，Hans-Jürgen Rehm，Springer Verlag Berlin，Heidelberg，New York，2nd Edition，p.500。例如，可以使用10％濃度山梨醇培養基(pH5)，其中加入了含或不含0.1％(重量)葡萄糖的0.5％(重量)的酵母提取物。該培養基用新制備的未經調理的氧化葡糖桿菌菌株接種物接種。經過接種的培養基在有氧條件下在約30-37℃下培養，并且例如輕輕搖動或攪拌。連續發酵，直到不再能觀察到明顯的L-山梨糖形成。從發酵肉湯中取出等分試樣并用于接種在這期間制備的第二次培養階段的另一無菌培養基，其中(再接種之后)D-山梨醇含量高于前面培養階段的培養基中的含量。接種物與待接種的培養物的比例應大致為1∶5-1∶20，例如1∶5-1∶10。重復上面步驟，逐漸增加山梨醇濃度，直到獲得在具有所需高初始D-山梨醇濃度的培養基中生長的細菌培養物。可以根據開始菌株對濃度增加的反應的函數選擇逐漸增加的D-山梨醇濃度。此外，可以相同或不同大小的梯度進行增加。例如，可以0.5％-3％的相同梯度，例如1％或者2％梯度逐漸增加D-山梨醇濃度。
按照另一實施方案制備氧化葡糖桿菌菌種，該菌種除了增加了D-山梨醇耐受性之外，還具有基本上恒定，即穩定的高L-山梨糖合成性能。如上所述，通過在高山梨醇濃度，例如約25-35％(重量)濃度的D-山梨醇培養基中重復地培養高山梨醇耐性菌，直到L-山梨糖的形成結束，可以獲得具有這類性能的細菌。
當約90-100mol％、例如約93-98mol％的所用山梨醇在不超過約48小時之后，特別在不超過約36小時之后，例如在約15-25小時或者18-22小時之后反應時能獲得本發明令人滿意的“高”L-山梨糖合成性能。由于該合成性能能夠受培養條件影響，上面標準尤其可用于以下標準條件初始D-山梨醇含量28-30％(重量)；培養基的pH4.5-5.0；通風0.5-1.5升空氣/升培養基/小時；接種物與填充培養基的體積比約為1∶5-1∶6；標準培養基每kg培養基含有玉米漿，50％干基4.354g硫酸銨 0.495g磷酸氫二銨 0.124g硫酸鎂七水合物 0.082g碳酸鈣 0.472g消泡劑 0.150g如果能夠通過將培養肉湯等分試樣在新配制的培養基中連續接種，優選以接種物與填充培養基的體積比為約1∶5-1∶6，更準確地說所用生產菌種的L-山梨糖合成性能沒有明顯降低的情況下重復培養的話，就能得到本發明令人滿意的“恒定”或“穩定”的L-山梨糖合成性能。該合成性能可以在上面定義的轉化速率和反應時間的范圍內波動。再接種1-5次或更多次，例如10-50次或更多次之后應仍然可以觀察到恒定的合成性能。
本發明的調理方法原則上可以對所有未調理過的氧化葡糖桿菌菌株進行。然而，優選使用氧化葡糖桿菌NRRL-B72進行調理。該菌株可以從保藏地點(Northern Regional Research Laboratory，USA)免費獲得。
本發明尤其涉及以上面方式調理過的氧化葡糖桿菌，它能夠在有氧條件下將D-山梨醇轉化成L-山梨糖，其中該細菌還以單個、成對或短鏈非運動、革蘭氏陰性桿狀形式存在，在半固體山梨醇-葡萄糖-酵母提取物-瓊脂培養基和液體山梨醇-玉米漿培養基中在pH約3.5-6，溫度約25-40℃和D-山梨醇濃度最高約40％(重量)，例如20-40％(重量)，特別是約25-35％(重量)下生長良好。
以NRRL-B72為原料按照上述調理方法獲得并記錄為內部名字“2B3”的特別優選的氧化葡糖桿菌菌株具有以下性能1.2B3的形態性能-革蘭氏菌株陰性-細胞形狀桿狀-細胞大小1-2μm-細胞的存在單個、成對或短鏈-運動性陰性-孢子形成陰性-菌落a)在肉膏-蛋白胨瓊脂(pH7.0)上接種2天之后偶然出現薄的肉眼很難看見的不清楚的菌落；b)在山梨醇-葡萄糖-酵母提取物瓊脂(pH5)上培養2天之后，出現針頭形狀和大小的圓頂、球形菌落。菌落為白黃色并有光澤。
2.生理性能-生長溫度T＝25-40℃，最佳為32℃-pH范圍在pH為3.5-6，最佳pH4.5-5.0下生長-需氧-過氧化氫酶陽性-氧化酶陰性-硝酸鹽還原性陰性
-明膠液化作用陰性-H2S形成陰性-吲哚產生陰性-乙醇氧化為乙酸陽性-淀粉不能水解-甘油、D-甘露糖醇、山梨醇能利用-乳酸鹽氧化陰性-乙酸鹽氧化為CO2和H2O的陰性由此生產的菌株具有按照Bergey’s Manual of SystematicBacteriology(9th Edition)，p.275ff中的信息的氧化葡糖桿菌的主要特征。關于其它非限制性特征，可以參考該標準工作鑒定。
除了上面特定描述的氧化葡糖桿菌菌種之外，本發明還涉及基本上具有相同性質并適合實施制備L-山梨糖的本發明方法的突變體及其變體，該方法在下文中有詳細的說明。
制備特定所述的本發明微生物的突變體和變體的適宜方法的例子包括(但不限于此)通過紫外光或X射線照射誘變；用化學誘變劑如亞硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)、甲磺酸甲酯、氮芥等處理；基因整合法和使用噬菌體的轉導。這些方法在現有技術中為已知并描述在例如J.H.Miller，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1972)；J.H.Miller，A Short Course in Bacterial Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1991)；M.Singer and P.Berg，Genes&Genomes，UniversityScience Books，Mill Valley，California(1991)；J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Molecular Cloning；A LaboratoryManual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(1989)；P.B.Kaufman et al.，Handbookof Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine，CRC Press，Boca.Raton，Florida(1995)；Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，B.R.Glick and J.E.Thompson，Eds.，CRC Press，Boca Raton，Florida(1993)和P.F.Smith-Keary，Molecular Genetics of Escherichia coli，TheGuilford Press，New York，NY(1989)。
本發明還涉及一種半連續發酵制備L-山梨糖的方法，該方法包括a)將氧化葡糖桿菌菌種接種到含有D-山梨醇的第一個培養基中并培養它，直到該D-山梨醇的轉化基本上結束；b)轉化結束之后，將形成的L-山梨糖從大部分所得培養肉湯中分離出來；c)將剩余量的培養肉湯以重量比1∶4-1∶8接種到第二個含D-山梨醇的培養基中并培養它，直到該D-山梨醇轉化基本上結束；和d)轉化結束之后，將形成的L-山梨糖從培養肉湯中分離出來；每種情況下培養基接種之后的初始D-山梨醇濃度最高約40％(重量)。接種物中的細胞密度相應地例如為1-10g生物量(干基)/升接種物。
按照本發明方法的一個優選實施方案，通常根據需要重復包括步驟a)-c)的發酵循環，直到形成足夠量的L-山梨糖。為了本發明的目的，發酵循環“所需”的重復數例如為1-5次或更多次如10-50次，或者50-200次重復數的發酵循環。
由此可以看出，與現有技術相比，本發明方法的突出優點在于不需要新的接種物接種生產培養基。而且，所需的接種物可以直接從上一個發酵循環的培養肉湯中分出去，優選在D-山梨醇轉化結束之后。按照本發明還令人吃驚地發現，盡管初始D-山梨醇濃度異常地高，例如25-35％(重量)，但是大量發酵循環可以完成。此外，令人吃驚的是每個發酵循環，在每次循環的反應時間為約15-25小時，特別是約20小時內以相當高的產率即約95-98mol％得到L-山梨糖。按照本發明所選的接種物與培養基之比保證生產批次事實上沒有超過延滯期，而是含有高活力的細菌培養物。
發酵溫度優選為約25-40℃，特別是約32-36℃。特別優選的發酵溫度為約35℃，該溫度處于該菌最佳生長溫度(32℃)和將D-山梨醇酶催化部分氧化為L-山梨糖的最佳溫度(36℃)之間。溫度低于25℃和高于40℃，都將觀察不到明顯的細菌大量繁殖。而且如果溫度低于25℃，接著進行加熱，生長和生產能力增加到正常值，溫度增加到40℃以上將導致細菌生長和生產能力的永久破壞。
此外，按照本發明，優選在每升培養基每分鐘供應約0.5-1.5升空氣進行發酵。以本身為已知的方式通過使空氣富含氧，例如最高約20％(體積)，可以進一步提高細菌生長和D-山梨醇的發酵轉化。還可以本身為已知的方式通過改變壓力控制氧轉移。在攪拌發酵罐中，氧轉移尤其受到所用攪拌器的攪拌功率的影響。優選攪拌功率為約0.5-4kW/m3培養基。常用的攪拌器類型的例子為槳式攪拌器。
如上所述，按照本發明優選的細菌的最佳生長pH為4.5-5.0。當pH大于6至約7.5時，生長和生產能力被可逆地抑制，而發酵過程中的pH也可以短時間上呈現為值3.5或以下，例如至約3.0，對運行批次中的山梨醇氧化或下一個發酵循環中的生長和生產能力沒有不利的影響。
此外，優選必需小心確保山梨醇底物沒有過量的D-葡萄糖雜質，這是由于在發酵過程中因D-葡萄糖氧化為葡萄糖酸使得pH異常降低。
按照本發明優選用于發酵的微生物的培育時間隨培養基中山梨醇濃度增加而增加。因此，在其它發酵參數相同的條件下，在27％濃度的培養基中的培育時間例如比在10％濃度的培養基中的培育時間長3倍。超出山梨醇的濃度范圍約30-32％(重量)，該培育時間急劇增加。濃度為約40％(重量)時生長停止。在27％濃度山梨醇的培養基中以比例1∶5.6(接種物培養基)接種后約12-18小時內細菌達到最佳細菌密度。直到培養物達到一定的細胞密度如約30-50％最終密度之后D-山梨醇向L-山梨糖的氧化才開始。
如果L-山梨糖被以結晶形式分離的話，優選所用D-山梨醇底物應沒有D-甘露糖醇雜質。這是因為D-甘露糖醇將被酶促轉化為D-果糖。少量的后者使該結晶過程受到抑制。
本發明的其它優點在于本發明制備方法可以使用相對簡單、廉價的營養培養基或培養基進行。優選每kg液體培養基包括a)約100-300g D-山梨醇b)約4-5g玉米漿(50％干基)c)約0.4-0.6g(NH4)2SO4d)約0.1-0.15g(NH4)2HPO4e)約0.06-0.1gMgSO4.7H2O
f)約0.5-0.9gCaCO3(有或沒有)g)有效量的消泡劑接種之前將培養基以本身為已知的方式殺菌。為此，殺菌之前例如使用約70-80％濃度醋酸將培養基的pH調整至5.5。發酵過程中僅通過添加碳酸鈣來控制其pH。不需要其它控制，例如通過向運行的發酵過程中加入氫氧化鈉溶液。在最初的生長期時，培養物的pH為約5.5-6，生長的對數期(細菌的對數繁殖)時pH降低至約4.0-4.5。
在補充本身完全足夠發酵用的上述主要組分時，如果需要的話可以向按照本發明所用的營養培養基中加入其它組分。
因此，例如可以存在一種或多種其它烴源，例如淀粉水解物、纖維素水解物或糖蜜；和醇類，例如甘油。
而且，另外可以存在一種或多種氮源，例如氨水、無機或有機酸的銨鹽，例如氯化銨、硝酸銨、磷酸銨、硫酸銨和醋酸銨；尿素；硝酸鹽和亞硝酸鹽和其它含氮物質如氨基酸、肉膏，蛋白胨，魚粉，魚水解物，酪蛋白水解物，大豆水解物，酵母提取物，干酵母，乙醇酵母餾出物，大豆粉，棉籽粉等。
而且，另外可以存在無機鹽，例如鉀鹽、鈣鹽、鈉鹽、鎂鹽、錳鹽、鐵鹽、鈷鹽、鋅鹽、銅鹽和其它痕量元素的鹽，也有磷酸。
同樣可以單獨或聯合地加入適宜的痕量元素和生長因子，例如輔酶A、泛酸、生物素、硫胺、核黃素、黃素、單核苷酸、黃素腺嘌呤二核甙酸和其它維生素，氨基酸如半胱氨酸、硫代硫酸鈉、對氨基苯甲酸、煙酰胺等。它們可以純形式或含有這些物質的天然物質形式使用。
每種情況下使用的優選發酵技術主要取決于批次大小。而對較小批次而言，有氧搖動培養原則上適合的，為了工業規模實施本發明的方法，優選浸沒的有氧條件下的發酵。
以常規方式進行D-山梨醇的轉化，例如通過HPLC分析抽出的樣品。為了檢測L-山梨糖含量，適宜的方法為例如來自Merck的OA KC型HPLC柱7.8×300mm，流動相0.05N硫酸，0.4ml/min流速。
使用常規方法將形成的L-山梨糖連續或間歇地分離。如果適宜的話例如通過過濾或離心除去細胞群之后，以常規方式首先將所得培養肉湯濃縮。例如通過高溫如50-80℃和減壓如0.01-0.1bar下蒸發。沉淀出的晶體經過濾，如果需要的話進行重結晶。如果需要的話可以單獨或聯合地使用其它提純步驟，例如溶劑萃取、色譜法、沉淀或鹽析。
在以下試驗部分中描述了本發明方法的特別優選的實施方案。
實施例1各種營養培養基的制備a)玉米漿-鹽混合物玉米漿，50％干基240g(約200ml)硫酸銨 22.2g磷酸氫二銨 6.6g硫酸鎂七水合物 3.6g碳酸鈣 48.6g為了制備該培養基，將除碳酸鈣之外的所有成分混合在一起，使用25％濃度的氫氧化鈉溶液將其pH調整至約6。然后加入碳酸鈣。再次測定其pH，如果需要的話將其調整至6.5。
b)山梨醇-玉米漿-鹽瓊脂將實驗室培養的氧化葡糖桿菌保持在瓊脂斜面管中的該固體培養基上。就在接種前即刻在Roux燒瓶中在該固體培養基上生產發酵罐第一次接種用的接種培養物。山梨醇糖漿，70％(重量)干基75.0g(約5％山梨醇)玉米漿-鹽混合物 7.5g瓊脂粉末 25.0g軟化水1000ml將山梨醇糖漿、玉米漿-鹽混合物和水混合在一起，加熱至60℃并過濾。然后向沸騰濾液中慢慢加入瓊脂粉末。然后將該熱培養基分裝到各培養容器中(9ml/30ml瓊脂斜面管和100ml/650ml Roux燒瓶)。然后將這些容器密封并在121℃下高壓殺菌20分鐘。
c)山梨醇-葡萄糖-酵母提取物瓊脂(pH5)使用該培養基研究發酵過程中培養物的純度。該培養基適合氧化葡糖桿菌生長，并且不適合大多數經常存在的污染微生物。在32℃下培養1-2天之后氧化葡糖桿菌在該培養基上形成特征為圓頂球形白黃色有光澤培養物。山梨醇糖漿，70％(重量)干基75.0g(約5％山梨醇)葡萄糖 1.0g酵母提取物 5.0g瓊脂粉末15.0g軟化水 1000ml將山梨醇糖漿、酵母提取物和葡萄糖混合在一起，然后加入水。用12％(重量)濃度的醋酸將pH調整至5.3-5.4。向該沸騰混合物中慢慢加入瓊脂粉末。然后在培養基仍然熱的情況下將其分裝到螺紋頂玻璃瓶中并在121℃下高壓殺菌20分鐘。冷卻到約50℃之后，將該培養基倒入無菌塑料陪替氏培養皿上。
d)肉提取物-蛋白胨瓊脂(pH7)使用該培養基研究發酵過程中培養物的純度。它是大多數經常存在的污染微生物的營養培養基。它不適合氧化葡糖桿菌生長。在32℃下培養2天之后氧化葡糖桿菌至多在該培養基上形成幾乎看不見的模糊菌落。經常觀察不到生長。
肉提取物3.0g蛋白胨 5.0g瓊脂粉末15.0g軟化水 1000ml與上面培養基c)相似地制備該培養基，只是將pH調整至7。
e)生產培養基1000kg的28％濃度山梨醇培養基(密度1097kg/m3)的配方玉米漿，50％干基4.354kg硫酸銨 0.495kg磷酸氫二銨 0.124kg硫酸鎂七水合物 0.082kg碳酸鈣 0.472kg消泡劑 0.150kg用自來水將山梨醇糖漿(70％干基；相當于400山梨醇)稀釋并加入玉米漿。然后加入預溶解或懸浮于自來水中的無機鹽。然后使用70-80％濃度的醋酸將其pH調整至5.5。最后加入消泡劑。以本身為已知的方式在141℃下將該培養基殺菌2分鐘。
實施例2氧化葡糖桿菌接種培養物的生產在5℃下以瓊脂培養物(培養基b)的形式將氧化葡糖桿菌保持預培養。使用無菌接種循環，由一個瓊脂培養物通過32℃下培養2天生產5個新瓊脂培養物。使用8個該瓊脂培養物的細菌接種Roux燒瓶中的相同培養基。為此將瓊脂培養物中的細菌懸浮于2×5ml的無菌0.9％濃度的氯化鈉溶液中。將該懸液轉移到一Roux燒瓶中。將總共8個接種燒瓶在32℃下培養2天，如果需要的話保持在5℃。將2個Roux燒瓶中生長的細菌懸浮于2×50ml無菌0.9％濃度的氯化鈉溶液中并將其轉移到一無菌玻璃容器中。該培養物用作一50m3發酵罐中山梨醇發酵用的接種物。接種物中的細胞密度約為109個細菌/ml。
實施例3D-山梨醇的發酵a)第一步發酵在50m3發酵罐中添加15,000kg生產培養基(比較實施例1培養基e))，其中山梨醇濃度僅為15％(重量)，玉米漿和無機鹽的含量為2倍。培養基調整至35℃。在無菌條件下將按照實施例2生產的200ml接種物轉移到該發酵罐中。發酵罐以1600-1800m3無菌空氣/小時充氣。發酵罐中的壓力為約1.3個大氣壓。最初pH為約5.5-6.0。該第一步的發酵時間為約30-40小時。發酵結束時pH降低至約4.0-4.5。所得培養肉湯或者經過處理分離出形成的L-山梨糖或者用作第二個發酵階段的接種物。
b)第二步發酵將第二個50m3發酵罐添加33,000kg無菌生產培養基(28％(重量)的山梨醇)并接種6400升的接種物(相當于7000kg來自第一步發酵的培養物)。接種物與生產培養基的比例為1∶4.7。然后將發酵進行約18-22小時，直到山梨醇濃度降至低于0.1％(重量)。L-山梨糖的產率為約8.3kg/m3發酵罐體積/小時。將另外6400升的接種物從所得的發酵肉湯中分出去用于下一個發酵循環。將剩余量的發酵肉湯經處理分離出L-山梨糖。
實施例4L-山梨糖的分離按照實施例3的方法之后呈現的發酵肉湯含有約25-26％(重量)的L-山梨糖，低于約0.1％(重量)的D-山梨醇、剩余的生長培養基(溶解或懸浮)和1-2g菌群/升。將該發酵肉湯保持在約50℃，防止細菌進一步生長和山梨糖損失。
首先在60-80℃和0.02bar的壓力下在第一個濃縮步驟中在常規降膜蒸發器中將該發酵肉湯濃縮至山梨糖含量為約42％(重量)。在第二步中，在57℃和0.02bar的壓力下在常規長管蒸發器中將其進一步濃縮。通過該第二步蒸發，使得濃縮的L-山梨糖溶液達到過飽和。結晶含量為約30-50％(體積)。然后將用這種方式獲得的粗結晶混懸液轉移到常規沉降容器中。在其底部區域，一段時間之后形成基本上沒有菌群的非常濃的結晶混懸液。將該結晶懸液與上清液分離，離心，用水洗滌并在約90℃下干燥至殘余水分含量低于0.1％(重量)。
然后如上所述，進一步處理所得母液、洗滌液和沉降容器中的上清液，如果適宜的話在與來自另一批次的發酵肉湯合并處理。
以所用D-山梨醇為基礎的總收率在結束處理之后通常為約89-92mol％。以這種方式制備的產物用作制備L-抗壞血酸的起始產物。
實施例5氧化葡糖桿菌的調理a)以與上面培養基c)相似的方式(比較實施例1)，制備D-山梨醇含量為約10％(重量)的無菌不含瓊脂的液體培養基(850ml總體積于2升培養容器中)。該培養基接種150ml新制備的未調理的氧化葡糖桿菌菌株接種培養物。
在劇烈搖動(80rpm)的有氧條件(大氣)下將接種的培養基(pH5)在32℃下培養。連續發酵，直到不再能觀察到明顯的L-山梨糖形成。從發酵肉湯中取出150ml體積并用于接種在這期間制備并具有11％(重量)D-山梨醇含量的另一無菌培養基。重復上面步驟，同時逐漸(1％梯度)增加山梨醇濃度，直到獲得在約30％重量濃度D-山梨醇的培養基中生長的細菌培養物。
b)為了進一步優化L-山梨糖合成性能，因此將得到的適于高山梨醇濃度的氧化葡糖桿菌培養物連續地接種到30％重量濃度D-山梨醇的培養基(150ml接種物/850ml培養基)中。當培養約24小時之后約90-98mol％的所用山梨醇轉化時達到最佳合成性能。
權利要求
1.一種高度耐受D-山梨醇的氧化葡糖桿菌菌種的細菌，它是通過在逐步增加的初始D-山梨醇濃度中培養低耐性氧化葡糖桿菌菌株，使該菌株逐漸適應培養基中較高的D-山梨醇濃度，使該低耐性的氧化葡糖桿菌菌株得到調理獲得的。
2.權利要求1的細菌，其中D-山梨醇濃度逐步從初始的約5-10％(重量)增加至最終濃度約25-38％(重量)。
3.前面權利要求任一項的細菌，其特征還在于它具有基本上穩定的L-山梨糖合成性能。
4.權利要求3的細菌，它是通過在較高山梨醇濃度下重復培養耐山梨醇的細菌，直到L-山梨糖形成結束獲得的。
5.權利要求1-4任一項的細菌，其中使用氧化葡糖桿菌NRRL-B72進行調理。
6.前面權利要求任一項的細菌，其中它a)在有氧條件下將D-山梨醇轉化成L-山梨糖；b)以單個、成對或短鏈非運動、革蘭氏陰性、不形成孢子的桿狀形式存在；和c)在山梨醇-葡萄糖-酵母提取物-瓊脂培養基和山梨醇-玉米漿培養基中在pH3.5-6，溫度為25-40℃和D-山梨醇濃度到約38％(重量)下生長良好。
7.一種半連續發酵生產L-山梨糖的方法，該方法包含a)將氧化葡糖桿菌菌種的細菌接種到含有D-山梨醇的第一個培養基中并培養它，直到該D-山梨醇轉化基本上結束；b)轉化結束之后，將形成的L-山梨糖從大部分所得培養肉湯中分離出來；c)將剩余量的培養肉湯以重量比1∶4-1∶8接種到第二個含D-山梨醇的培養基中并培養它，直到D-山梨醇轉化基本上結束；和d)轉化結束之后，將形成的L-山梨糖從培養肉湯中分離出來；每種情況下培養基接種之后的初始D-山梨醇濃度最高約38％(重量)。
8.權利要求7的方法，其中根據需要重復包括步驟a)-c)的發酵循環。
9.權利要求7和8任一項的方法，其中發酵溫度為約25-40℃。
10.權利要求7-9任一項的方法，其中將新接種的培養基的pH調整至約pH5-6，并且在發酵過程中降至不低于約pH3.5。
11.權利要求7-10任一項的方法，其中在供應約0.5-1.5升大氣/升培養基/分鐘的情況下進行發酵。
12.權利要求7-11任一項的方法，其中接種之后，將該培養基培養約15-30小時。
13.權利要求7-12任一項的方法，其中在使用的培養基中每kg培養基包含a)約100-300g D-山梨醇b)約4-5g玉米漿(50％干基)c)約0.4-0.6g(NH4)2SO4d)約0.1-0.15g(NH4)2HPO4e)約0.06-0.1gMgSO4.7H2Of)約0.5-0.9gCaCO3g)有效量的消泡劑。
14.權利要求7-13任一項的方法，其中使用權利要求1-6任一項所定義的細菌。
15.一種制備2-酮-L-古洛糖酸的方法，該方法包含a)使用權利要求7-14任一項的方法通過發酵將D-山梨醇轉化成L-山梨糖，和b)就地或中間分離之后將以這種方式制備的L-山梨糖以常規方式轉化成2-酮-L-古洛糖酸。
16.權利要求1-6任一項的細菌用于由D-山梨醇制備L-抗壞血酸的用途。
17.一種生產高度耐受D-山梨醇的細菌的方法，該方法包含將權利要求1-5任一項的氧化葡糖桿菌菌種的細菌進行調理。
全文摘要
本發明涉及高度耐受D－山梨醇的氧化葡糖桿菌菌種;其生產方法;以及一種由D－山梨醇半連續發酵生產L－山梨糖的方法。
文檔編號C12P19/00GK1346401SQ00803945
公開日2002年4月24日 申請日期2000年2月18日 優先權日1999年2月19日
發明者A·M·雅各布森, K·H·尼爾森 申請人:Basf公司