編碼β－微管蛋白的DNA及其應用的制作方法

專利名稱：編碼β－微管蛋白的DNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及到編碼β-微管蛋白的DNA，該微管蛋白來自圓線科(strongylidae)的線蟲，還涉及到該DNA所編碼的多肽，該DNA在對這些線蟲的驅腸蟲藥物抗性進行診斷中的應用、在對這些線蟲的種類進行鑒別中的應用、β-微管蛋白作為一種疫苗的一個組分的應用，以及一種用于對新的驅腸蟲或抗生素化合物進行鑒別的方法。
寄生類蠕蟲(蠕蟲)造成人類和動物的健康問題并且導致可觀的經濟損失。在1996年，世界范圍內用于驅腸蟲藥物的花費超過了20億美元。目前所使用的最重要的驅腸蟲藥物根據其作用機制可以被分為3類1.環脒噻嘧啶和Morantel，同imidazothiazoles四咪唑和左旋四咪唑一起作為寄生蟲的神經系統的膽堿能受體發揮作用。
2.苯并咪唑為微管多聚化的抑制劑并且導致微管單倍的解聚，隨后一系列細胞功能喪失，例如細胞內轉運和細胞分裂。
3.大環內酯類結合并打開谷氨酰胺能氯通道并且隨后作為線蟲和節肢動物的神經系統的抑制劑發揮作用。
微管通過微管蛋白亞基而構建。微管蛋白為一種二聚體蛋白，該蛋白由α-和β-微管蛋白組成并且處于微管蛋白和微管的一種動態平衡之中。該平衡可受到外源物質的影響，該物質被稱為微管抑制劑。這樣的抑制劑的其中一些，例如苯并咪唑，通過同微管蛋白相結合而起作用，由此它們阻止了這些亞基自解離以形成微管，而同時在相反的一端該微管的解體在繼續進行。由此，細胞內的維系生存的進程發生了功能紊亂并且最終發生了細胞和整個生物體的死亡(Lacey，E.(1990)Mode of action of benzimidazoles.Parasitology Today6，112-115)。這樣的微管抑制劑包括多類化合物，這些化合物可以人工合成制備或者由各種生物體產生。
微管抑制劑同來自各種生物體的微管蛋白的結合在結合的親合性上表現出巨大的差異。由此，驅腸蟲藥物奧芬達唑(oxfendazole)和噻苯達唑(thiabendazole)對于來自ascarida galli的微管蛋白表現出高親合性而對諸如綿羊這樣的哺乳類動物的微管蛋白僅僅表現出低微的親合性(Dawson et al.(1983)Purification andcharacterisation of tubulin from the parasitic nematode，Ascaridia galli，Molecular and Biochemical Parasitoloigy7，267-277)。苯并咪唑的選擇毒性可通過這一選擇性親合性來解釋(Lacey，E.(1988)The role of the cytoskeletal protein，tubulin，in the mode of action and mechanism of drug resistanceto benzimidazoles，Internationl Journal for Parasitology 18，885-936)。
這些驅腸蟲藥物的廣泛使用已經導致了對這三類藥物的相當嚴重的抗性問題，特別是在家畜之中(Bauer et al.(1994)Anthelminticresistance in nematodes of farm animals. A seminar organizedfor the European Commission，Brussels，Belgium，8 to 9November 1993，pp.17-24)。最廣為使用的驅腸蟲藥物為苯并咪唑。對苯并咪唑的抗性已經在世界范圍內在綿羊、牛、豬、和馬的寄生蟲病例之中有所描述。苯并咪唑是一種廣譜驅腸蟲藥物，它可作用于線蟲、絳蟲和吸蟲。在德國種馬農場中的調查在80％以上的情況下顯示出小圓線蟲對苯并咪唑的抗性(Ullrich et al.(1988)Benzimidazole resistance to small strongylids(Cyathostominae)distribution in horse stock in Nothrhine-Westphalia，BerlinerMünchner Tierrztliche Wochenschrift 101，406-408)。
對于以驅腸蟲藥物進行的有效治療，獲得關于在馬體內或馬群中的蠕蟲的可能抗性的信息是十分重要的。為檢查小圓線蟲(kleinenStrongyliden)的一個蠕蟲群體的可能的抗性已經開發出一種診斷方法，該方法基于在寄生蟲發育階段(卵、蚴)的驅腸蟲藥物的活性(Coles et al.(1992)World Association for the Advancement ofVeterinary Parasitology(W.A.A.V.P.)Methods for the detectionof anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance，Veterinary Parasitology，44，35-44)。“蚴發育分析”(LDA)描述了驅腸蟲藥物在非寄生的第一蚴階段的效果對于所使用的驅腸蟲藥物濃度的函數。通過類似的方式，第二種方法，“卵孵化分析”(EHA)使用驅腸蟲藥物在蚴的孵化中的抑制作用作為所使用的驅腸蟲藥物濃度的函數。這兩個方法的缺點在于結果的低可重復性。進一步，這兩種方法均耗時費力。
進一步，這兩種方法的敏感性均很低。存在的抗性只有在25％以上的群體為抗性時才能被檢測到(Roos et al.(1995)New geneticand practical implications of selection for anthelminticresistance in parasitic nematodes，Parasitoligy Today 11，148-150)。
因此，迫切需要敏感、迅速和可重復的診斷方法。對于綿羊寄生蟲捻轉血矛線蟲(haemonchus contortus)和Teladorsagiacircumcincta，一種基于PCR技術的方法已經有所描述。這是根據于β-微管蛋白同型l基因在密碼子200上的至少一個點突變(Elardet al.(1999)PCR diagnosis of benzimidazole-susceptibilityor-resistance in natural population of the small ruminantparasite，Teladorsagia circumcincta，Veterinary Parasitology80，231-237)。在密碼子200上的點突變導致酪氨酸對苯丙氨酸的氨基酸替換并且同該突變蛋白的苯并咪唑抗性相關聯(Kwa et al.(1995)β-tubulin genes from parasitic nematode haemonchuscontortus modulate drug resistance In Caenorhabditis elegans，Journal of Molecular Biology 246，500-510)。
從對捻轉血矛線蟲的研究中已知編碼微管蛋白的線蟲序列是種屬特異的(WO 92/03549)。
馬的小圓線蟲的各種類的區別在于流行病學發生頻率。世界上最重要和最常見的種類包括細頸杯環線蟲(Cylicocyclus nassatus)、冠狀盅口線蟲(cyathostomum coronatum)、碗狀盅口線蟲(cyathostomum catinatum)。這些種類對于苯并咪唑的抗性已經在不同國家中有所描述，包括在德國(Burger，H-J.and Bauer，C.(1987)Efficacy of four anthelmintics against benzidazole-resistant cyathostomes of horse，Veterinary Record 120，293-296)。
根據本發明，來自小圓線蟲種類的β-微管蛋白cDNA的核酸序列所具有的同一性大于95％。但是，上文提及的已知的綿羊寄生蟲β-微管蛋白的序列的同一性僅為75.4-82.6％。
本發明的序列范圍內的所產生的氨基酸序列非常相似。對于綿羊寄生蟲的所產生的β-微管蛋白氨基酸序列也是這樣。同一性在95到99.8％之間。僅有非常少的位置發生了氨基酸替換。在此著重強調的為密碼子200，在該密碼子中一個苯丙氨酸被酪氨酸替換。
但是，迄今為止來自發表的各種蠕蟲種類的非編碼β-微管蛋白序列均不表現出明顯的同一性。因此而令人吃驚的是在此提出的申請中的各種小圓線蟲種類的編碼和非編碼部分的序列具有很高的同一性。
因此，這些區域適合于區分不同種類的小圓線蟲以及其它線蟲種類。衍生自這些內含子區域的PCR引物可被用于在一個含有來自其它蠕蟲生物體的遺傳物質的樣品中進行的對小圓線蟲的特異性檢測。
來自線蟲或其部分的β-微管蛋白已知具有一種保護性的免疫能力(Bughio et al.(1993) Characterisation and Biologicalactivities of anti-Brugia pahangi tubulin monoclonalantibodies，International Journal for Paraitology，7，913-924)。由于單克隆抗體可被使用而針對該β-微管蛋白，由上文提及的DNA編碼的小圓線蟲的β-微管蛋白可被用作一種疫苗。
微管蛋白或其亞基的相互作用的抑制劑，如苯并咪唑、colchizine和紫杉醇是一系列針對人類、動物或植物疾病的治療的引導結構(Leistrukturen)。微管蛋白用于尋找控制這些疾病的新活性化合物的能力延伸和強化了其作為這些化合物的靶位的重要性。
本發明還涉及到用于編碼來自圓線科特別是cyathostominae亞科的線蟲的β-微管蛋白的DNA或其片段。在該情況下該β-微管蛋白DNA可以為基因組DNA或cDNA。本發明涉及到的DNA序列可被認為是圓線蟲目特別是cyathostominae亞科的寄生性線蟲的微管蛋白基因科的新成員。本發明特別地涉及到編碼來自盅口線蟲屬和環杯線蟲屬的寄生性線蟲的β-微管蛋白的DNA序列。
本發明還涉及到一些DNA序列，這些DNA序列同編碼SEQ IDNO.2、4、6、8或10所描述的氨基酸序列之一的多核苷酸具有高于85％的同一性。
本發明還涉及到一些優選的DNA序列，這些DNA序列同編碼SEQID NO.2、4、6、8或10所描述的氨基酸序列之一的多核苷酸具有高于95％的同一性。
本發明特別涉及到編碼β-微管蛋白的DNA序列，這些序列來自盅口線蟲屬和環杯線蟲屬的寄生性線蟲，本發明特別涉及到來自細頸杯環線蟲種的寄生性線蟲的序列，在優選的情況下涉及到的DNA由SEQID NO.3、5、7、9、或11所描述或來自冠狀盅口線蟲(Cyathostonumcoronatum)，在優選情況下為SEQ ID NO.1的DNA。
本發明還涉及到上文描述的DNA，該DNA同這些DNA相比較在密碼子200具有至少一個點突變如一個核苷酸替換。這些點突變導致由該DNA所編碼的氨基酸序列中的變化，例如，氨基酸苯丙氨酸被酪氨酸替換，并且這些點突變正相關于具有適當的突變的微管蛋白對苯并咪唑的抗性。
本發明還涉及到一些DNA序列，這些序列同上文所描述的DNA或其片段相互補。這些DNA序列或片段含有的寡聚核苷酸來自上文描述的DNA序列之一或SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11所描述的序列，或來自同上述序列具有85％同一性的序列之一，在優選情況下為具有95％的同源性的序列，并且還來自同其互補并可以雜交的鏈。
本發明在此優選地涉及到一些寡聚核苷酸，這些寡聚核苷酸含有SEQ ID NO.12到SEQ ID NO.51所描述的序列之一或由其組成，這些序列同上述的DNA序列可雜交，在優選的情況下雜交在該β-微管蛋白基因的非編碼序列部分的區域上進行。
本發明還在優選的情況下涉及到一些寡聚核苷酸，這些寡聚核苷酸含有SEQ ID NO.12到SEQ ID NO.51所描述的序列之一或由其組成，這些序列同上述序列的編碼區雜交。
本發明還涉及到一些RNA序列，這些序列同上述的DNA序列或其片段互補的RNA序列，本發明還涉及到這些RNA序列的片段。這些RNA序列或片段所含有的核糖寡聚核苷酸衍生于上文所提及或SEQ IDNO.1、3、5、7、9、或11所描述的DNA序列，與上述序列具有85％同一性，在優選情況下為具有95％的同一性，并且衍生于與之互補的鏈，且可以同這些序列雜交。
本發明還涉及到一種含有上文所描述的DNA序列之一的表達結構體以及一種與其相連的DNA序列，該序列使得該DNA的表達成為可能。這些包括，例如，至少一個用于組成型或者誘導型表達的啟動子或替代性的增強子。用于在大腸桿菌中表達的適當的啟動子為天然雜合的或細菌噬菌體啟動子，在優選的情況下為λ噬菌體、hsp、omp或合成啟動子的群體，例如在WO 98/5625、DE 3 430 683或者EP 0173 149中作為例子所描述的啟動子。
本發明還涉及到一些載體，這些載體含有一種上文所描述的DNA序列，并且這些載體使得本發明的β-微管蛋白或其片段在一種宿主細胞中的表達成為可能。
本發明還涉及到一些宿主細胞，這些宿主細胞含有上述的DNA、上述的表達結構體或者一種載體，并且該宿主細胞允許β-微管蛋白或其片段的表達。
本發明還涉及到一些多肽及其片段，這些多肽由上述的DNA序列或這些DNA序列的片段所編碼。
本發明在這種情況下還優選地涉及到一些多肽，這些多肽由含有SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11的DNA序列、同這些序列具有85％同一性的序列所編碼，優選情況下為95％的同一性，或由該DNA的片段所編碼。
本發明還涉及到一些多肽及其片段，這些多肽由上述的DNA序列所編碼，該DNA片段如上所述在密碼子200處至少含有一個點突變，并且該多肽表現出對苯并咪唑的抗性。
本發明在這種情況下還特別優選地涉及到一些多肽或其片段，這些多肽含有在SEQ ID NO.2、4、6、8或10中所描述的氨基酸序列之一。
本發明在這種情況下涉及到一些多肽，特別涉及到純化的多肽或重組方法制備的多肽。
本發明涉及到全長的多肽以及這些多肽的一些對應片段，例如特定的基序或結構域。這些片段可以長度各不同一并且含有，例如，5、10、25、50、100、150、200、250或300個氨基酸。
本發明還涉及到含有上述多肽的融合蛋白。該融合蛋白在該情況下可含有一種其它的不與β-微管蛋白相連的多肽組分(例如LexA、B42、谷胱甘肽S-轉移酶、組氨酸標記、具有諸如堿性磷酸酶這樣的酶活性的多肽或一種表位標記)。
本發明還涉及到一種制備方法，該制備方法用于在適當的原核或真核表達系統中制備上文所描述的多肽。該表達在這種情況下可如上文所述在各種情況所對應的細胞系或對應的宿主細胞中穩定或者瞬時進行。適當的原核表達系統為已知的宿主-載體系統，例如細菌(例如streptomyces spp.、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門菌、粘質沙雷菌，特別是大腸埃希氏桿菌)。
在優選的情況下，真核系統中的表達在桿狀病毒系統中進行，特別是在可以引入翻譯后修飾的系統中進行。
本發明還涉及到上文所述的DNA在對來自圓線科的線蟲的DNA的檢測中的應用，在優選的情況下該檢測針對cyathostominae亞科，特別優選的情況下針對盅口線蟲屬和環杯線蟲屬，非常特別優選的情況下針對冠狀盅口線蟲種和細頸杯環線蟲種。本發明在這種情況下涉及到如上文所述的寡核苷酸，這些寡核苷酸同編碼β-微管蛋白的DNA或其互補鏈互補，并且該寡核苷酸可同該DNA雜交。在優選的情況下，這些寡核苷酸同內含子區域相雜交，即，同非編碼DNA序列雜交。本發明涉及到這些寡核苷酸或其部分的使用，該寡核苷酸或其部分被用作a)Northern或Southern印跡分析中的樣品b)診斷方法中的PCR引物，該方法用于檢測上文提及的具有苯并咪唑抗性線蟲，所涉及的線蟲的DNA經具體的鑒定并在該引物和PCR技術的輔助下擴增。
本發明在該情況下優選地涉及到一些寡核苷酸，該寡核苷酸含有SEQ ID NO.12至51所描述的序列之一或由其組成。
本發明還涉及到上文所述的DNA在對來自圓線科的線蟲的DNA的檢測中的應用，在優選的情況下該檢測針對cyathostominae亞科，特別優選的情況下針對盅口線蟲屬和環杯線蟲屬，非常特別優選的情況下針對細頸杯環線蟲種和冠狀盅口線蟲種，該DNA編碼對苯并咪唑具有抗性的β-微管蛋白或其片段。本發明在這種情況下涉及到如上文所述的寡核苷酸，這些寡核苷酸同編碼具有苯并咪唑抗性的β-微管蛋白的DNA或其互補鏈互補，并且該寡核苷酸可同該DNA特異地雜交。
本發明涉及到這些寡核苷酸或其部分的使用，該寡核苷酸或其部分被用作a)Northern或Southern印跡分析中的樣品
b)診斷方法中的PCR引物，該方法用于檢測上文提及的具有苯并咪唑抗性的線蟲，所涉及的線蟲的DNA經具體的鑒定并在該引物和PCR技術的輔助下擴增。
本發明在該情況下優選地涉及到一些寡核苷酸，該寡核苷酸含有SEQ ID NO.12至51所描述的序列之一或由其組成。
本發明還涉及到一種方法，該方法用于對來自圓線科的線蟲的DNA進行檢測，在優選的情況下該檢測針對cyathostominae亞科，特別優選的情況下針對盅口線蟲屬和環杯線蟲屬，非常特別優選的情況下針對細頸杯環線蟲種和冠狀盅口線蟲種，其中的上文所描述的寡核苷酸同所述的生物體所產生的DNA序列特異性地雜交，并且該DNA序列可通過PCR技術的輔助而擴增。該雜交在優選的情況下在β-微管蛋白的非編碼區域進行(內含子)。
上文所述的生物體的檢測可通過以下方法進行a)產生一種寡聚核苷酸探針或引物，該探針或引物可同上述的編碼β-微管蛋白的DNA或其互補鏈或與其5’或3’-側生區域互補的鏈雜交，b)使該寡聚核苷酸探針或引物同一種通過適當方法制備的含有DNA的樣本(DNA enthaltenden Probe)相接觸，c)檢測該寡聚核苷酸探針或引物的雜交(例如，通過聚合酶鏈反應的輔助)，d)對該β-微管蛋白的被檢測序列進行測序，并且e)將該序列同本發明在上文所描述的DNA序列進行比較，在優選的情況下同在SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的DNA序列進行比較。
本發明還涉及到一種方法，該方法用于對來自圓線科的線蟲進行檢測，在優選的情況下該檢測針對cyathostominae亞科，特別優選的情況下針對盅口線蟲屬和環杯線蟲屬，非常特別優選的情況下針對細頸杯環線蟲種和冠狀盅口線蟲種，這些線蟲對苯并咪唑具有抗性，其中的上文所描述的寡核苷酸同所述的生物體所產生的DNA序列特異性地雜交，并且該DNA序列可通過PCR技術的輔助而擴增。該雜交在優選的情況下在β-微管蛋白的非編碼區域進行(內含子)。
上文所述的生物體的檢測可通過以下方法進行
a)產生一種寡聚核苷酸探針或引物，該探針或引物可同上述的編碼β-微管蛋白的DNA或其互補鏈或與其5’或3’-側生區域互補的鏈雜交，b)使該寡聚核苷酸探針或引物同一種通過適當方法制備的含有DNA的樣本相接觸，c)檢測該寡聚核苷酸探針或引物的雜交(例如，通過聚合酶鏈反應的輔助)，d)對該β-微管蛋白的被檢測序列進行測序，并且e)將該序列同本發明在上文所描述的DNA序列進行比較，在優選的情況下同在SEQ ID N0.1、3、5、7、9、或11中所描述的DNA序列進行比較，其在密碼子200具有至少一個點突變該點突變導致了這些序列所編碼的β-微管蛋白對苯并咪唑的抗性。
本發明還涉及到一種診斷測試試劑盒，該試劑盒用于對圓線科的線蟲進行檢測和鑒別，在優選的情況下該檢測和鑒別針對cyathostominae亞科，特別優選的情況下針對盅口線蟲屬和環杯線蟲屬，非常特別優選的情況下針對細頸杯環線蟲種和冠狀盅口線蟲種，除此之外該試劑盒還可提供上文所描述的寡核苷酸，這些寡核苷酸可在對所提及的種類進行檢測的方法中使用。本發明還可產生一些寡聚核苷酸，這些寡聚核苷酸可同在SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的DNA序列、同這些序列互補的序列、在密碼子200具有至少一個突變的序列或這些序列的片段進行特異性雜交。在該情況下，含有SEQ ID NO.12至51所描述的序列或由其組成的寡聚核苷酸是別優選的。
本發明還涉及到一種診斷測試試劑盒，該試劑盒用于對圓線科的線蟲進行檢測，在優選的情況下該檢測針對cyathostominae亞科，特別優選的情況下針對盅口線蟲屬和環杯線蟲屬，非常特別優選的情況下針對細頸杯環線蟲種和冠狀盅口線蟲種，這些線蟲對苯并咪唑具有抗性，除此之外該試劑盒還可提供上文所描述的寡核苷酸，這些寡核苷酸可在對所提及的種類進行檢測的方法中使用。本發明還可產生一些寡聚核苷酸，這些寡聚核苷酸可同在SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的DNA序列、同這些序列互補的序列、在密碼子200處具有至少一個突變的序列或這些序列的片段進行特異性雜交。在該情況下，含有SEQ ID NO.12至51所描述的序列或由其組成的寡聚核苷酸是別優選的。
本發明還涉及到一種如上文所描述的試劑盒，其中向在該試劑盒中所產生的寡聚核苷酸提供一種可檢測的標記。這樣的可檢測標記可特別地包括酶、酶的底物、輔酶、酶抑制劑、熒光標記、生色團、發光標記和放射性同位素。
本發明還涉及到一些抗體，這些抗體同β-微管蛋白的一個表位特異地反應，該β-微管蛋白來自圓線科的線蟲，在優選的情況來自cyathostominae亞科的線蟲，特別優選的情況下來自盅口線蟲屬和環杯線蟲屬，非常特別優選的情況下來自細頸杯環線蟲種和冠狀盅口線蟲種。
本發明還涉及到一些單克隆抗體，這些抗體同β-微管蛋白的一個表位特異地反應，該β-微管蛋白來自圓線科的線蟲，在優選的情況來自cyathostominae亞科的線蟲，特別優選的情況下來自盅口線蟲屬和環杯線蟲屬，非常特別優選的情況下來自細頸杯環線蟲種和冠狀盅口線蟲種。
本發明還涉及到上文所述的抗體作為殺線蟲劑的使用。
本發明還涉及到上文提及的β-微管蛋白多肽或其片段的使用，這些多肽或片段來自圓線科的線蟲，在優選的情況來自cyathostominae亞科的線蟲，特別優選的情況下來自盅口線蟲屬和環杯線蟲屬，非常特別優選的情況下來自細頸杯環線蟲種和冠狀盅口線蟲種，這些多肽或片段被用于制備一些疫苗，這些疫苗含有至少一種所述的β-微管蛋白多肽或其片段。該疫苗在這種情況下能夠產生一種免疫反應，該反應對于上文所描述的某種β-微管蛋白多肽是特異的。
在一個優選的實施方案中，該疫苗含有一種抗原決定簇，例如，一種多肽的獨立決定簇，該多肽含有在SEQ ID NO.2、4、6、8或12中所描述的一種氨基酸序列或者由上文提及的DNA或其片段所編碼的一種氨基酸序列。
本發明還涉及到一種制備方法，該制備方法用于制備一種免疫原性組合物，該組合物用于對一種哺乳類動物進行免疫化，該免疫原性組合物由至少一種上文提及的本發明的β-微管蛋白多肽或其片段或者至少一種上文提及的抗體組成。
本發明還涉及到上文所述的載體的使用，該載體含有一種編碼本發明的一種β-微管蛋白的核酸，在優選的情況下該載體含有由SEQ IDNO.1、3、5、7、9、或11中所描述的序列或其片段或與其同源的序列，該載體用于制備一種免疫原性組合物，該組合物用于對一種宿主進行給藥以在該宿主中激活一種保護性免疫反應，該反應針對來自寄生性線蟲的β-微管蛋白。
本發明還涉及到一種免疫原性組合物，該組合物含有一種載體(含有一種編碼本發明的β-微管蛋白的核酸，在優選的情況下該載體含有由SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的序列或其片段或與其同源的序列，以及一種啟動子序列，該序列同所述的核苷酸序列功能性地連接并且控制本發明的β-微管蛋白的表達，該表達產生一種免疫反應)以及一種適用于藥學目的賦形劑。
本發明還涉及到一種方法，該方法用于對調控微管蛋白之間的相互作用或微管蛋白的亞基之間的相互作用的物質進行鑒定。該方法基于微管蛋白的應用，在優選的情況下基于來自寄生性線蟲的微管蛋白，特別優選的情況下基于來自圓線蟲目的寄生性線蟲的微管蛋白，非常特別優選的情況下基于來自圓線科的寄生性線蟲的微管蛋白，最優選的情況基于來自cyathostominae亞科的寄生性線蟲的微管蛋白。在該方法中使用的β-微管蛋白的一個特別優選的群體為來自盅口線蟲屬和環杯線蟲屬的寄生性線蟲的微管蛋白。
本發明涉及到對一些物質的鑒定，例如對有機小分子的鑒定，這些有機小分子能夠調節微管蛋白分子或其亞基之間的相互作用。在優選的情況下，本發明涉及到對該相互作用進行抑制的化合物的鑒別。
本發明還涉及到一種上文描述的方法，該方法基于a)將待測物質同該微管蛋白相接觸，所選用的條件允許該微管蛋白分子相互之間的相互作用以及待測物質同微管蛋白的結合。
b)通過測定該微管蛋白分子之間的相互作用的能力而對所發生的結合進行檢測，以及c)將在該測試物質存在的情況下該微管蛋白分子之間的相互作用的能力同不存在該測試物質的情況下進行比較。
本發明還涉及到一種方法，該方法用于對調控微管蛋白之間的相互作用能力的物質進行鑒定。在特別優選的情況下，本發明在此涉及到一種方法，該方法使用了上文描述的一種多肽，該多肽由上文所描述的DNA其片段所編碼，特別由含有SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的序列或由其組成的DNA所編碼，以及由同上述序列具有85％的同一性的序列編碼，在優選的情況下為具有95％的同一性的序列，并且這些序列所編碼的β-微管蛋白具有在SEQ ID NO.2、4、6、8或10中所描述的一種氨基酸序列。
本發明還涉及到一種方法，該方法用于對調控上文所述的微管蛋白之間的相互作用能力的物質進行鑒定，所使用的方法基于在一種測試物質存在的情況下對微管蛋白的相互作用的調控的檢測，該檢測由基于細胞的檢測系統輔助完成。這樣的一種檢測系統的一個優選的方案為“雙雜交系統”(US 5 283 317，Zervos et al.(1993)Cell72，223-232；WO 94/10300)。該系統適用于通過引發可檢測信號的相互作用對兩種蛋白間的相互作用進行描述或提供證據支持。這樣的系統還可適配成為一種具有高通量(throughput numbers)的測試系統。
本發明還涉及到一種方法，該方法用于對調控上文所述的微管蛋白之間的相互作用能力的物質進行鑒定，所使用的方法基于在一種測試物質存在的情況下對微管蛋白的相互作用的調控的檢測，該檢測由一種無細胞檢測系統輔助完成。這樣的一種檢測系統的一個特別優選的實施方案為“閃爍近似分析”(SPA)(EP 015 473)。該測試系統基于對一種受體的相互作用的檢測，受體的例子如具有配基的微管蛋白分子，該受體結合于微球體或小珠，該微球體或小珠具有一種閃爍分子。如果受體-配基復合體解離，可以檢測到一種信號。
本發明還涉及到一些物質，這些物質迄今為止未被描述，這些物質在上文所描述的方法的輔助下進行鑒定，并且這些物質適于調節微管蛋白分子的相互作用，在優選的情況下抑制該相互作用。
本發明還涉及到一些物質的迄今為止未被描述的應用，這些物質使用上文所描述的一種方法進行鑒定，該應用用于制備一種制劑，該制劑用于對可能受到或已經受到線蟲侵襲的動物體或人類進行預防性或治療性處理。本發明的這些制劑含有至少一種通過上文所描述的方法進行鑒定的物質，并且這些制劑可通過鼻腔、皮膚、腸道外或腸道內進行給藥。
為更好地理解，在諸如實施例或附上的權利要求這樣的描述中所使用的特定用詞或術語的意義在下文進行更詳細的解釋。
與蛋白質或DNA相關的術語“片段”描述的為在SEQ ID NO.1到11中所描述的核酸或氨基酸序列、同其互補的序列或同其85％同一，在優選的情況下為95％同一的序列的某些部分。該DNA和多肽序列的片段含有至少5個核苷酸或氨基酸，但可含有多至447個氨基酸或1343個核苷酸，或者在序列由SEQ ID NO.11描述的情況下可高達2565個核苷酸。
術語“同源性”、“同一性”或“相似性”涉及到兩個肽或核酸分子間的序列相似性。同源性可通過將每個序列中的某一位置在各種情況下同另一序列進行比較而測定。如果在被比較序列中的一個位置被同一種堿基或氨基酸占據，那么這兩種分子在該位置上是同源的。序列間的同源性的測量結果為這些序列共同具有的對應或同源位置數量的函數。“非同源”序列所具有的同一性低于40％，但在優選的情況下低于25％。
術語“同源”特別指長度為至少15個堿基對的DNA片段或同該DNA互補的鏈，這些DNA至少85％，在優選的情況下95％的核苷酸同對應的DNA一致。同源性特別可以在計算機方法的輔助下測定，如GCG方法(Devereux et al.(1983)，Nucleic Acids Res.12，387-395)。
在一個DNA片段可以同相關的DNA鏈或其互補片段雜交時也存在“同源性”。
術語“進行雜交”或“雜交”描述的是一種方法，在該方法中一條單鏈核酸分子同一條互補的DNA鏈進行堿基配對，單鏈核酸分子的能力取決于雜交條件的嚴格性。
術語“嚴格性”涉及到雜交條件。如果造成堿基配對困難則產生“高嚴格性”。如果對堿基配對進行輔助則產生“底嚴格性”。
術語“互補”涉及到嘌呤和嘧啶核苷酸之間通過氫鍵形成堿基對的能力。互補堿基特別為鳥嘌呤和胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶以及腺嘌呤和尿嘧啶。
本領域中的技術人員明了，由于兼并遺傳密碼子(即，對應于20種氨基酸的64種密碼子)，眾多的核苷酸堿基的“沉默”替換因此可被引入編碼序列而不改變所編碼的蛋白產物的同一性。這樣的全部替換均被包含入本發明的范圍內。
術語“特異性雜交”涉及到本發明中的一種核酸分子同上述的一種β-微管蛋白基因的6、12、20、30、50、100、150、200、300、350、400或440個連續的核苷酸進行雜交的能力，在優選的情況下該β-微管蛋白基因為SEQ ID NO.1、3、5、7、9、或11中所描述的序列或與其同源或互補的序列，即，通過該途徑雜交的分子同細胞核酸相比(例如，mRNA或基因組DNA)多出10倍，在優選的情況下多出100倍，在特別優選的情況下多出100倍，該細胞核酸編碼上文所述的β-微管蛋白以外的蛋白。
術語“質粒”涉及到一種染色體外的遺傳元件。用于本發明的源質粒可以是通過商業購得、免費獲取或者可來自于根據已知的方法獲得的質粒。
術語“載體”描述的為一種DNA元件，該元件被用于向宿主細胞中引入外源DNA。載體含有一種核苷酸序列，該序列編碼一種或多種多肽。能夠控制其所含有的基因的表達的載體被稱為“表達載體”。
術語“基因”在本發明的范圍內涉及到一種核酸，該核酸含有一種開放讀碼框架，該框架編碼上文所描述的一種β-微管蛋白多肽。此處還包括外顯子和可能的內含子序列。
術語“進行相互作用”或“相互作用”描述的為分子間的相互作用。此處還包括術語“結合”在內。
術語“調節”涉及到對一種生化方法的刺激和壓制或者抑制。在本發明的范圍內，“調節”指的是對微管蛋白多肽或片段或其亞基之間的相互作用的抑制或壓制，或者指對該相互作用的刺激，這些刺激和壓制或者抑制可以表現在，例如，微管蛋白之間的一種不可逆的結合。
術語“核酸”涉及到一些多核苷酸，如脫氧核糖核苷酸(DNA)，或者如果適當還涉及到核糖核苷酸(RNA)。該術語還等價地包括RNA或者DNA的類似物，該類似物從核苷酸類似物制備，并且在相關的情況下還包括單鏈(“正義”或“反義”)以及雙鏈多核苷酸。
術語“啟動子”涉及到一些DNA序列，這些序列調節特異的某個DNA的表達，該DNA同該啟動子功能地連接。該術語還涉及到“組織特異性”啟動子，即，僅在特定的細胞(例如，一種特定的組織的細胞)中控制該特異基因的表達的啟動子。“非組織特異性”啟動子以及引導組成型表達的啟動子或可誘導啟動子也包括在內。
術語“蛋白質”、“多肽”或“肽”如果涉及到一種基因產物，則它們在本應用的范圍內的使用中是可互換的。
“融合蛋白”為編碼上文描述的一種β-微管蛋白多肽的第一種氨基酸序列同第二種氨基酸序列的融合物，該第二種蛋白同該微管蛋白序列不具備同一性或功能上的同源性。該第二種蛋白在此于第一種蛋白產自同一生物體，或者在替代情況下可產自另一種生物體(基因間)。融合蛋白通常可以公式X-微管蛋白-Y來表示，其中微管蛋白為上文所述的一種多肽，而X和Y為一種同微管蛋白氨基酸序列不相連的多肽。X或Y可以互相獨立的缺少。
術語“細胞”或者“宿主細胞”可在本應用的范圍內以同一的含義使用。根據理解這些術語不僅涉及到個體細胞而且涉及到這些細胞的后代。由于在后代中的特定的修飾(例如，突變)這樣的后代可能與干細胞并不同一，但它們也包含于本發明內。
術語“內含子”描述的為被轉錄但隨后通過“剪切”從該轉錄本中除去的所述DNA序列，該DNA在優選情況下為基因組DNA，其鄰近序列(內含子)在剪切后被連接。
核酸如所描述，本發明的一個方面涉及到一些核酸序列，這些序列來自于圓線科的線蟲，特別來自cyathostominae亞科的線蟲，非常特別的情況下來自盅口線蟲屬和環杯線蟲屬，尤其是細頸杯環線蟲種和冠狀盅口線蟲種，這些序列編碼β-微管蛋白多肽或其片段，或者涉及到這些序列的同源核酸，這些同源核酸同SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11中的序列具有85％的同源性，在優選的情況下具有95％的同源性，并且這些同源核酸編碼在SEQ ID NO.2、4、6、8或10中所描述的氨基酸序列或其片段。SEQ ID NO.3為來自細頸杯環線蟲種的編碼β-微管蛋白的核酸序列的簡并序列，其中“r”代表一種嘌呤(鳥嘌呤或腺嘌呤)，“y”代表一種嘧啶(胸腺嘧啶或尿嘧啶或胞嘧啶)，并且“w”代表一個腺嘌呤或胸腺嘧啶或一個尿嘧啶。SEQ ID NO.3由此而包括一批序列，這些序列可能存在于細頸杯環線蟲種的生物體內。SEQ ID NO5、7、和11中所描述的序列表示的為3個限定的編碼β-微管蛋白的序列，它們為SEQ ID NO.3所描述的序列的示例性和優選的實施方案。
同樣本發明的部分為寡核苷酸，這些寡核苷酸根據情況編碼β-微管蛋白多肽，這些多肽含有至少為2、5、10、25、50、100、150、200、250、300、350或400個氨基酸的長度。這樣的寡核苷酸可被用作引物或者反義分子(即，用作非編碼核酸)并且含有至少約6、12、24、30、60、100、120、150或210個堿基對，其中編碼核苷酸含有約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200或1300個堿基對。
本發明還描述了一些寡核苷酸，這些寡核苷酸在嚴格的條件下同SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11中描述的序列之一的核酸進行特異性雜交。其對應的嚴格條件為，例如，6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，在約45℃下進行，隨后在50℃下以2×SSC進行洗滌步驟，并且這些條件為本領域的技術人員所熟悉(例見，Current Protocol inMolecular biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6)。這樣，在洗滌步驟中的鹽濃度可經選擇以使該嚴格性較低(2×SSC，50℃)或較高(0.2×SSC，50℃)。進一步，洗滌步驟中的溫度可從用于低嚴格性的的條件(例如，約22℃)到高嚴格性的條件的范圍內進行變化(例如，約65℃)。鹽濃度和溫度均可變動并彼此進行適配。
特別優選的寡核苷酸在SEQ ID NO.12-51中進行描述，這些寡核苷酸可用作引物或者用于在一種諸如基因組DNA這樣的存在的DNA的鑒別和特征研究中的雜交。但是，其它寡核苷酸也可衍生自SEQ IDNO.1、3、5、7、9或11中描述的序列，這些寡核苷酸可隨后被用作引物或雜交。在存在的(基因組)DNA的內含子區域進行雜交的寡核苷酸對于種屬鑒定是特別優選的，對于這些種屬可以指定一種存在的DNA。在SEQ ID NO.11中以細頸杯環線蟲種為例描述了編碼β-微管蛋白的基因組DNA的內含子，所述的β-微管蛋白可分離自上文提及的線蟲。由此，這些內含子為定位于編碼外顯子之間的序列。在一個優選的實施方案中，所描述的引物和雜交探針含有一種標記基團，該基團使對該寡核苷酸的檢測成為可能，即，例如，放射性同位素、熒光基團、酶或酶輔因子。
這樣的寡核苷酸可被應用于診斷測試試劑盒以檢測一種存在的DNA的來源(即，生物體)。由于其同SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11所描述的DNA其片段、其同源序列以及互補序列能進行特異性雜交，這些寡核苷酸適于識別限定的序列。這樣，這些寡核苷酸還使對編碼β-微管蛋白的序列的識別和鑒定成為可能，這些序列由于在密碼子200上的一個或多個點突變而導致了苯并咪唑抗性β-微管蛋白的表達。由此，這些來自SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11寡核苷酸，在優選情況下SEQ ID NO.12到51所描述的實施方案，適用于對cyathostominae亞科的常見線蟲種類的鑒別以及對存在的苯并咪唑抗性的識別。
本發明的寡核苷酸可使用標準方法進行制備，這些方法為領域的技術人員所熟悉，例如，通過DNA從頭合成。
此處提及的核酸可以是部分純化或以生物學純的形式存在于完整細胞或者細胞裂解物中，即，如果其它細胞組分或化學前體和副產物在DNA為化學合成的情況下已經被分離出去。
編碼β-微管蛋白的核酸如上文所述可從mRNA開始而獲得，該mRNA存在于一批真核細胞中。從來自于相關的線蟲細胞的基因組DNA開始來獲得本發明的DNA也是可能的(見下文實施例)。編碼β-微管蛋白的一種基因可以通過，例如，一個cDNA文庫或者一個基因組DNA文庫來獲得。cDNA可通過分離一種細胞的總mRNA來獲得，例如一種線蟲細胞。從mRNA開始，雙鏈的cDNA可隨即被制備并且插入一個適當的質粒或適當的載體。本發明的DNA可通過在已知的多聚酶鏈反應(PCR)的輔助下進行擴增或在替代的情況下通過DNA從頭合成來獲得(又見J.Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning，2ndEdition，Chap.14)。
載體和質粒本發明還包括含有本發明的一種核酸序列的載體，該核酸序列同一種轉錄調控序列功能性地連接。“功能性地連接”意指該核酸序列同該調控序列的連接方式可以使該核酸序列所編碼的蛋白的表達被控制。“轉錄調節序列”包括，例如，啟動子、增強子以及其它控制元件。該表達載體含有，例如，一種編碼本發明的β-微管蛋白或其片段的基因。這些載體可被用于整合入細胞，在其中隨后形成了其對應的多肽或替代性的融合蛋白。適于在大腸桿菌中表達本發明的蛋白的啟動子包括天然雜合或者細菌噬菌體啟動子。在優選的情況下，它們為來自噬菌體λ啟動子、omp啟動子或合成的啟動子(又見WO98/15625，DE 3 430 683，EP 0 173 149)。適當的啟動子是可以購得的，例如pET系列(例如pET3a、pET23a、pET28a以及組氨酸標記或者具有組氨酸標記的pET32a)或者具有谷胱甘肽合成酶融合物的pGEX表達載體。這些表達載體可隨即被轉化入，例如，DE3-溶原性大腸桿菌菌株，如，BL21(DE3)、HMS174(DE3)或者AD494(DE3)。
該β-微管蛋白多肽的表達本發明還涉及到含有本發明的核酸序列(例如，被插入一個載體或者基因組的核酸)的細胞。這些宿主細胞可以是原核的或真核的細胞。
適當的原核表達載體為，例如，細菌系統，如streptomycesspp.、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門菌、粘質沙雷菌，在優選的情況下為大腸埃希氏桿菌。
一種優選的真核表達載體為桿狀病毒載體，特別優選的為允許翻譯后修飾的桿狀病毒系統。
其它的真核表達(例如，酵母，昆蟲細胞)也可使用。
多肽本發明還包括一些β-微管蛋白多肽，這些β-微管蛋白由本發明的DNA、其片段或上文所述的同源序列所編碼，在優選的情況下為SEQ IDNO.1、3、5、7、9或11所描述的DNA序列。這些β-微管蛋白多肽的優選的實施方案在SEQ ID NO.2、4、6、8和10設定的序列中描述。在一個優選的實施方案中，所描述的多肽為純化的多肽，該多肽中不含產生本發明的多肽的細胞中的蛋白污染。
所描述的多肽為全長的蛋白或其片段、基序或結構域，這些多肽含有至少5、10、25、50、75、100、125、150、200、250、300、350或400個氨基酸的長度。多肽片段可通過對多肽的測試而獲得和選擇，這些多肽由來自SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11所描述的序列的核酸片段所編碼。
這些多肽片段還可通過已知的方式進行化學合成。
本發明還包括一些多肽，這些多肽由SEQ ID NO.3所描述的簡并序列所編碼。由于在DNA序列的限定位置上的多種可能的堿基，在各種情況下產生了具有由所產生的密碼子編碼的一個氨基酸的多種多肽(various polypeptides result having an amino acid encodedby the codon resulting in each case)。由SEQ ID NO.3所描述的序列所編碼的多肽在SEQ ID NO.4中描述，可編氨基酸被標記為“Xaa”。
這些多肽的優選的實施方案在SEQ ID NO.2、4、6、8或10中描述。
本發明還包括用于本發明的多肽的制備的所有方法。
本領域的技術人員已知本發明的多肽可通過多種方法獲得，例如，通過諸如固相方法這樣的化學方法。對于較大量的蛋白，建議使用重組方法。
用于充足的β-微管蛋白的制備的一些基礎的步驟為1.一種天然的、合成的或者半合成的DNA的獲得，該基因編碼本發明的β-微管蛋白。
2.該DNA向一種表達載體的引入，該表達載體適用于表達本發明的原本形式或者作為融合蛋白的β-微管蛋白。
3.使用該載體對一種適當的宿主細胞的轉化，在優選的情況下該宿主細胞為原核細胞。
4.該宿主細胞在適于本發明的β-微管蛋白表達的條件下的生長。
5.通過適當的已知方法進行的這些細胞的收集和β-微管蛋白的純化例如，該表達載體可被轉化入λDE3-溶源生長的大腸桿菌菌株，例如，BL21(DE3)、HM S174(DE3)或者AD494(DE3)。這些細胞在本領域的技術人員所熟悉的標準條件下進行生長后使用IPTG進行誘導。對細胞進行誘導之后，在18到37℃下進行3到24小時的溫育。破碎這些細胞，通過層析方法純化所表達的蛋白，在蛋白同組氨酸標記一起表達時通過在Ni-NTA柱上使用FPLC的方法純化，還通過離子交換層析、凝膠過濾層析、超濾、電泳或替代的免疫親和純化方法進行純化，該免疫親和純化方法對本發明的多肽是特異的。
本發明的類似物或片段可通過突變或刪除來產生，例如，通過定向(點)突變。
本發明的多肽也可經化學修飾，例如，以糖基集團、脂、磷酸、乙酰基團或者類似基團進行修飾。共價衍生物可通過將修飾基團同該多肽的氨基酸側鏈或者N末端或者C末端的功能基團進行連接。
在本發明的多肽的表達中，改變特定的密碼子以進行最佳的表達是有利的。這種情況在特定密碼子(密碼子偏倚性)在異源表達系統中的使用不同于本發明的生物體的情況下是存在的。進一步，5’或3’非編碼區域的刪除是可能的，例如，在該cDNA的3’區域中存在幾個穩定化序列基序(例如，ATTTA)的情況下。
融合蛋白本發明的多肽還可以一種融合蛋白的形式存在。在需要獲得β-微管蛋白的免疫原性片段時可以使用這些蛋白(例見，EP 0 259 149；Schlienger et al.(1992)J.Virol.66，2)。在特定的情況下，融合蛋白輔助多肽的表達。例如，本發明的多肽可制備成為谷胱甘肽S-轉移酶融合蛋白。這樣的GST融合蛋白輔助進行該多肽的方便純化(例見，Current Protocols of Molecular Biology，eds.Aussubelet al.(John Wiley & Sons，N.Y.1991))。融合蛋白可以含有，例如，一種被用于純化的“引導”序列，例如，允許該蛋白的N末端(或者C-末端)的一種多聚-組氨酸序列，該蛋白的純化[空白]通過在Ni2+NTA柱進行的層析來完成(例見，Hachuli et al.(1987)J.Chromatography 411，177)。
用于制備這樣的融合蛋白的工藝為本領域的技術人員所熟悉。
抗體本發明的另一個方面涉及到一些抗體，這些抗體同本發明的β-微管蛋白多肽特異性地結合。
例如，抗蛋白或者抗肽血清或者單克隆抗體可根據標準方案通過使用免疫原來進行制備，這些免疫原來自本發明的β-微管蛋白多肽(例見，AntibodiesA.Laboratory Manual ed.by Harlow andLane(Cold Spring Harbor Press，1988))。
諸如小鼠、倉鼠或兔這樣的哺乳動物可使用本發明的多肽的一種免疫原形式或免疫源片段進行免疫化，例如，使用一種能夠產生抗體反應的多肽進行(又見上文的“融合蛋白”)。適當的工藝為本領域的技術人員所熟悉。這樣，β-微管蛋白的一種免疫原片段可在佐劑的存在下進行給藥。可通過檢查血漿或血清中的抗體滴度來觀察免疫化的方法，例如，通過ELISA分析或其它免疫分析。
在一個優選的實施方案中，本發明的抗體對于本發明的β-微管蛋白多肽的免疫決定簇是免疫特異的，該微管蛋白多肽的例子如SEQ IDNO.2、4、6、8或10所描述的多肽或者由SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11所描述的DNA所編碼的多肽，或者與上述多肽具有85％的同一性的序列，在優選的情況下該序列與上述多肽具有95％的同一性。
在哺乳動物的免疫化之后，可從血清中分離出多克隆的抗β-微管蛋白抗體。為獲得單克隆抗體，產生抗體的細胞(淋巴細胞)可獲自一種免疫化的動物并且根據已知方法將該細胞同諸如骨髓瘤細胞這樣的永生細胞進行融合以獲得雜交瘤細胞(例見，Khler and Milstein(1975)Nature 256.495-497；Kozbar et al.(1983)Immunology Today4，72；Cole et al.(1985)Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)。
在此提及的“抗體”應當還包括同本發明的β-微管蛋白特異地反應的抗體片段。可使用傳統的工藝將抗體破碎成片段并對該片段進行檢測。
一個優選的實施方案涉及到諸如上文所述這樣的抗體，這些抗體攜帶一種可檢測標記(例如，放射性同位素、熒光基團、酶或酶輔因子)。
同本發明的β-微管蛋白特異地結合的抗體還可被用于組織樣本的免疫組化染色以檢測某種具體的β-微管蛋白的表達。該抗β-微管蛋白抗體還可用于診斷目的，例如，用于免疫沉淀或免疫染色。
診斷測試方法本發明還可提供可被用于診斷目的的核酸分子。
這些分子包括的核酸分子如，SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11所描述的DNA序列的片段或同其互補的DNA序列。例如，在SEQ ID NO.12到51中描述的寡核苷酸已經可以獲得，這些寡核苷酸能夠同編碼β-微管蛋白的有義或者反義序列以及內含子部分進行雜交，該內含子序列以SEQ ID NO.11為例進行描述。
在該方法中，細胞的核酸分子經處理以使其可被接近以進行雜交，該DNA探針同該寡核苷酸進行接觸并且使用該寡核苷酸對該樣品的雜交進行檢測。
一種方法以該方式被提供，該方法使得區分不同種類的小圓線蟲和以及或其它線蟲種類成為可能，該區分通過本發明的寡核苷酸同一種DNA探針的特異性雜交來進行，在優選的情況下以同編碼β-微管蛋白的DNA的內含子區域進行雜交的寡核苷酸進行輔助。在一個特別優選的實施方案中，本發明的寡核苷酸允許對在小(Cyathostaminae)中的抗性進行鑒別，特別是細頸杯環線蟲種、冠狀盅口線蟲種和碗狀盅口線蟲種的抗性。在該方法中，可以利用的一個事實是β-微管蛋白的的抗性形式在本發明的編碼DNA中攜帶有至少一個突變，該突變可如所描述通過PCR的方法進行檢測，例如，以同Elard et al.(1998)在小型反芻動物寄生蟲Teladorsagia circumcincta的天然種群中對天然苯并咪唑敏感或抗性的診斷，Veterinary Parasitology 80，231-237中類似的方式進行。
所描述的方法特別有助于在感染有線蟲的人類或動物中對可能的治療策略進行評估，例如，馬、綿羊、豬、山羊、駱駝、野牛、驢、野兔、狍、有毛動物、鳥類(例如，小雞、火雞、鴨)、淡水和成水魚(鱒魚、鯉魚)。這使得對寄生性線蟲的鑒定和區分以及對其抗性群體的識別成為可能，并且避免了以無活力的殺線蟲劑進行的處理。
在此描述的方法可以以諸如預制診斷測試試劑盒這樣的形式提供，該試劑盒含有至少一種上文提及的核酸分子或者如上文所述的抗體，這些抗體或核酸分子被制備成即用形式。
用于發現線蟲殺滅物質的方法本發明涉及到一種方法，在該方法中通過微管蛋白或其片段的輔助而鑒定了新的特異的驅腸蟲物質。
在一個優選的實施方案中，本發明的β-微管蛋白被用于該方法。但是，該方法還可使用來自此處所提及的種類之外的微管蛋白。使用來自本發明的β-微管蛋白之外的β-微管蛋白多肽的方法也全部包含在本發明內。在特別優選的情況下在SEQ ID NO.2、4、6、8或10中描述的β-微管蛋白多肽被用于所提及的方法。在本發明中，來自常見的線蟲的重組β-微管蛋白多肽可額外地獲得。這些多肽可被用于各種用于鑒定微管蛋白或微管蛋白亞基相互作用的新抑制劑的測試系統。
無細胞測試系統許多以化合物或天然抽提物的測試為目的的測試系統著眼于高通量以在給定的期間內使被檢測的物質的數量達到最大。基于無細胞研究的測試系統使用純化或半純化的蛋白。它們適于一種“初級(first)”測試，該測試原始目的在于檢測一種物質對靶蛋白的可能的影響。
諸如細胞毒作用這樣的影響為這種體外系統所忽略。該測試系統在這種情況下檢測這一物質的抑制(inhibierende)和抑制(suppressive)作用以及刺激作用。一種物質的效率可通過濃度決定的測試系列來檢驗。無測試物質的參照群組可被用于估測該作用。
一種用于對調控微管蛋白或其亞基的相互作用的物質進行檢測的可能性為“閃爍近似分析”(SPA)，見EP 015 473。這一測試系統利用一種受體(例如，微管蛋白)同一種放射性標記的配基(例如，一種小有機分子或第二種放射性標記的蛋白分子)之間的相互作用。該受體在這一情況下同小球(微球體)或小珠結合，該小球或小珠被提供以閃爍分子。在放射性衰變期間，在微球體中的閃爍物質被放射性標記的亞原子粒子激發并且發射出可檢測的光子。該測試條件經最優化以使發射自配基的這樣的粒子引發一種信號，該信號從同受體或者微管蛋白結合的配基中發射。
在一個可能的實施方案中，微管蛋白同相作用的或與其結合的測試物質一起或單獨同微珠相接合。在此可使用α-或β-微管蛋白亞基。放射性標記的配基可以是，例如，被標記的苯并咪唑或一種進一步的標記的β-微管蛋白。在該配基同該固定化微管蛋白相結合的情況下，該配基必須抑制或者消除固定化的和游離的微管蛋白之間的存在的相互作用以在接觸區域結合該配基本身。已經發生的同固定化的微管蛋白的結合可隨后通過一次光閃爍來檢測。相應地，存在的固定化和游離的標記微管蛋白之間的復合體被測試物質的結合所破壞，這導致了檢測到的閃光強度的降低。該測試系統隨即對應于一種互補的抑制系統。
基于細胞的測試系統可通過本發明的方法獲得的β-微管蛋白以及來自其它種類的微管蛋白可以開發一種測試系統，該測試系統以細胞為基礎用于鑒定抑制微管蛋白相互作用的物質。
該系統的一個例子為“雙雜交系統”。該系統的一個具體例子為“作用陷阱(interaction trap)”。這是在酵母中進行的對相互作用的蛋白的遺傳選擇(例見，Gyuris et al.(1993)Cdi 1，一種同Cdk2相聯系的人類G1和S期蛋白磷酸酶(Cdi 1，a human G1 and Sphase protein phosphatase that associates with Cdk 2.)Cell75，791-803)。該測試系統經設計用于檢測和描述兩種蛋白之間的相互作用，這是由于所發生的相互作用導致了一種可檢測的信號。
這樣的一種系統可適配于在給定期間內對大量測試物質的測試。
該系統基于兩種載體的構建，“誘餌”載體以及“捕獲”載體。編碼微管蛋白的一種基因被克隆入該“誘餌”載體并表達成為同LexA蛋白的融合蛋白，在優選的情況下該基因為編碼本發明的一種β-微管蛋白的基因。第二種基因編碼微管蛋白被克隆入該“捕獲”載體并表達成為同B42-捕獲蛋白的融合蛋白，在優選的情況下該基因為編碼本發明的一種β-微管蛋白的基因。這兩種載體均存在于釀酒酵母宿主中，該宿主在一個lacZ或HIS3報告基因的5’-側含有多個拷貝的結合LexA的DNA。如果在兩種微管蛋白(融合)蛋白之間發生了相互作用，該報告基因的轉錄將被激活。如果存在一種導致對微管蛋白的相互作用的抑制或干擾的測試物質，這兩種微管蛋白(融合)蛋白將不再能夠相互作用并且該報告基因的產物將不會被制備。
在微管蛋白以及上述的制備方法的輔助之下，特別是在本發明β-微管蛋白或其片段的輔助之下，對新的和特異的抗寄生蟲化合物的鑒定成為可能。
在上述的方法和多肽的輔助之下發現的化合物對于受到人類或者農業牲畜、寵物、動物園動物以及實驗室和實驗動物的病原性內生寄生蟲感染的人類或者動物的治療是有價值的。
這些化合物具有抗所有發育時期的普通、敏感株以及抗性株的活性。通過以含有一種或多種這樣的化合物的試劑進行的治療，對于牲畜造成的經濟損失以及在人類和動物中的疾病均可被避免或進行治療。在特定的目標下，下列寄生蟲為所發現的活性化合物的目標Enoplida，例如，Trichuris spp.、Capillaria spp.、Trichomosoides spp.、trichinella spp.
小桿線蟲屬，例如，Micronema spp.、strongyloides spp.
Strongylida，例如，Strongylus spp.、Triodontophorus spp.、Oesophagodontus spp.、Trichonema spp.、Gyalocephalus spp.、Cylindropharynx spp.、Poteriostomum spp.、Cyclococercusspp.、Cylicostephanus spp.、Oesophagostomum spp.、Chabertiaspp.、Stephanurus spp.、Ancylostoma spp.、Uncinaria spp.、Bunostomum spp.、Globocephalus spp.、Syngamus spp.、Cyathostomum spp.、Cylicocyclus spp.、Neostrongylus spp.、Cystocaulus spp.、Pneumostrongylus spp.、Spicocaulus spp.、Elaphostrongylus spp.、Parelaphostrongylus spp.、Crenosomaspp.、Paracrenosoma spp.、Angiostrongylus spp.、Aelurostrongylus spp.、Filaroides spp.、Parafilaroides spp.、Trichostrongykus spp.、Haemonchus spp.、Ostertagia spp.、Marshallagia spp.、Cooperia spp.、Nematodirus spp.、Hyostrongylus spp.、Obeliscoides spp.、Amidostomum spp.、Olludanus spp.
Oxyurida，例如，Oxyuris spp.、Enterobius spp.、Passalurusspp.、Syphacia spp.、Aspiculuris spp.、Heterakis spp.
禽蛔蟲屬，例如，Ascaris spp.、Toxascaris spp.、Toxocaraspp.、Parascaris spp.、Anisakis spp.、Ascaridia spp.
Spirurida，例如，Gnathostoma spp.、Physaloptera spp.、Thelazia spp.、Gongylanema spp.、Habronema spp.、Parabronemaspp.、Draschis spp.、Dracunculus spp.
Filariida，例如，Stephanofilaria spp.、Parafilaria spp.、Setaria spp.、Loa spp.、Dirofilaria spp.、Litomosoides spp.、Brugia spp.、Wuchereria spp.、Onchocerca spp.
Giganotorhynchida，例如，Filicollis spp.、Moniliformisspp.、Macracanthorhynchus spp.、Prosthenorchis spp.
Mastigophora(鞭毛蟲)Trypanosomatidae，例如，Trypanosoma b.brucei、T.b.gambiense、T.b.rhodesiense、剛果錐蟲(T.congolense)、克[魯斯]氏錐蟲(T.cruzi)、伊氏錐蟲(T.evansi)、馬錐蟲(T.equinum)、路[易士]氏錐蟲(T.lewisi)、T.percae、猿錐蟲(T.simiae)、活動錐蟲(T.vivax)、巴西利什曼原蟲(Leishmania brasiliensis)、杜氏利什曼原蟲(L.donovani)、熱帶利什曼原蟲(L.tropica)Trichomonadidae，例如，腸蘭伯鞭毛蟲(Giardia lambilia)、犬賈第蟲(G.canis)Sarcomastigophora(Rhizopoda)，例如，溶組織內阿米巴Hartmanellidae，例如，Acanthamoeba sp.、Hartmanella spp.
Apicomplexa(Sporozoa)，例如，堆形艾美球蟲、E.adenoides、E.alabahmensis、鴨艾美球蟲、鵝艾美球蟲、阿[洛尼]氏艾美球蟲、E.ashata、奧博倫艾美球蟲、牛艾美球蟲、布氏艾美球蟲、加拿大艾美球蟲、E.chinchillae、E.clupearum、鴿艾美球蟲、E.contorta、槌狀艾美球蟲、狄氏艾美球蟲、分散艾美球蟲、E.ellipsoidales、鐮形艾美球蟲、福氏艾美球蟲、唇艾美球蟲、蘭氏艾美球蟲、大型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、中等艾美球蟲、珠雞艾美球蟲、和緩艾美球蟲、毒害艾美球蟲、尼柯雅艾美球蟲、E.ovis、小型艾美球蟲、孔雀艾美球蟲、有孔艾美球蟲、法思艾美球蟲、梨形艾美球蟲、早熟艾美球蟲、E.residua、粗糙艾美球蟲、E.sepc.、E.stiedai、豬艾美球蟲、柔嫩艾美球蟲、樹艾美球蟲、特魯特艾美球蟲、朱氏艾美球蟲、Globidium spec.、貝氏等孢子球蟲、犬等孢子球蟲、貓等孢子球蟲、俄亥俄等孢子球蟲、里沃特等孢子球蟲、I.suis、Neospora canium、Cystisospora spec.、Cryptosporidiumspec.
Toxoplasmadidae，例如，鼠弓形蟲Sarcocystidae，例如，Sarcocystis bovicanis、S.bovihominis、S.neuvona、羊肉孢子蟲、S.ovifelis、S.spec.、豬人肉孢子蟲Leucozoide，例如，Leucozytozoon simondiPlasmodiias，例如，伯格氏鼠瘧原蟲、惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、間日瘧原蟲、P.specPiroplasmea，例如，阿根廷巴貝蟲、牛巴貝蟲、犬巴貝蟲、B.spec、小泰勒蟲、T.specAdeleina，例如，犬肝簇蟲、H.spec以下的具有進一步的重要性Myxospora和Microspora，例如，Glugea spec.和Nosemaspec.、卡氏肺囊蟲，Ciliophora(Ciliata)，例如，結腸小袋纖毛蟲、Ichthiophthirius spec.、Trichondina spec.或Epistylisspec.
所發現的化合物和試劑還可有效地抵抗昆蟲的原生動物，例如Microsporidia株系，特別是微粒子蟲目，非常特別的情況下為蜜蜂微粒子蟲種，該種為蜜蜂的寄生蟲。
實施例實施例1β-微管蛋白cDNA和基因組DNA的獲得在Quick PrepMicro mRNA試劑盒(Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany)的輔助下從細頸杯環線蟲中，使用DynalmRNADirect試劑盒(Dynal，Hamburg，Germany)從冠狀盅口線蟲和碗狀盅口線蟲中獲得mRNA。這些蠕蟲分離自馬的大腸并通過顯微鏡根據其頭尾的特征結構進行區分(見R.S.Lichtenfeld(1975)，Helminths of domestic equids.Proceedings of theHelminthological Society，Washingtong，42(Special Issue)，1-92)。
對于來自細頸杯環線蟲的mRNA，該cDNA的合成在“反轉錄系統的”(Promega，Madison，USA)輔助之下進行，而對于來自冠狀盅口線蟲和碗狀盅口線蟲的mRNA，該cDNA的合成使用superscriptRTII反轉錄酶(Gibco BRL Life Technologies)來進行。在所提及的情況下使用具有15個堿基對長度的寡核苷酸。在42℃下溫育1小時。
基因組DNA使用QIA Amp-tissue試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)從4-40只成體蠕蟲中獲得。在該方法中，以蛋白酶K對這些蠕蟲在55℃下消化2小時并且使用“旋柱(spin columns)”抽提基因組DNA。
實施例2β-微管蛋白序列的擴增全長的β-微管蛋白序列或其片段的擴增的進行可使用，例如，AmpliTap GoldTM聚合酶(Perkin Elmer，Foster City，California，USA)。
SEQ ID NO.1、3、5、7、9或11所描述的序列β-微管蛋白序列的擴增可在SEQ ID NO.1 2-51所描述的引物的輔助下進行。
對于來自冠狀盅口線蟲的cDNA的擴增，諸如SEQ ID NO.43和44所描述的序列這樣的序列是適合的，對于來自碗狀盅口線蟲的cDNA的擴增，諸如SEQ ID NO.40和42所描述的序列這樣的序列是特別適合的。
細頸杯環線蟲的cDNA以及本發明的各個種類的基因組DNA的擴增在50μl的總體積內進行，其中含有5μl的10×緩沖液、2.5μl的MgCl2(25mM)、2μl的dNTP混合物(2mM的各種NTP)、1μl的各種特異引物(SEQ ID NO.12-47)(50p mol/μl)、0.5μl(2.5U)的聚合酶以及1-5μl的DNA模板。當使用簡并引物時(SEQ ID NO.48-51)使用1μl的濃度為500pmol/μl的各種引物。對于簡并引物在46℃下進行退火，對于特異性引物該溫度根據所計算出的熔點而變化。PCR循環經選擇如下95℃下進行10分鐘，隨后進行35-40個循環以及一個在72℃下10分鐘的最終步驟，每次循環包括在94℃下變性1分鐘、退火1分鐘、72℃下1分鐘。在從冠狀盅口線蟲和碗狀盅口線蟲進行的cDNA擴增中進行一種“觸減(touchdown)”PCR溫度方法，該方法具有以下特征首先進行15個循環，其中每個循環包括94℃下30秒、隨后的在60℃下1分鐘和72℃下1分鐘，隨后進行15個循環，其中每個循環包括95℃下30秒、55℃下1分鐘和72℃下1分鐘，最后進行10個循環，其中每個循環包括94℃下30秒、45℃下1分鐘和72℃下1分鐘。對于大片段(＞1000個堿基對)的克隆，72下的延伸階段被延長至2.30分鐘。
實施例3
來自細頸杯環線蟲、冠狀盅口線蟲和碗狀盅口線蟲的cDNA或者基因組DNA擴增的PCR產物在“Original TA Cloning Kit”(Invitrogen，Leek，Netherlands)的輔助下進行克隆，即在“Original TA Cloning”載體中克隆。
序列表<110>Bayer AG<120>編碼β-微管蛋白的DNA及其應用<130>Le A 33 759<140><141><160>51<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1380<212>DNA<213>冠狀盅口線蟲(Cyathostomum coronatum)<220><221>CDS<222>(1)..(1344)<400>1atg cgt gag atc gtg cat gta caa gct gga caa tgt gga aac caa att 48Met Arg Glu Ile Val His Val Gln Ala Gly Gln Cys Gly Asn Gln Ile1 5 10 15ggt tcc aag ttt tgg gaa gtg atc tct gac gag cat ggc att aag ccc 96Gly Ser Lys Phe Trp Glu Val Ile Ser Asp Glu His Gly Ile Lys Pro20 25 30gat ggc aca tac cac gga gaa tct gat cta caa tta gaa cga atc aat 144Asp Gly Thr Tyr His Gly Glu Ser Asp Leu Gln Leu Glu Arg Ile Asn35 40 45gtg tac tat aat gaa gca cat gga ggc aaa tat gtc cca cgt gca gtt192Val Tyr Tyr Asn Glu Ala His Gly Gly Lys Tyr Val Pro Arg Ala Val50 55 60ctt gtt gat ctc gag ccc gga act atg gat tcc gtc cgt tcc ggg cca240Leu Val Asp Leu Glu Pro Gly Thr Met Asp Ser Val Arg Ser Gly Pro65 70 75 80tac ggg caa ttg ttc cgc cct gat aac tac gtg ttt gga cag tct ggc288Tyr Gly Gln Leu Phe Arg Pro Asp Asn Tyr Val Phe Gly Gln Ser 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權利要求
1.一種DNA，該DNA編碼來自Cyathostominae的β-微管蛋白或其片段。
2.權利要求1的一種DNA，這種DNA包括a)一種多核苷酸，該多核苷酸同編碼SEQ ID NO.2所描述的一種氨基酸序列的多核苷酸具有至少85％的同一性；b)一種多核苷酸，該多核苷酸同編碼SEQ ID NO.4所描述的一種氨基酸序列的多核苷酸具有至少85％的同一性；c)一種多核苷酸，該多核苷酸同編碼SEQ ID NO.6所描述的一種氨基酸序列的多核苷酸具有至少85％的同一性；d)一種多核苷酸，該多核苷酸同編碼SEQ ID NO.8所描述的一種氨基酸序列的多核苷酸具有至少85％的同一性；e)一種多核苷酸，該多核苷酸同編碼SEQ ID NO.10所描述的一種氨基酸序列的多核苷酸具有至少85％的同一性；
3.權利要求1的一種DNA，這種DNA包括a)一種多核苷酸，該多核苷酸同編碼SEQ ID NO.2所描述的一種氨基酸序列的多核苷酸具有至少95％的同一性；b)一種多核苷酸，該多核苷酸同編碼SEQ ID NO.4所描述的一種氨基酸序列的多核苷酸具有至少95％的同一性；c)一種多核苷酸，該多核苷酸同編碼SEQ ID NO.6所描述的一種氨基酸序列的多核苷酸具有至少95％的同一性；d)一種多核苷酸，該多核苷酸同編碼SEQ ID NO.8所描述的一種氨基酸序列的多核苷酸具有至少95％的同一性；e)一種多核苷酸，該多核苷酸同編碼SEQ ID NO.10所描述的一種氨基酸序列的多核苷酸具有至少95％的同一性；
4.權利要求1到3其中之一所要求的一種DNA，該DNA含有SEQID NO.1中所描述的一種片段。
5.權利要求1到3其中之一所要求的一種DNA，該DNA含有SEQID NO.3中所描述的一種片段。
6.權利要求1到3其中之一所要求的一種DNA，該DNA含有SEQID NO.5中所描述的一種片段。
7.權利要求1到3其中之一所要求的一種DNA，該DNA含有SEQID NO.7中所描述的一種片段。
8.權利要求1到3其中之一所要求的一種DNA，該DNA含有SEQID NO.9中所描述的一種片段。
9.權利要求1到3其中之一所要求的一種DNA，該DNA含有SEQID NO.11中所描述的一種片段。
10.權利要求1到3以及5到9其中之一所要求的一種DNA，其特征在于該DNA來自杯環線蟲屬。
11.權利要求1到4其中之一所要求的一種DNA，其特征在于該DNA來自盅口線蟲屬。
12.權利要求1到3以及5到10其中之一所要求的一種DNA，其特征在于該DNA來自細頸杯環線蟲。
13.權利要求1到4以及11其中之一所要求的一種DNA，其特征在于該DNA來自冠狀盅口線蟲。
14.權利要求1到13其中之一所要求的一種DNA，其特征在于該DNA在密碼子200含有至少一個堿基替換，該替換導致一種具有驅腸蟲藥抗性的多肽的表達。
15.一種DNA或其片段，其特征在于該DNA同權利要求1到14其中之一所要求的DNA互補。
16.一種RNA，其特征在于該RNA同權利要求1到14其中之一所要求的DNA或其片段互補。
17.一種表達結構體，其特征在于該結構體含有權利要求1到14其中之一所要求的DNA以及一種同其功能性連接的序列，該序列使得該DNA的表達成為可能。
18.一種載體，其特征在于該載體含有權利要求1到14其中之一所要求的DNA。
19.一種宿主細胞，該細胞含有權利要求1到14其中之一所要求的DNA、權利要求17所要求的一種表達結構體或者權利要求18所要求的一種載體。
20.一種多肽，該多肽由權利要求1到14其中之一所要求的一種DNA或其片段所編碼。
21.權利要求20中的一種多肽，該多肽含有SEQ ID NO.2中所描述的一種氨基酸序列或由其組成。
22.權利要求20中的一種多肽，該多肽含有SEQ ID NO.4中所描述的一種氨基酸序列或由其組成。
23.權利要求20中的一種多肽，該多肽含有SEQ ID NO.6中所描述的一種氨基酸序列或由其組成。
24.權利要求20中的一種多肽，該多肽含有SEQ ID NO.8中所描述的一種氨基酸序列或由其組成。
25.權利要求20中的一種多肽，該多肽含有SEQ ID NO.10中所描述的一種氨基酸序列或由其組成。
26.一種多肽，該多肽由權利要求14的DNA所編碼。
27.一種制備方法，該方法用于制備權利要求20到26其中之一所要求的一種多肽，該方法包括該多肽或其片段在一種原核或真核表達系統中的表達。
28.DNA寡核苷酸的應用，該寡核苷酸同權利要求1到15其中之一所要求的DNA特異性地雜交以檢測來自Cyathostominae的DNA，在優選的情況下該寡核苷酸同非編碼的DNA部分雜交。
29.DNA的應用，該DNA同權利要求1到15其中之一所要求的DNA特異性地雜交以檢測來自Cyathostominae并且編碼權利要求26的一種多肽的的DNA。
30.一種用于檢測Cyathostominae的方法，其特征在于權利要求28中所描述的DNA同權利要求1到15其中之一所要求的DNA雜交并且該DNA通過PCR的方法進行擴增。
31.一種用于檢測具有驅腸蟲藥抗性的Cyathostominae的方法，其特征在于權利要求29中所描述的DNA同權利要求1到15其中之一所要求的DNA雜交并且該DNA通過PCR的方法進行擴增。
32.一種DNA寡核苷酸，該寡核苷酸含有SEQ ID NO.12到SEQ IDNO.51所描述的序列之一或者一種衍生自權利要求1到15的DNA序列的序列。
33.一種診斷試劑盒，該試劑盒含有至少一種權利要求32所要求的寡核苷酸和/或權利要求35或36所要求的抗體。
34.權利要求33中所要求的一種診斷試劑盒，其特征在于該DNA寡核苷酸被提供以一種可檢測的標記。
35.一種抗體，其特征在于該抗體同權利要求20到26中所要求的多肽的一種表位特異性地反應。
36.權利要求35所要求的一種抗體，其特征在于該抗體為單克隆抗體。
37.權利要求35或36中所要求的抗體作為線蟲殺滅劑的應用。
38.權利要求20到26之一所要求的多肽在疫苗生產中的應用。
39.一種方法，該方法用于鑒定調控微管蛋白的相互作用的物質。
40.權利要求39所要求的方法，其特征在于a)將待測物質同該微管蛋白相接觸，該接觸的條件允許該微管蛋白分子相互之間的相互作用以及該待測物質同微管蛋白的結合，b)通過測定該微管蛋白-蛋白分子之間的相互作用的能力而對所發生的待測物質的結合進行檢測，以及c)將在該測試物質存在的情況下該微管蛋白-蛋白分子之間的相互作用的能力同不存在該測試物質的情況下進行比較。
41.權利要求39或40所要求的方法，其特征在于所使用的微管蛋白為權利要求20到26之一所要求的多肽。
42.權利要求39到41之一所要求的方法，其特征在于使用一種基于細胞的測試系統以在測試物質存在下檢測該微管蛋白相互作用的調節。
43.權利要求39到41之一所要求的方法，其特征在于使用一種無細胞的測試系統以在測試物質存在下檢測該微管蛋白相互作用的調節。
44.一種物質，該物質在權利要求39到43之一所要求的一種方法中被鑒定。
45.在權利要求44中要求的物質的在生產一種藥劑中的使用，該藥劑用于對線蟲侵襲的預防性或治療性處理。
全文摘要
本發明涉及到編碼β－微管蛋白的DNA,該微管蛋白來自圓線科的線蟲,還涉及到該DNA所編碼的多肽,該DNA在對涉及到的線蟲對驅腸蟲藥物的抗性進行診斷中的應用、在對這些線蟲的種類進行鑒別中的應用、β－微管蛋白作為一種疫苗的一個組分的應用,以及一種用于對新的線蟲或抗生素化合物進行鑒別的方法。
文檔編號C12N1/19GK1382216SQ00810121
公開日2002年11月27日 申請日期2000年6月30日 優先權日1999年7月9日
發明者G·馮薩姆森－希梅爾斯特杰納, A·哈德, T·施尼德, M·帕佩 申請人:拜爾公司