采用基因芯片技術檢測耐藥基因的制作方法

專利名稱：采用基因芯片技術檢測耐藥基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及耐藥基因芯片的制備以及其檢測標本中細菌耐藥基因方面的應用。
本發明的目的在于通過使用基因芯片檢測細菌的耐藥基因，指導抗生素的合理使用。
1.抗生素的使用現狀正確選用抗生素是抗生素治療中的一個關鍵問題。所謂正確選用，包括是否應該使用抗生素、需要選用哪種抗生素及通過什么途徑給藥等問題。不恰當的給藥不僅達不到預期的療效，而且還會適得其反。
為加強抗生素使用的宏觀管理、減少醫院感染的發生、阻止或延緩細菌耐藥性的產生和發展，各醫院都制訂了合理使用抗生素的條例。其中合理選用抗生素的原則是在診斷或高度疑似細菌性感染、決定使用抗生素前，應留取標本做細菌學涂片鏡檢、細菌培養、分離病原體并做常規藥敏試驗，作為抗生素選藥依據，并根據抗生素的藥代動力學特點，結合感染部位及藥物濃度分布情況選擇抗生素，并參考以下程序 在實際工作中，絕大多數抗生素是按途徑①給藥的，在新的抗生素和細菌對各種抗生素的新的耐藥性層出不窮的今天，經驗用藥的可行性和科學性正在逐漸降低；途徑②可以將抗生素粗分為β-內酰胺類和非β-內酰胺類給藥，但對病原菌的耐藥性無法判斷，而且不適用于混合感染或有多種細菌定植部位的感染；途徑③是目前所能采取的最好方式，但由于所需時間長(最快3天)、難于篩選條件致病菌、藥敏試驗受實驗用抗生素的限制等原因，使其不能在首次診斷時及時提供合理使用抗生素的方案，而是作為對已用抗生素的正誤作追溯性評估，同時為調整抗菌藥提供方案。若經驗用藥不對，等到基于途徑③的正確給藥方案提出時，往往病情已經加重、感染已經蔓延，為增加了下一步治療的難度。
正是這種傳統的抗生素用藥方式導致了細菌耐藥性的產生和擴散，使人類面臨傳染病卷土重來的危險。
另外，不合理用藥也使全國每年不必要的藥費支出高達上百億元。
因此，迫切需要新的措施，為臨床使用抗生素提供及時、準確、合理的指導。2.細菌耐藥性研究現狀人類進入抗生素時代已有近半個多世紀的時間，在這期間，各種新型抗生素的不斷問世，極大地促進了醫學科學的發展。但與此同時，在抗生素的巨大進化選擇壓力下，許多病原菌演化出了對抗生素的耐藥性。細菌的耐藥，使人類面臨巨大挑戰。從1937年首次觀察到淋球菌對磺胺的耐藥現象開始，科學家們一直在研究不斷出現的細菌對不同抗生素的耐藥性，從細胞和分子水平研究細菌的耐藥機理。現在已經證實，細菌對每一類抗生素都已產生了耐藥性，細菌耐藥性從機理上可分為固有性耐藥(細菌本身的生理特性，如不滲透性和溢出機制)、獲得性耐藥(細菌基因型不變，但耐藥性隨生長環境而變)和遺傳性耐藥(通過基因突變或通過獲得抗藥質粒，細菌獲得了新的穩定的耐藥特性)。雖然這些耐藥性涉及上百種結構和活性各不相同的蛋白質，但近年來已完成對這些蛋白基因序列的測定。固有性耐藥親脂性抗生素對G-菌的MIC要遠遠大于G+菌，這主要是由于G-菌帶有的多種藥物溢出泵。
表1.藥物溢出泵類型、分布及功能溢出泵類型細菌基因抗生素EmrB大腸桿菌emrB萘啶酸、thiolactomycinArcB大腸桿菌arcAB Tet、CP、FQ、β-內酰胺類、Nov、Em、FuA、RifMexB銅綠假單胞菌mexAB Tet、CP、FQ、β-內酰胺類(除羧芐青霉素外)、Nov、Em、FuA、Rif、TMP、SMZ
MexD銅綠假單胞菌mexCD Tet、CP、FQ、TMP、第四代頭孢菌素(除羧芐青霉素外)MexF銅綠假單胞菌mexEF CP、TMP、FQMtrD淋病奈瑟氏球菌 mtrCDTet、CP、β-內酰胺類、Em、FuA、Rif注CP(chloramphenicol)氯霉素，Em(erythromycin)紅霉素，FQ(fluoroquinolones)氟喹諾酮，FuA(fusidic acid)褐霉素，Nov(novobiocin)新生霉素，Rif(rifampicin)利福平，SMZ(sulfamethoxazole)新諾明，Tet(tetracycline)四環素，TMP(trimethoprim)甲氧芐啶。獲得性耐藥細菌由于所處的環境不同而出現耐藥性的差異。表現在銅綠假單胞菌時，細菌在體外藥敏試驗中表現為對氨基糖甙類(妥布霉素)、喹諾酮類(環丙沙星)敏感，但在體內時MIC卻提高了6-8倍。這與細菌所處的體內環境和體外實驗條件的差異有關。遺傳性耐藥絕大多數的細菌耐藥性都是通過遺傳途徑而獲得的并成為穩定性狀的。耐藥性最初都是由于細菌染色體的基因突變而產生，耐藥基因通過同源重組轉移到質粒上，即可實現在種屬內和種屬間的縱向和橫向傳播。
現在已經知道，大多數的耐藥基因都已被整合到了質粒上，因而很容易引起耐藥性的擴散。
細菌對各類抗生素的遺傳性耐藥分述如下①β-內酰胺類抗生素細菌對青霉素類和頭孢菌素類抗生素的抗性主要是通過產生β-內酰胺酶而實現的。目前已經鑒定出超過200種β-內酰胺酶，其中超過80％的酶的基因序列已經測出，它們中的絕大多數都有相同的酶活性功能部位，有絕對和相對保守區，因而易于檢測。青霉素結合蛋白也是抗性產生的原因之一，但不是主要因素。
表2.β-內酰胺酶的分類及其所對應的抗生素耐藥譜組別有關酶類的基因抗生素1組 超過33種，包括A1、 主要水解LOR和LOT，對克拉維酸不敏感AsbAls、AmpCs、TypeA、 部分水解PEN的水解頭孢菌素的P99、BIL-1、FOX-1、LAT-1、β-內酰胺 MIR-1、MOX-1s、CEP-1s、S&A、S2等酶2a組超過20種，來自G+菌，包主要水解PEN、AMP，部可被克拉維酸抑制括I、IIIs、MJ-2s、LEN-1s、 分水解CARB、LOR、LOR的水解青霉素的β- NPS-1s、PCl(A)P，B，C，D、 和NCF內酰胺酶Exo等2b組超過15種，包括CEP-2、主要水解PEN、AMP、可被克拉維酸抑制Forml、OHIO-1、SHV-1、 LOR和LOT，其中一些的廣譜β-內酰胺酶 TLE-1、ROB-l、LXA-1、酶還有更寬的耐藥譜TLE-2、HMS-1、TEM-1、TEM-2等2be組 超過38種，包括TEM-3至主要水解PEN、AMP、可被克拉維酸抑制TEM-12、TEM-16、TEM-20 CARB、LOR、LOT、TAX、的超廣譜β-內酰胺 至TEM-26、SHV-2至TAZ和ATM等，個別酶酶SHV-6、B1、B2、MJ-2、還有更寬的耐藥譜MEN-1、CTX-ase-M-1、K1、MJ-1、PER-1、CTX-ase-M-2等2br組 超過9種，包括TEM31至 主要水解PEN、AMP和對克拉維酸不敏感TEM36、TRC-1等 LOR，個別酶有更寬的耐的廣譜β-內酰胺酶藥譜2c組超過15種，包括CARB-5、 主要水解PEN、AMP、可被克拉維酸抑制AER-1、TypeBs、BRO-1、 CARB，部分水解LOR，的水解羧芐青霉素BRO-2、PSE-1、PSE-3、個別酶有更寬的耐藥譜的β-內酰胺酶 PSE-4、CARB-3、CARB-4、SAR-1等2d組超過19種，包括OXA-1至主要水解PEN、AMP、水解氯唑西林的β- OXA-12、OXA-A、LCR-1、 CARB、CLOX、OXA、內酰胺酶M-OXA等MET、LOR、LOT、TAX等，個別酶有更寬的耐藥譜2e組超過19種，包括CepA、 主要水解LOR和LOT，可被克拉維酸抑制CblA、CfsA、FormII、FEC-1、部分水解PEN和TAX等的頭孢菌素酶FUR、FPM-1、L2、BlaI等2f組超過3種，包括IMI-1、 主要水解PEN、AMP、水解羧芐青霉素的NMC-A、Sme-1等 LOR、LOT、TAX、ATM、非METβ-內酰胺酶 IMP等3組 超過15種，包括CphA/A2、主要水解PEN、AMP、不被克拉維酸抑制A2h、II、CcrA、PCM-1、 CARB、CLOX、LOR、的METβ-內酰胺酶IMP-1、L-1等 LOT、FOX、NCF、TAX、IMP等。4組可被克拉維酸 超過7種，主要為SAR-20主要水解PEN、AMP、部分抑制的青霉素 CARB、CLOX、OXA，酶 部分水解LOR注PEN，benzylpenicillin青霉素G；AMP，ampicillin氨芐青霉素；CARB，carbenicillin羧芐青霉素；OXA，oxacillin苯唑青霉素；CLOX，cloxacillin氯唑青霉素；LOR，cephaloridine頭孢噻啶；LOT，cephalothin頭孢噻吩；FOX，cefoxitin頭孢西丁；NCF，nitrocefin頭孢硝噻吩；TAX，ceftazidime復達欣；ATM，aztreonam氨曲南；IMP，imipenem亞胺培南。②氨基糖甙類抗生素細菌對氨基糖甙類的抗性包括核糖體結構改變和膜滲透性降低等，但最主要的是借助于酶對抗生素的滅活，如乙酰轉移酶、核苷酸轉移酶、磷酸轉移酶。這些酶的基因分布在轉座子上，很容易導致對氨基糖甙的耐藥性在不同種類的細菌間快速傳播。
表3.氨基糖甙乙酰化修飾細菌基因分布抗生素大腸桿菌acc(1)染色體Apr，Lvdm，Prm，Rsm，(But)，(Neo)大腸桿菌acc(3)-Ia 質粒Gm，Astm，Siso銅綠假單胞菌acc(3)-Ib粘質沙雷氏菌acc(3)-II 質粒Gm，Tob，Dbk，Ntl，6’Ntl，2’Ntl，Siso大腸桿菌銅綠假單胞菌acc(3)-III染色體Gm，Tob，Dbk，5-epi，Siso，Km，Neo，Prm，Lvdm沙門氏菌屬acc(3)-IV 質粒Gm，Tob，Dbk，Ntl，6’Ntl，2’Ntl，Apr，Siso陰溝腸桿菌acc(3)-VI 質粒Gm，6’Ntl，Siso，(Tob)，(Ntl)，(Km)，(5’-epi).
差異檸檬酸桿菌aac(6’)-I質粒Tob，Dbk，Ntl，Amk，2’Ntl，Siso，(Isp)，粘質沙雷氏菌染色體5-epi肺炎克雷伯氏菌轉座子G+陰溝腸桿菌/檸檬酸桿菌溶血不動桿菌不動桿菌屬腸球菌屬銅綠假單胞菌aac(6’)-II染色體Gm，Tob，Dbk，Ntl，2’Ntl，5-epi，Siso糞鏈球菌aac(6’)-α質粒Gm，Tob，Dbk，Ntl，Amk，2’Ntl，金黃色葡萄球菌(2”)轉座子6’Ntl，5-epi，Astm斯氏普羅威登斯菌 acc(2’-1)acc(2’-1)Gm，Tob，Dbk，Ntl，6’Ntl表4.氨基糖甙腺苷酰化修飾細菌基因分布 抗生素腸桿菌科 ant(2”)-I 質粒 Gm，Tob，Dbk，Siso，Km陰溝腸桿菌腸桿菌科 ant(3”)-I 質粒 Sm，Spcm金黃色葡萄球菌 ant(4”)-I 染色體 Tob，Amk，Isp，Dbk銅綠假單胞菌 ant(4”)-II質粒 Tob，Amk，Isp糞鏈球菌 ant(6)-I 質粒 Sm金黃色葡萄球菌 ant(9)-I 轉座子 Spcm表5.氨基糖甙磷酸化修飾細菌基因分布 抗生素糞鏈球菌 aph(2”)-I 染色體 Gm，Tob，Dbk，Ntl，Amk，2’Ntl，6’Ntl，5-epi，Astm肺炎克雷伯氏菌 aph(3’)-I 轉座子 Km，Neo，Prm，Rsm，Lvdm，GmB質粒大腸桿菌 aph(3’)-II轉座子 Km，Neo，Prm，Rsm，But，Gmb(Amk)金黃色葡萄球菌 aph(3)-III 質粒 Km，Neo，Prm，Lvdm，Rsm，But，糞鏈球菌 Gmb，AmK，Isp環狀芽孢桿菌 aph(3’)-IV染色體 Km，Neo，Prm，Rsm，But弗氏鏈霉菌 aph(3’)-V 染色體 Neo，Prm，RsmS.ribosidificus青銅小單孢菌鮑氏不動桿菌 aph(3’)-VI質粒 Km，Neo，Prm，Rsm，But，GmB，肺炎克雷伯氏菌 Amk，Isp空腸彎曲桿菌 Aph(3’)-V 質粒 Km，Neo(Amk)II銅綠假單胞菌 aph(3”)-I 染色體 Sm灰色鏈霉菌 aph(6’)-I 轉座子 Sm淡青鏈霉菌染色體大腸桿菌 aph(4)-I 質粒 HygBS.hygroscopicus注Amk，amikacin阿米卡星；Apr，apramycin阿布拉霉素；Astm，Astromicin(fortimicin)阿司米星；But，Butirosin丁胺菌素；Dbk，dibekacin地貝卡星；5-epi，5-episisomicin 5-表紫蘇霉素；Gm，gentamicin慶大霉素；GmB，gentamicinB；HygB，hygromycin潮霉素；Isp，isepamicin；Km，kanamycin卡拉霉素；Lvdm，lividomycin里杜霉素；Neo，neomycin；Ntl，netilmicin乙基紫蘇霉素；2’Ntl，2’-N-ethylnetilmicin；6’Ntl，6’-N-ethylnetilmicin；Sm，streptomycin；Prm，paromomycin巴龍霉素；Rsm，ribostamycin核糖霉素；Siso，sisomicin紫蘇霉素；Spcm，spectinomycin奇霉素；Tob，tobramycin妥布霉素；③酰胺醇類抗生素細菌對酰胺醇類抗生素的耐藥性主要表現在氯霉素上。
很多G+和G-菌都帶有氯霉素乙酰轉移酶(Cml-acetyltransferases，CAT)，CAT有很多種類，但在它們的基因中，對應于酶活性部位的區域都含有23bp的絕對保守序列，因而易于測出。
還有很多細菌帶有異抗生素乙酰轉移酶(xemobiotic acetyltransferases，XAT)，其帶有相對保守的序列，分布在Mmorganii，S.mancescens，E.aerogenes，E.coli，P.aeruginsa，A.tumefaciens，E.faecium，S.sureus，B.sphaericus等細菌中。XAT導致了對氯霉素的低水平耐藥性。④大環內酯類抗生素ermC基因存在于Bacillus subtilis中，與對大環內酯-林可霉素-鏈陽性菌素B(macrolide-lincomycin-streptograminB)的耐藥性有關。而對紅霉素的耐藥基因ermBP和ermQ則存在于質粒和染色體上，易于造成對紅霉素耐藥性的傳播。⑤糖肽類抗生素細菌對糖肽類抗生素的耐藥性表現為對萬古霉素的耐藥性，三個耐藥基因vanH，vanA和vanX都有保守序列，其中以vanA為主，vanA可以整和到質粒上。⑥四環素類抗生素四環素類抗生素的耐藥基因tet廣泛分布很廣，目前常見的病原菌幾乎都帶有tet基因。⑦喹諾酮類抗生素細菌主要通過將喹諾酮類抗生素泵出而表現出耐藥性。溢出性泵如前所述。⑧甲氧芐啶類抗生素在G-菌中發現了17種質粒編碼的二氫葉酸還原酶的基因dhfr，它們導致對甲氧芐氨嘧啶的耐藥性。在dhfr出現在腸道球菌中10年后，現在在G+菌中也發現了dhfr。
綜上所述，目前細菌幾乎已經對每種抗生素都產生了耐藥性，而且很多單個的耐藥基因能抗多種不同的抗生素，多數的耐藥基因分布于轉座子和質粒上，因而造成了耐藥性的快速傳播。研究發現，在每一種新的抗生素投入臨床使用后不久(最短僅數月時間)，細菌就會演化出對這種抗生素的耐藥性。
面對如此復雜并不斷增加的細菌耐藥性，如何才能及時、準確地使用抗生素？傳統的藥敏試驗已經難以回答這一長久困擾醫學界的難題。
隨著基因工程和生物傳感器技術的發展而出現的基因芯片技術，為人們及時準確地查找稀少基因提供了簡潔途徑。采用基因芯片技術，我們有可能快速準確地直接從標本中檢測病原菌的耐藥基因，從而準確指導抗生素的正確使用。
本發明的耐藥基因芯片是通過將特異性針對細菌耐藥基因的核酸分子固定于固相載體表面而制成的。
本發明的基因芯片所采用的固相載體選自任何可用于制備基因芯片的材料，其包括，但不限于，玻璃片、硅片和塑料片。所述的固相載體經不同的化學修飾后，在其表面帶有可以固定核酸分子的活性基團。這些基團包括，但不限于，氨基(-NH2)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)和巰基(-SH)。
本發明的耐藥基因芯片是在所述的固相載體上連接有針對細菌耐藥基因的特異性核酸探針，所述的探針可以為單鏈或雙鏈DNA分子，其核苷酸序列選自耐藥基因雙鏈中的任一條鏈，而且在適當的條件下可以與耐藥基因特異性雜交。所述的探針可以通過DNA自動合成或PCR擴增而獲得，其長度至少為15個核苷酸，優選至少為20個核苷酸，更優選至少為30個核苷酸，還更優選至少為40個核苷酸，還更優選至少為50個核苷酸，最優選至少為60個核苷酸，還最優選至少為70個核苷酸。所述的核酸探針，在其與載體連接的一端可以選擇性地添加一個目的在于增加探針的空間活動性以利于雜交的連接臂，所述的連接臂可以由多聚胸腺嘧啶核苷poly(dT)n(n≥10)、多聚尿嘧啶核苷poly(dU)n(n≥10)或多聚腺嘌呤核苷poly(dA)n(n≥10)構成。
在本發明的耐藥基因芯片中，所述的核酸探針或用于制備探針的PCR引物在DNA自動合成時末端(5’端或3’端)被修飾(連接)有活性基團。這些活性基團包括，但不限于，羧基(-COOH)、氨基(-NH2)和巰基(-SH)。如核酸探針末端被羧基修飾，則羧基與載體表面的氨基反應，形成酰氨鍵而將該核酸分子以共價鍵連接到載體上。如核酸探針末端被氨基修飾，則氨基與載體表面的醛基或羧基反應，形成酰氨鍵而將該核酸分子以共價鍵連接到載體上。如核酸探針末端被巰基修飾，則巰基與載體表面的巰基反應形成二硫鍵而將該核酸分子以共價鍵連接到載體上。
本發明的耐藥基因芯片的制備，是利用微排序法按照設計將所述的核酸探針有序地點樣到載體上，通過核酸探針末端修飾的活性基團與載體表面相應的活性基團反應，形成共價連接，將探針固定于載體上，從而制成基因芯片。同時，在所制備的基因芯片上，每一種核酸探針都有固定的位置，因此在與樣品雜交后，通過對所捕獲陽性信號的尋址即可明確其對應的特定核酸探針，從而確定與其對應的耐藥基因。
本發明還涉及利用本發明的耐藥基因芯片對標本中細菌的耐藥基因進行檢測，其過程包括樣品的標記、與基因芯片的雜交以及雜交信號的檢測。
在所述的樣品標記過程中，可以利用本領域已知各種核酸標記方法使標本中的目的基因標記上信標分子，所述的方法包括，但不限于，PCR、RT-PCR、體外轉錄、隨機引物標記、缺口平移以及末端轉移標記等方法。所述的信標分子可以為熒光素或同位素；所述的熒光素包括，但不限于，Cy3、Cy3.5、Cy5、異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅；所述的同位素包括，但不限于，32P、。在適當的溫度和離子強度的條件下，將所述的標記產物與本發明的耐藥基因芯片進行雜交。雜交條件和方法是本領域已知的。雜交后，根據所選用的信標分子采用相應的檢測方法對基因芯片進行掃描分析，根據所捕獲陽性信號的位置尋址，判斷所述標本中細菌耐藥基因的種類。在信號采集和分析過程中所需的設備均已經商品化。
本發明的基因芯片采用耐藥基因特異性寡核苷酸作為探針，而在細菌耐藥基因檢測過程中利用基因特異性引物通過對目的基因的線性PCR擴增進行樣品的標記。本發明的基因芯片上連接的寡核苷酸探針和在PCR過程中所用擴增引物以及對應的耐藥基因均列于表6中。需要說明的是，本發明中所采用的寡核苷酸探針和對應的特異性引物也可以用于對目的基因進行普通的PCR擴增，而擴增后的PCR產物同樣可以作為探針用于按照上述方法制備耐藥基因芯片，因此利用所述的PCR產物作為探針所制備的耐藥基因芯片也在本發明的范圍之內。
表6。用于耐藥基因檢測的探針和引物序列及對應的耐藥基因
本發明通過以下實施例對本發明的基因芯片的制備、檢測方法及其應用進行描述。需說明的是，下述實施例只是用來說明而非限制本發明，本領域技術人員所熟知的其他用于通過基因芯片對細菌耐藥基因進行檢測的技術均在本發明的范圍內。
實施例1耐藥基因特異性寡核苷酸和擴增引物的合成利用DNA自動合成儀(PE)按照表6中所列的寡核苷酸序列合成相應的寡核苷酸探針和擴增引物。在合成耐藥基因特異性寡核苷酸探針過程中，于每條探針序列的5’端均添加20個額外的胸腺嘧啶核苷(poly(dT)20)，并對所合成寡核苷酸探針的5’端進行氨基修飾。
通過聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳對合成的所有寡核苷酸進行純化。所述的純化方法是本領域技術人員已知的。
實施例2細菌耐藥基因檢測基因芯片的制備將合成的耐藥基因特異性寡核苷酸探針分別溶于適當體積的無菌去離子水中，使各探針的終濃度均為60μM。從所有寡核苷酸探針溶液中各吸取5μl分別置于不同的微量離心管內，并向每個微量離心管中分別加入5μl的二甲基亞砜(DMSO)(Sigma，美國)。將兩種溶液充分混勻后，各取5μl置于386孔板的相應孔中。以醛基修飾的玻片(CSS-100 Silylated Slides，CEL Associates，Inc.，休斯敦，美國)作為固相載體，制備細菌耐藥基因檢測基因芯片。
利用GSI Flexys基因芯片點樣儀(Genomic Solution，美國)將各寡核苷酸探針樣品均按照3×3的矩形點陣點到玻片上相應的位置處，這樣不同位置上的寡核苷酸探針矩陣便對應于相應的耐藥基因。室溫下將點制的基因芯片避光放置至少24小時。
實施例3標本中細菌耐藥基因的PCR線性擴增和擴增產物的熒光素標記利用耐藥基因特異性引物通過線性PCR擴增對標本中細菌的耐藥基因進行擴增，并在擴增過程中向擴增產物中摻入熒光素，以便隨后通過激光共聚焦掃描儀進行檢測。
將所有的耐藥基因特異性引物溶于適當體積的無菌去離子水中，調整體積，使全部引物合并后各引物的終濃度均為10μM。按照本領域技術人員已知的線性擴增方法，以標本DNA為模板利用該引物混合物對標本中相應的細菌耐藥基因進行擴增。簡言之，在50μl PCR反應體系中的成分如下1×Taq酶反應緩沖液、2.0mM MgCl2、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP、2μM引物、2μg模板DNA。將所述的PCR混合物在95℃變性5分鐘后加入Taq酶1u，隨后以94℃30秒，50℃30秒，72℃120秒的循環參數進行50個循環，最后于72℃反應5分鐘。利用Microcon 30(MilliporeCorporation，美國)按照制造商的使用說明對PCR反應產物進行純化，具體操作如下將PCR產物加入到Microcon 30樣品池中，并用去離子水補足體積至500μl；將其置于一微量離心管中，室溫下以12,000×g離心10分鐘；將樣品池取出，加入10μl去離子水，并將其倒置放于一微量離心管中，室溫下以12,000×g離心2分鐘。將純化的PCR產物用于進行與基因芯片的雜交。
實施例4隨機引物6聚體對標本中細菌耐藥基因熒光素標記利用隨機引物6聚體和大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段(TaKaRa公司，大連，中國)按照本領域技術人員已知的方法對標本中細菌耐藥基因進行熒光素標記。具體如下配置反應體系，使得在50μl終體積中含有1×大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段反應緩沖液、15μg的隨機引物6聚體、各200μM的dATP、dTTP和dGTP、各100μM的dCTP和Cy3-dCTP以及2μg模板DNA。將上述混合物在99℃變性2分鐘后立即置于冰浴上，隨后加入50個單位的大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段，并于37℃溫育2小時。反應結束后，利用Microcon 30(Millipore Corporation，美國)按照前面所述的方法對反應產物進行純化。
實施例5耐藥基因PCR擴增產物與基因芯片的雜交和檢測按照本領域已知的方法對耐藥基因芯片進行雜交前的預處理，具體操作如下將基因芯片經60mJ的紫外線交聯后，用0.2％SDS室溫洗滌2次，各2分鐘；隨后用H2O室溫洗滌2次，各2分鐘；將基因芯片置于Na2BH4(1.3gNa2BH4溶于375ml PBS中，并加入125ml無水乙醇)溶液中室溫洗滌10分鐘；用0.2％SDS室溫洗滌2次，各1分鐘；用H2O分別于室溫和95℃各洗滌1分鐘后干燥待用。將純化的PCR產物或隨機引物標記產物與雜交緩沖液(12×SSC，0.2％SDS)等體積混合，99℃變性5分鐘后立即置于冰浴中冷卻。將所述的雜交液滴加在基因芯片一側的邊緣，小心蓋上蓋玻片，使雜交液均勻分布在基因芯片和蓋玻片之間，隨后將其置于濕盒中，于70℃雜交1小時。雜交后，取出基因芯片，并立即投入到2×SSC+0.2％SDS溶液中，輕輕移去蓋玻片，洗滌5分鐘，隨后用1×SSC+0.1％SDS液繼續洗滌5分鐘，繼而在0.05×SSC中洗滌5分鐘，取出后自然涼干。利用GeneTAC 2000基因芯片掃描儀(Genomic Solution Inc.，美國)，在532nm的激發光波長下進行掃描并自動曝光。分析掃描結果，并對熒光信號進行尋址，并與特異性寡核苷酸探針相對應，確定標本中細菌耐藥基因的表達狀況。
權利要求
1.耐藥基因芯片，其用于對標本中細菌的耐藥基因進行檢測，是通過將針對細菌各種耐藥基因的特異性寡核苷酸固定于固相載體上制成的。
2.權利要求1的基因芯片，其以玻璃片、硅片、塑料片或者其它可以用于制備基因芯片的材料作為固相載體，所述的固相載體表面經化學修飾而帶有活性基團。
3.權利要求2的活性基團，其可以選自氨基(-NH2)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)和巰基(-SH)。
4.具有表6中所列核苷酸序列的寡核苷酸，其用于耐藥基因芯片的制備和細菌耐藥基因的檢測，所述的核苷酸序列中探針序列和引物序列分別屬于所述耐藥基因的互補鏈之一。
5.權利要求4的寡核苷酸，其中探針序列可直接用于制備基因芯片，在所述探針末端(5’端或3’端)修飾(連接)有活性基團，所述的活性基團選自羧基(-COOH)、氨基(-NH2)和巰基(-SH)。
6.權利要求4的寡核苷酸，其中探針序列可與引物序列聯合用于相關耐藥基因DNA序列的PCR擴增，所獲的PCR產物也可用于制備基因芯片。
7.權利要求4的寡核苷酸，其中引物序列通過對目的基因的線性PCR擴增而將信標分子標記到擴增產物上，所述的擴增產物通過與基因芯片上的探針雜交而被檢測。
全文摘要
本專利涉及檢測細菌耐藥基因的基因芯片技術，包括固定于基因芯片載體上的寡核苷酸探針的DNA序列、將目標耐藥基因進行PCR線性擴增的延伸引物的DNA序列、PCR線性擴增的條件、將PCR產物于芯片上探針雜交的條件。PCR線性擴增的目的是增加目標耐藥基因的拷貝數同時將其標記上熒光素等信標。
文檔編號C12Q1/68GK1396271SQ0112044
公開日2003年2月12日 申請日期2001年7月13日 優先權日2001年7月13日
發明者劉元, 王鶴堯, 李梁, 石朝輝 申請人:北京三雄高新技術開發有限責任公司