新的stra6多肽的制作方法

專利名稱：新的stra6多肽的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及鑒定和分離新的DNA，涉及重組產生具有類似于鼠Stra6(一種鼠視黃酸易感蛋白)序列的新多肽。早些時候曾經將這些分子中的一些稱為″PRO10282″，但在下文中也將之稱為″Stra6″多肽。
背景技術：
膜結合蛋白膜結合蛋白和受體在多細胞生物的構造、分化和維持方面發揮重要作用。許多單個細胞的命運，如增殖、遷移、分化或與其它細胞相互作用，通常被接收自其它細胞和/或即時環境的信息所控制。這種信息常常由分泌多肽進行傳輸(例如，致有絲分裂因子，存活因子，細胞毒因子，分化因子，神經肽和激素)，而分泌多肽反過來被各種細胞受體或膜結合蛋白接收并翻譯。此類膜結合蛋白和細胞受體包括但不限于細胞因子受體、受體激酶、受體磷酸酶、細胞-細胞相互作用中所涉及的受體，以及細胞粘附分子如選擇蛋白和整聯蛋白。舉例來說，調節細胞生長和分化的信號轉導部分程度上受各種細胞蛋白質的磷酸化作用的調節。蛋白酪氨酸激酶(催化磷酸化過程的酶)，也起著生長因子受體的作用。實例包括成纖維細胞生長因子受體和神經生長因子受體。
膜結合蛋白和受體分子具有多種工業用途，包括作為藥劑和診斷劑。比如，受體免疫粘附素可用作阻斷受體-配體相互作用的治療劑。膜結合蛋白也可用于篩選相關受體/配體相互作用的潛在的肽或小分子抑制劑。
工業和學術界都在進行著鑒定新的、天然受體或膜結合蛋白的不懈努力。許多努力集中在篩選哺乳動物重組DNA文庫上以確定新受體或膜結合蛋白的編碼序列。
本發明Stra6多肽與鼠蛋白Stra6具有序列同源性(73％相同和81％相似)，所述鼠蛋白Stra6的表達是由視黃酸誘導的。(Bouillet等，Dev.Biol.170420-433；Bouillet等，Mech.Dev.63173-186；Chazaud等，Dev.Genet.1966-73)。既然視黃酸是脊椎動物發育過程中一重要的信號分子，那么，認為應答視黃酸而誘導的基因在胚胎發育的生長和分化中發揮著重要作用。使用設計的為鑒定和分離視黃酸誘導基因的扣除雜交法，從P19鼠胚胎癌性細胞中分離出鼠Stra6 cDNA，后者并未顯示出與前面描述的蛋白質具有相似性。它含有與多個跨膜結構域相應的高度疏水伸展(stretches)的氨基酸殘基，此是膜內在蛋白的一個特征。基于其表達模式，Stra6被認為在胚胎發育過程的早期對于背腹側肢(dorsoventral limb)的結構形式和后期對軟骨內成骨的控制方面起著重要作用(Chazaud等，Dev.Genet.1966-73)。
本文公開的Stra6多肽含有多個可能是構成跨膜結構域的高度疏水區，其表明Stra6多肽是膜內在蛋白。它們可以作為未知配體的受體發揮作用，并可能是影響細胞生長、發育或分化的信號轉導通路的一部分。
腫瘤細胞中的基因擴增在美國，惡性腫瘤(癌)是導致死亡的居心臟疾病之后的第二位主要原因(Boring等，CA Cancel J.Clin.，43:7)。
惡性腫瘤的特征是，異常細胞數量增加或衍生自正常組織的腫瘤細胞增生形成腫瘤塊，這些贅生的腫瘤細胞侵襲毗鄰組織，并且增生的惡變細胞逐漸經血液或淋巴系統擴散到局部淋巴結和遠端部位(轉移)。在癌性狀態下，細胞在正常細胞不生長的環境下增生。惡性腫瘤本身表現出多種形態，均以不同程度的侵襲性和侵犯性為特征。
基因表達的改變與不受抑制的細胞生長和去分化密切相關，而不受抑制的細胞生長和去分化是所有惡性腫瘤的共同特征。業已發現，一些進行過較好研究的腫瘤的基因組顯示出隱性基因的表達減弱，隱性基因通常指腫瘤抑制基因，正常功能是抑制惡變細胞生長和/或抑制那些促進惡性腫瘤生長的某些優勢基因如致癌基因的過度表達。這些中的每一種遺傳學變化顯得是腫瘤具有某些特性的原因，集合起來，則表現出全部的腫瘤表型(Hunter，Cell，641129和Bishop，Cell，64235-248)。
眾所周知，腫瘤細胞中基因(例如，致癌基因)過度表達機制是基因擴增。這是在祖細胞染色體中產生特定基因多拷貝的過程。該過程涉及含有特定基因的染色體區域的異常復制，然后將復制的片段再重組回染色體中(Alitalo等，Adv.Cancer Res.，47235-281)。據信，基因過度表達與基因擴增相平行，即與生產的拷貝數成正比。
已經確定，編碼生長因子和生長因子受體的原癌基因在各種人類惡性腫瘤(包括乳腺癌)的病因學中起著重要作用。例如，業已發現編碼與表皮生長因子受體(EGFR)有關的185 kd跨膜糖蛋白受體(p185HER2，HER2)的人ErbB2基因(erbB2，也稱為her2或c-erbB-2)，在約25％～30％的人乳腺癌中過度表達(Slamon等，Science 235177-182；Slamon等，Science 244707-712)。
據報道，原癌基因的基因擴增是更大惡性程度的惡性腫瘤中通常涉及的事件，并且可以起到臨床發病預報器的作用(Schwab等，Genes ChromosomesCancer，1181-193；Alitalo等，同上)。因此，erbB2過度表達一般被認為是預后差的預示，尤其對累及腋窩淋巴結的原發性疾病的患者而言(Slamon等，和，同上；Ravdin和Chamness，Gene，15919-27；以及Hynes and Stern，Biochim.Biophys.Acta，1198165-184)，而且與對激素治療和化學療法的敏感性和/或抗性相關，所述化學療法包括CMF(環磷酰胺，甲氨蝶呤，和氟尿嘧啶)和蒽環霉素(Baselga等，Oncology，11(3 Suppl1)43-48)。然而，盡管erbB2過度表達與預后差有關，但是HER2-陽性患者對用taxanes治療的臨床反應幾率卻比HER2-陰性患者的反應幾率大3倍以上(同上)。重組人源化抗ErbB2(抗-HER2)單克隆抗體(鼠抗ErbB2抗體4D5的人源化版本，稱作rhuMAb HER2或HERCEPTINTM，對已經接受過廣泛抗癌治療的ErbB2過度表達型轉移性乳腺癌患者進行的臨床治療有效(Baselga等，J.Clin.Oncol.14737-744)。
據上所述，顯然存在著對于鑒定在診斷和治療與基因擴增有關的腫瘤中有用的新的分子、方法和組合物的極大興趣。
發明概述已經鑒定了與編碼鼠視黃酸易感蛋白Stra6并編碼667個氨基酸的新多肽(在本申請中稱為全長天然序列人″PRO10282″)的核酸具有同源性的人cDNA克隆(本文中指定為DNA148380-2827)。已經鑒定了編碼658個氨基酸的新多肽(PRO 19578)的另一人cDNA克隆(本文指定為DNA148389-2827-1)，顯示出與鼠Stra6和天然序列人PRO10282均具有顯著序列同源性，它被認為是天然序列人PRO10282的剪切變體。正如后面將要討論的那樣，根據與鼠Stra6的同源性，也將本發明PRO10282多肽(包括天然序列和變體分子)稱為″Stra6″多肽。
在一實施方案中，本發明提供分離的含有編碼PRO10282多肽的核苷酸序列的核酸分子。
一方面，分離的核酸分子含有與(a)編碼具有圖2(SEQ ID NO2)所示從約1至約667位氨基酸的序列(包括兩端殘基在內)的PRO10282多肽的DNA分子，或者(b)編碼具有圖7(SEQ ID NO5)所示從約1至約658位氨基酸的序列(包括兩端殘基在內)的PRO19578多肽的DNA分子，或者(c)(a)或(b)所述DNA分子的互補鏈，具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％或約99％核酸序列同源的核苷酸序列。
另一方面，該分離的核酸分子含有(a)編碼具有圖2(SEQ ID NO2)所示從約1至約667位氨基酸的序列(包括兩端殘基在內)的PRO10282多肽的核苷酸序列，或者(b)編碼具有圖7(SEQ ID NO5)所示從約1至約658位氨基酸的序列(包括兩端殘基在內)的PRO19578多肽的核苷酸序列，或者(b)(a)或(b)所述核苷酸序列的互補序列的核酸分子。
再一方面，該分離的核酸分子含有與(a)

圖1(SEQ ID NO1)所示由約49至約2049位核苷酸的序列(包括兩端殘基在內)的DNA分子，或者(b)圖6(SEQ ID NO4)所示由約186至約2159位核苷酸的序列(包括兩端殘基在內)的DNA分子，或者(a)或(b)所述DNA分子的互補序列，具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％或約99％核酸序列同源的核苷酸序列。
另一方面，該分離的核酸分子含有圖1(SEQ ID NO1)所示由約49至約2049位核苷酸的序列(包括兩端殘基在內)，或者(b)圖6(SEQ ID NO4)所示約186至約2159位核苷酸序列(包括兩端殘基在內)，或者(c)(a)或(b)核苷酸序列的互補序列。
此外，本發明涉及分離的核酸分子，其含有與(a)編碼由2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PTA-1181(DNA 148380-2827)的人蛋白cDNA編碼的相同成熟多肽的DNA分子，或者(b)編碼由2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PTA-1402(DNA 148389-2827-1)的人蛋白cDNA編碼的相同成熟多肽的DNA分子，或者(c)(a)或(b)所述DNA分子的互補序列，具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％或約99％核酸序列同源的核苷酸序列。在一優選的實施方案中，分離的核酸分子含有(a)編碼與2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PTA-1181(DNA 148380-2827)的人蛋白cDNA編碼的相同成熟多肽的核苷酸序列，或者(b)編碼由2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PTA-1402(DNA 148389-2827-1)的人蛋白cDNA編碼的相同成熟多肽的核苷酸序列，或者(c)(a)或(b)所述核苷酸序列的互補序列。
另一方面，發明涉及分離的核酸分子，其含有與(a)2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PT-1181(DNA148380-2827)的人蛋白cDNA的全長多肽編碼序列，或者(b)2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PTA-1402(DNA 148389-2827-1)的人蛋白cDNA的全長多肽編碼序列，或者(c)(a)或(b)所述核苷酸序列的互補序列，具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％或約99％核酸序列同源的核苷酸序列。
在一優選的實施方案中，分離的核酸分子含有(a)2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PT-1181(DNA148380-2827)的人蛋白cDNA的全長多肽編碼序列，或者(b)2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PTA-1402(DNA 148389-2827-1)的人蛋白cDNA的全長多肽編碼序列，或者(c)(a)或(b)所述核苷酸序列的互補序列。
還一方面，發明涉及編碼下面定義的活性PRO10282多肽的分離的核酸分子，其包括能與編碼圖2(SEQ ID NO2)中1～約667位氨基酸(包括兩個端點氨基酸殘基在內)的核酸序列的互補序列，或者與編碼圖7(SEQ ID NO5)中1～約658位氨基酸(包括兩個端點氨基酸殘基在內)的核酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列，其中該分離的核酸分子不是編碼鼠Stra6的DNA。優選地，雜交在嚴格雜交條件和洗滌條件下發生。
另一方面，發明涉及編碼下面定義的活性PRO10282多肽的分離的核酸分子，其包括與圖1(SEQ ID NO1)所示核苷酸約49和約2049之間(包括兩個端點殘基在內)核酸序列的互補序列，或者與圖6(SEQ ID NO4)所示核苷酸約186和約2159之間(包括兩個端點殘基在內)核酸序列的互補序列雜交的核苷酸序列，其中該分離的核酸分子不是編碼鼠Stra6的DNA。優選地，雜交在嚴格雜交條件和洗滌條件下發生。
再一方面，發明涉及具有至少約765個核苷酸的分離的核酸分子，其是在嚴格條件下使測試DNA分子與(a)編碼含圖2(SEQ ID NO2)所示從約1至約667的氨基酸序列(包括兩端殘基在內)的PRO10282多肽的DNA分子，或者(b)編碼含圖7(SEQ ID NO5)所示從約1至約658的氨基酸序列(包括兩端殘基在內)的PRO19578多肽的DNA分子，或者(c)(a)或(b)所述DNA分子的互補序列進行雜交而產生的，而且，如果該測試DNA分子與(a)或(b)具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％、更優選至少約99％的核酸序列同一性，則分離該測試DNA分子。
另一方面，發明涉及分離的核酸分子，其含有與(a)編碼含圖2(SEQ IDNO2)所示從約1至約667的氨基酸序列(包括兩端殘基在內)，或者(b)編碼含圖7(SEQ ID NO5)所示從約1至約658的氨基酸序列(包括兩端殘基在內)相比，具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％、更優選至少約99％評分陽性的多肽的核苷酸序列，或者含有(c)(a)或(b)所述核苷酸序列的互補序列。
本發明的另一特定方面，本發明提供包含編碼PRO10282的核苷酸序列的分離的核酸分子，該核苷酸序列要么編碼跨膜結構域缺失或者跨膜結構域失活，要么與此編碼核苷酸序列互補，其中跨膜結構域已被試驗性地確定為在圖2(SEQ ID NO2)所示序列中，從約氨基酸54位向約氨基酸69位延伸、從約氨基酸102位向約氨基酸119位延伸、從約氨基酸148位向約氨基酸166位延伸、從約氨基酸207位向約氨基酸222位延伸、從約氨基酸301位向約氨基酸320位延伸、從約氨基酸364位向約氨基酸380位延伸、從約氨基酸431位向約氨基酸451位延伸、從約氨基酸474位向約氨基酸489位延伸、和從約氨基酸512位向約氨基酸531位延伸；而在圖7(SEQ ID NO5)所示序列中，從約氨基酸54位向約氨基酸71位延伸、從約氨基酸93位向約氨基酸111位延伸、從約氨基酸140位向約氨基酸157位延伸、從約氨基酸197位向約氨基酸214位延伸、從約氨基酸291位向約氨基酸312位延伸、從約氨基酸356位向約氨基酸371位延伸、從約氨基酸425位向約氨基酸481位延伸、從約氨基酸505位向約氨基酸522位延伸。因此，本發明所述PRO10282多肽的可溶性細胞外結構域也在考慮之內。
在這點上，本發明的另一方面涉及分離的核酸分子，其含有與(a)編碼圖2(SEQ ID NO2)1至X氨基酸的DNA分子，其中X是圖2(SEQ ID NO2)中自49到59的任何氨基酸，或(b)(a)中DNA分子的互補序列具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％、更優選至少約99％同一性的核苷酸序列。在一特定方面，該分離的核酸分子含有(a)編碼圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中1至X氨基酸的核苷酸序列，其中X是圖2(SEQ ID NO2)中自49至59的任何氨基酸，或者(b)(a)中DNA分子的互補序列。一特定方面，該分離的核酸分子含有(a)編碼圖2 ISEQ ID NO2)，或圖7(SEQ ID NO5)中1至X的氨基酸，其中X是圖2(SE ID NO2)，或圖7(SEQ ID NO5)自49至59的任何氨基酸(包括兩端氨基酸殘基在內)，或者(b)(a)中DNA分子的互補序列的核苷酸序列。
本發明還有一方面，分離的核酸分子(a)編碼與圖2(SEQ ID NO2)，或圖7(SEQ ID NO5)中約1至X殘基氨基酸序列，其中X是圖2(SEQ IDNO2)中自49至59的任何氨基酸，或者(b)(a)中DNA分子的互補序列相比，具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％、更優選至少約99％陽性評分的多肽。
另一實施方案，涉及PRO10282多肽編碼序列片段，這些片段例如可用作雜交探針，或者可任選地編碼含抗-PRO10282抗體結合位點的PRO10282多肽的編碼片段。此類核酸片段長度通常至少約20個核苷酸，優選至少約30個核苷酸，更優選至少約40個核苷酸，更優選至少約50個核苷酸，更優選至少約60個核苷酸，更優選至少約70個核苷酸，更優選至少約80個核苷酸，更優選至少約90個核苷酸，更優選至少約100個核苷酸，或者至少約110個核苷酸，更優選至少約120個核苷酸，更優選至少約130個核苷酸，更優選至少約140個核苷酸，或者至少約150個核苷酸，更優選至少約160個核苷酸，更優選至少約170個核苷酸，更優選至少約180個核苷酸，或者至少約190個核苷酸，更優選至少約200個核苷酸，更優選至少約250個核苷酸，更優選至少約300個核苷酸，更優選至少約350個核苷酸，更優選至少約400個核苷酸，更優選至少約450個核苷酸，更優選至少約500個核苷酸，更優選至少約600個核苷酸，更優選至少約700個核苷酸，更優選至少約800個核苷酸，更優選至少約900個核苷酸，更優選至少約1000個核苷酸，其中本文術語“約”是指核苷酸序列有關長度加或減10％。本發明核酸片段不同于鼠Stra6天然編碼序列的片段。在一優選的實施方案中，該核苷酸序列片段衍生自圖1(SEQ ID NO1)或圖6(SEQ ID NO4)所示核苷酸序列的任何編碼區。應當指出，可用常規方法測定編碼PRO10282多肽的核苷酸序列的新片段，所述方法是通過使用眾多公知的序列對比程序中任何一個，將編碼PRO10282多肽的核苷酸序列與其它已知核苷酸序列對比，測定出其中哪個或哪幾個編碼PRO10282多肽的核苷酸序列片段是新的。本文考慮到了所有這類編碼PRO10282多肽的核苷酸序列，并且可以用不繁瑣的實驗予以測定。也考慮到由這些核苷酸分子片段編碼的PRO10282多肽片段，優選是含有抗-PRO10282抗體結合位點的那些PRO10282多肽片段。
在另一實施方案中，本發明提供含有編碼PRO10282或其變體的核苷酸序列的載體。該載體可含有上述鑒定的任何分離的核酸分子。
也提供含有此類載體的宿主細胞。例如，宿主細胞可以是CHO細胞、大腸桿菌或酵母。進一步提供生產PRO10282多肽的方法，包括在適宜表達PRO10282的條件下培養宿主細胞并從細胞培養物中回收PRO10282。
在另一實施方案中，發明提供由上面鑒定的任一分離的核酸序列所編碼的分離的PRO10282多肽。
一特定方面中，本發明提供分離的天然序列的PRO10282多肽，它在某些實施方案中包括含有圖2(SED ID ND2)中自約1至約667殘基，或者圖7(SEQID NO5)自約1至約658殘基的氨基酸序列。
另一方面，本發明涉及分離的PRO10282多肽，其包括與圖2(SEQ IDNO2)中約1到約667殘基所示氨基酸序列(包括兩端殘基在內)，或與圖7(SEQID NO5)中從約1至約658的殘基氨基酸序列(包括兩端氨基酸殘基在內)具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％、或更優選至少約99％同一性的氨基酸序列。
再一方面，本發明涉及分離的PRO10282多肽，其含有與2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PTA-1191(DNA148380-2827)或2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PTA-1402(DNA148389-2827-1)的人蛋白cDNA編碼的氨基酸序列具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％或至少約99％同一性的氨基酸序列。在一優選的實施方案中，分離的PRO10282多肽含有2000年1月11日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PTA-1191(DNA148380-2827)或2000年2月23日在ATCC保藏的ATCC保藏號為PTA-1402(DNA148389-2827-1)的人蛋白cDNA編碼的氨基酸序列。
另一方面，發明涉及分離的PRO10282多肽，其含有與圖2(SEQ ID NO2)中約1到約667位殘基的氨基酸序列(包括兩端殘基在內)或圖7(SEQ IDNO5)中約1到約659位殘基的氨基酸序列(包括兩端殘基在內)相比，具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％、或更優選至少約99％評分陽性的氨基酸序列。
本發明另一方面提供分離的PRO10282多肽，其要么跨膜結構域缺失要么跨膜結構域失活。本文也描述產生該多肽的方法，該方法包括在適宜PRO10282多肽表達的條件下培養含有適合編碼核酸分子的載體的宿主細胞，并從細胞培養物中回收PRO10282多肽。
照這樣，本發明一方面涉及分離的可溶性PRO10282多肽，其含有與圖2(SEQ ID NO2)，或圖7(SEQ ID NO5)中1至X氨基酸(所述X是圖2(SEQ ID NO2)，或圖7(SEQ ID NO5)中自49至59的任何氨基酸)具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％、或更優選至少約99％序列同一性的氨基酸序列。
在本發明的又一方面，該分離的可溶性PRO10282多肽含有與圖2 (SEQID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中約1至X的殘基氨基酸序列相比時，(其中X是圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中自49至59的任何氨基酸)具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％、或更優選至少約99％評分陽性的氨基酸序列。
還有一方面，本發明涉及分離的PRO10282多肽，其含有圖2(SEQ IDNO2)中從1約至約667殘基的氨基酸序列(包括兩端氨基酸殘基在內)，或圖7(SEQ ID NO5)中從1約至約658殘基的氨基酸序列(包括兩端氨基酸殘基在內)，或其生物活性片段，或足以提供與抗-PRO1282抗體結合位點的片段，其中具有生物活性或提供抗-PRO10282抗體結合位點的PRO10282多肽片段的鑒定，可以用本領域公知的常規技術來完成。這里的片段不是鼠Stra6多肽的片段。優選地，PRO10282片段在性質上保留天然PRO10282多肽的生物活性。
再一方面，本發明提供如下制備的多肽(i)在嚴格條件下，使測試DNA分子與(a)編碼具有圖2(SEQ ID NO2)中約1至約667殘基的氨基酸序列(包括兩端殘基在內)的PRO10282多肽的DNA分子，或者(b)編碼具有圖7(SEQID NO5)中約1至約658殘基氨基酸序列(包括兩端殘基在內)的PRO19578多肽的DNA分子，(c)(a)或(b)所述DNA分子的互補序列，進行雜交，且如果該測試DNA分子與(a)或(b)或(c)具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％或至少約99％的核酸序列同一性，則(ii)在適宜表達該多肽的條件下培養含有該測試DNA分子的宿主細胞，和(iii)從細胞培養物中回收該多肽。
在另一實施方案中，本發明提供含有與異源多肽或氨基酸序列融合的PRO10282多肽的嵌合分子，其中PRO10282多肽可含有前述任何PRO10282多肽或其變體或片段。此嵌合分子的一個實例是含有與免疫球蛋白表位標簽序列或Fc區融合的PRO10282多肽的嵌合分子。
在另一實施方案中，發明提供下述定義的與前述PRO10282多肽特異結合的抗體。任選地，抗體是單克隆抗體、抗體片段或單鏈抗體。
在另一實施方案中，本發明涉及下述定義的天然PRO10282多肽的激動劑和拮抗劑。在一具體實施方案中，激動劑或拮抗劑是抗-PRO10282抗體或小分子。
在另一實施方案中，發明涉及鑒定PRO10282多肽的激動劑或拮抗劑的方法，方法包括使PRO10282多肽與候選分子接觸，并檢測由所述PRO10282多肽介導的生物活性。優選地，PRO10282多肽是天然PRO10282多肽。
在另外一個實施方案中，本發明涉及含有本文所述PRO10282多肽、PRO10282多肽的激動劑或拮抗劑、或抗-PRO10282抗體、以及載體的組合物。任選地，載體是可藥用載體。
本發明另一實施方案涉及本文所述PRO10282多肽或其激動劑或拮抗劑或抗-PRO10282抗體在制備用于治療對PRO10282多肽、其激動劑或拮抗劑、或抗-PRO10282抗體敏感的病癥的藥物中的應用。
再一方面，本發明涉及與PRO10282多肽特異結合的抗體。優選地，該抗體誘導表達PRO10282多肽的細胞死亡。在一具體優選的實施方案中，細胞是與相同組織類型的正常細胞相比過度表達PRO10282多肽的癌細胞。抗體優選是人源化的或人抗體，并且包括抗體片段單鏈抗體。
另一方面，本發明涉及含有與PRO10282多肽特異結合的抗體的組合物。
還有一方面，本發明涉及編碼與PRO10282多肽特異結合的抗體的分離的核酸分子、含有該核酸的載體以及含有該載體的宿主細胞。本發明也涉及生產抗-PRO10282抗體的方法。
在另外一個實施方案中，本發明涉及檢測在懷疑含有PRO10282多肽的樣品中是否存在該多肽的方法，方法如此進行將樣品暴露于抗-PRO10282抗體(或PRO10282的另一拮抗劑)，并測定樣品中該抗體(或拮抗劑)與PRO10282多肽的結合。在一具體重要的實施方案中，樣品取自癌細胞。
在一不同的實施方案中，本發明涉及診斷哺乳動物腫瘤的方法，包括檢測在(a)取自該哺乳動物的測試組織樣品中，和(b)取自相同細胞類型的已知正常組織細胞的對照樣品中，編碼PRO10282多肽的基因的表達水平。與對照樣品相比，測試樣品中表達水平較高，表明測試組織所取自的哺乳動物存在腫瘤。
根據本發明的另一方法，如下步驟診斷哺乳動物中的腫瘤(a)將抗PRO10282抗體與取自該哺乳動物組織細胞的測試樣品進行接觸，和(b)檢測測試樣品中抗體與PRO10282多肽之間復合物的形成。復合物形成，表明哺乳動物中存在腫瘤。
另一方面，本發明涉及癌診斷試劑盒，其含有抗-PRO10282抗體(或PRO10282的不同拮抗劑)和在適宜包裝中的載體。任選地，試劑盒也含有指導使用抗體或其它拮抗劑來檢測樣品中存在PRO10282多肽的說明書。
還有一方面，本發明涉及抑制腫瘤細胞生長的方法，通過使表達PRO10282多肽的腫瘤細胞暴露于抑制PRO10282多肽生物活性的有效量的制劑中，從而抑制腫瘤細胞的生長。制劑可以例如是抗-PRO10282抗體或PRO10282的另一拮抗劑。腫瘤細胞可進一步暴露于常規的腫瘤治療中，如放射治療、用細胞毒性劑和/或化療劑治療等。
另一不同方面，本發明涉及抑制腫瘤細胞生長的方法，通過使表達PRO10282多肽的腫瘤細胞暴露于抑制該多肽表達的有效量的制劑中，從而抑制腫瘤生長。
本發明進一步涉及阻止或減緩(減弱)以PRO10282多肽過度表達為特征的腫瘤發展、生長或擴散的類似方法。該治療可直接減少腫瘤細胞的病變，或者使得腫瘤細胞對于其它治療劑的治療(例如放療和/或化療)更為敏感。本發明特別包括控制異常或轉移，控制對毗鄰組織正常功能的干擾、控制細胞因子或其它分泌產物非正常水平釋放、控制炎癥或免疫應答的抑制或加重等的方法。
本發明進一步涉及一種制品，包括一容器，貼在容器上的標簽，和裝在容器中的含有活性劑的組合物；其中組合物對于抑制腫瘤生長是有效的，而貼在容器上的標簽則注明該組合物用于治療以腫瘤細胞中過度表達PRO10282多肽為特征的病癥是有效的。
再有一方面，本發明涉及鑒定抑制PRO10282多肽生物學或免疫學活性的化合物的方法在控制條件下，使候選化合物與PRO10282多肽接觸足夠長時間，以使兩種組分相互作用，并檢測PRO10282多肽的生物學或免疫學活性是否被抑制。
另一方面，本發明涉及鑒定抑制PRO10282多肽活性的化合物的方法，包括下列步驟(a)在存在PRO10282多肽、適宜由PRO10282多肽正常地誘導細胞應答的條件下，使細胞與被篩選的候選化合物接觸，和(b)檢測所述細胞應答的誘導情況，以決定測試化合物是否是有效的拮抗劑。細胞應答誘導缺乏，表明測試化合物是有效的拮抗劑。
本發明還涉及鑒定抑制在表達PRO10282多肽的細胞中表達該肽的化合物的方法，通過使細胞與候選化合物接觸，并測定表達是否被抑制。
本發明特別涉及通過本文篩選方法鑒定的PRO10282激動劑和拮抗劑。此類激動劑和拮抗劑包括但不限于抗-PRO10282抗體、多肽、肽、和具有激動劑或拮抗劑特性的小的有機分子。
附圖簡述圖1顯示含有編碼天然序列PRO10282的核苷酸序列(核苷酸1-2732)cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，其中該核苷酸序列(SEQ ID NO1)是本文稱為″DNA 148380-2827″的克隆。也以粗字體和下劃線標出各自的起始和終止密碼子的位置。
圖2顯示衍生自SEQ ID NO1中編碼序列的天然序列PRO10282多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。也顯示各種其它重要多肽結構域的近似位置。
圖3A-D顯示使用ALIGN-2序列比較計算機程序，用下述方法測定氨基酸序列同一性％(表3(A-B))和核酸序列同一性％(表3(C-D))的假設的例證，其中″PRO″表示假設的目標PRO10282多肽的氨基酸序列，″對照蛋白質″表示使目標″PRO″多肽與其進行比較的多肽的氨基酸序列，″PRO-DNA″表示假設的編碼PRO10282的目標核酸序列，″對照DNA″表示使目標核酸分子″PRO-DNA″與其進行比較的核酸分子的核苷酸序列，″X″、Y″和″Z″各自代表不同的假定氨基酸殘基，而″N″、″L″和″V″各自代表不同的假定核苷酸。
圖4A-Q提供ALIGN 2序列對比計算機程序的全部源序列碼。為在UNIX操作系統上使用，可以對該源序列碼進行常規編制，以提供ALIGN 2序列對比計算機程序。
圖5顯示本文指定為DNA100038(SEQ ID NO3)的核苷酸序列。
圖6顯示含有編碼天然序列人Stra6多肽變體的核苷酸序列(核苷酸1-2778)的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO4)，其中核苷酸序列(SEQ IDNO4)是本文指定為″DNA148389-2827-1″的克隆。也以粗體和下劃線標出各自起始和終止密碼子的位置。
圖7顯示衍生自SEQ ID ND4編碼序列的天然序列人Stra6多肽變體的氨基酸序列(SEQ ID NO5)。也顯示各種其它重要多肽結構域的近似位置。
圖8是圖式表示DNA 148380-2827(天然的人PRO10282)編碼的鼠Stra6和人Stra6蛋白。
圖9顯示DNA 148380-2827(天然的人PRO10282)編碼的天然序列人Stra6蛋白的疏水性。
圖10顯示DNA148380-2827編碼的天然序列人Stra6蛋白在各種正常人組織中的相對RNA表達情況。
圖11顯示用定量PCR測定，DNA 148380-2827編碼的天然序列人Stra6蛋白在人結腸腫瘤組織中相對于在同一患者正常粘膜中RNA表達的RNA折疊(fold)表達。數據來自同一試驗中所作的一式三份實驗。使用不同套PCR引物，至少重復試驗2次。
圖12A顯示使用看家基因GAPDH作對照，DNA 148380-2827編碼的天然序列人Stra6蛋白在人結腸組織中相對于在同一患者正常粘膜中RNA表達的RNA表達。
圖12B顯示通過原位雜交，Stra6在結腸腺癌的上皮腫瘤細胞上的定位。
圖13顯示DNA148380-2827編碼的天然人Stra6蛋白在人乳腺、腎、結腸和肺腫瘤細胞系中相對于在相應正常細胞系中的RNA表達。
圖14圖例說明衍生自DNA148380-2827編碼的天然序列人Stra6蛋白的肽片段在大腸桿菌中的表達。
圖15描述人結腸癌細胞中，分別在存在和不存在全反式視黃酸(ATRA)和9-順式-視黃酸(9cRA)的條件下，Stra6 RNA的表達。
圖16是Stra6在腫瘤切片上的原位雜交情況。顯示出證明銀粒(A，C，E，G)的暗視野圖像和對應的蘇木精-伊紅染色的明亮視野圖像(B，D，F，H)。在惡性黑素瘤中，中等密度的銀粒壓在腫瘤細胞上而不壓在血管上(A，B)。在子宮內膜腺癌中，腫瘤上皮被適度地標記上而腫瘤基質呈陰性(C，D)。在Wilm′s腫瘤的發育不全的區域顯示高表達水平，而腫瘤基質呈陰性(E，F)。嗜鉻細胞瘤顯示非常高的Stra6 mRNA表達，而相鄰的正常腎上腺皮質則呈陰性(G，H)。刻度棒＝100微米。
圖1 7(A)對9-順式-RA或全反-RA應答，在C57MG/Parent和C57MG/Wnt-1細胞中Stra6 mRNA表達的誘導。(B)對條件介質中的Wnt-3A和9-順式-RA應答，在C57MG/Parent細胞中Stra6 mRNA表達的誘導。(C)視黃酸處理后，在HCT116和WiDr結腸腺癌細胞中Stra6 mRNA表達的誘導。(D)用視黃酸處理前(上組)和處理后(下組)，經在HCT116細胞原位雜交證明Stra6表達的暗野圖像。(E)視黃酸治療前(-RA)和治療后(+RA)，通過用直接針對人Stra6肽B的單克隆抗體進行的Western印跡，觀察到WiDr細胞中Stra6蛋白的表達。(F)在未用視黃酸處理(左組)或用視黃酸處理(右組)的WiDr細胞中Stra6的膜定位。用抗人Stra6肽B單克隆雜交瘤培養物上清液(克隆12F4.2H9.1D5)進行免疫組織化學檢測。試驗用A-F表示，用視黃酸處理細胞48小時。完成定量PCR反應(每個進行40循環)后得到的Stra6產物示于下面每一圖的A-C中。
圖18(A)Wnt-1誘導RARγ-1表達。在不含四環素0、24、48或72小時的條件下，得自四環素可抑制細胞C57MG/Wnt1細胞的蛋白-等量的全細胞溶解產物，接受SDS-PAGE以及RARγ-1和ERK2的免疫印跡分析。(B)在Wnt-1轉基因小鼠增生的乳腺和乳腺腫瘤中RARγ-1 mRNA的表達。用定量RT-PCR測定mRNA的表達，相對于野生型乳腺中mRNA的表達，數據用表達倍數進行表述。
優選實施方案詳述I.定義術語″PRO10282多肽″、″PRO10282蛋白″、″PRO10282″、″Stra6多肽″、″Stra6蛋白″和″Stra6″互換使用，并涵蓋天然序列PRO10282(Stra6)和PRO10282(Stra6)多肽變體(本文將作進一步定義)。PRO10282(Stra6)多肽可以是從各種來源(如人組織或其它來源)分離得到的，或者是用重組和/或合成方法制得。
″天然序列PRO10282″或″天然序列Stra6″，包括具有與得自天然PRO10282相同的氨基酸序列的多肽。此天然序列PRO10282(Stra6)可以是從自然界分離得到的，或者是用重組和/或合成方法制得的。術語″天然序列PRO10282″或″天然序列Stra6″，特別包括PRO10282的天然截短型或分泌型(例如，細胞外結構域序列)、天然變體型(例如，可替換式剪切型)和天然等位變體。在本發明一實施方案中，天然序列PRO10282是包括圖2(SEQ ID NO2)中1至667氨基酸的成熟或全長天然序列PRO10282。在本發明另一實施方案中，天然序列PRO10282多肽是包括SEQ ID NO5中1至658氨基酸的成熟或全長天然序列PRO19578多肽，后者據信是SEQ ID NO2的天然序列PRO10282的可替換式剪切型。并且，盡管圖2(SEQ ID NO2)和圖7(SEQ ID NO5)公開的PRO10282多肽顯示由本文定義為位置1的蛋氨酸殘基開始，但是圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中氨基酸1位上游或下游的另一蛋氨酸殘基作為PRO10282多肽的起始氨基酸殘基是可以想象到的和可能的。
PRO10282多肽(Stra6)″細胞外結構域″或″ECD″，是指PRO10282多肽基本上不含跨膜和胞質結構域的一種形式。通常，PRO10282多肽ECD具有小于約1％的此類跨膜和/或胞質結構域，優選具有小于約0.5％的此類結構域。應當懂得，所確定的本發明PRO10282多肽的任何跨膜結構域(一個或多個)是依據本領域在鑒定疏水結構域類型中常規使用的標準而確定的。跨膜結構域的精確的邊界會有不同，但在最初確定的結構域的兩末端之一最多不超過約5個氨基酸。因此，在本發明的一實施方案中，人PRO10282多肽的細胞外結構域包括氨基酸1至X；其中X是圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中從氨基酸49到59的任何氨基酸。
″PRO10282變體多肽″或″Stra6變體多肽″，這些術語是可互換使用的，它們指如下定義的與下列氨基酸序列具有至少約80％氨基酸序列同一性的活性PRO10282多肽(Stra6)(a)圖2(SEQ ID NO2)所示PRO10282多肽的1至667殘基或圖7(SEQ ID NO5)所示PRO10282多肽的1至658殘基的氨基酸序列，(b)圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中1至X殘基的氨基酸序列，其中X是圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中氨基酸49至59的任何氨基酸，或者(c)衍生自圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)所示氨基酸序列的另一特定片段。此類PRO1 0282(Stra6)變體多肽包括，例如，在圖2(SEQ ID NO2)或圖(SEQ ID NO5)中所示序列的N-和/或C-末端以及在一個或多個內部結構域內增加或刪減一個或多個氨基酸殘基的PRO10282多肽。通常，PRO10282變體多肽與(a)圖2(SEQ ID NO2)所示PRO10282多肽的1至667殘基的氨基酸序列或圖7(SEQ ID NO5)所示PRO10282多肽的1至658殘基的氨基酸序列，(b)圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中1至X殘基的氨基酸序列，其中X是圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中氨基酸49至59的任何氨基酸，或者(c)衍生自圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)所示氨基酸序列的另一特定片段，具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％或至少約99％的氨基酸序列同一性。PRO10282變體多肽不包括天然PRO10282多肽序列。一般地，PRO10282變體多肽的長度是至少約10個氨基酸，經常是至少約20個氨基酸，更經常是至少約30個氨基酸，更經常是至少約40個氨基酸，更經常是至少約50個氨基酸，更經常是至少約60個氨基酸，或者至少約70個氨基酸，更經常是至少約80個氨基酸，更經常是至少約90個氨基酸，更經常是至少約100個氨基酸，或者至少約150個氨基酸，更經常是至少約200個氨基酸，更經常是至少約250個氨基酸，更經常是至少約300或更多個氨基酸，并且不同于鼠Stra6序列的片段，見Bouillet等，Mechanisms of Development 63，173-186(1997)。
關于本文鑒定的PRO10282(Stra6)多肽序列的″氨基酸序列同一性百分比(％)″，是指候選序列的氨基酸殘基，在進行序列對比并在必要時導入空隙以獲取最大百分比的序列同一性，而不將任何保守取代視為序列同一性時，與PRO10282序列的氨基酸殘基相同的百分數。可使用本領域各種方法進行序列對比以便測定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公眾可得到的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可以決定測量對比的適宜參數，包括針對所比較的序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為此目的，氨基酸序列同一性％值是使用下述序列對比計算機程序ALIGN-2而獲得的，其中ALIGN-2程序的全部源代碼見表4A-Q。ALIGN-2序列對比計算機程序的作者是Genentech，Inc.，表4A-Q所示源代碼和用戶數據一起已經提交地處Washington D.C.，20559的美國版權局，其美國版權注冊登記號為TXU510087。公眾通過Genentech，Inc.，South San Francisco，California可以得到ALIGN-2程序，或者可從表4A-Q提供的源代碼進行編制。ALIGN2程序應當為在UNIX操作系統，優選在數碼UNIX V4.0D使用而進行編制。ALIGN-2程序設定了所有序列對比參數并且不變。
為了本發明目的，給定氨基酸序列A相對于給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者這樣說給定氨基酸序列A具有或含有給定氨基酸序列B相同氨基酸序列的％)如下計算X/Y比值乘以100其中X是用序列對比程序ALIGN-2比較A和B的氨基酸殘基后計算出的相同氨基酸數，其中Y是B的氨基酸殘基總數。可以理解，當氨基酸序列A與氨基酸序列B的長度不相等時，A相對于B的氨基酸序列同一性％將不等于B相對于A的氨基酸序列同一性％。作為計算氨基酸序列同一性％的一個實例，表3A-B說明如何計算指定為″對照蛋白″的氨基酸序列與指定為″PRO″的氨基酸序列的序列同一性％。
除非另外特別聲明，否則本文所用所有氨基酸序列同一性％值是按照上述使用ALIGN-2序列對比計算機程序獲得的。然而，氨基酸序列同一性％也可使用序列對比程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic acids Res.253389-3402(1997))進行測定。NCBI-BLAST2序列對比程序可從http//www.ncbi.nlm.nih.gov下載。NCBI-BLAST2使用數種檢索參數，其中所有這些參數設定為默認值，包括例如，非掩蔽＝是(yes)，鏈(strand)＝全部(all)，預期的出現＝10，最低復雜長度＝15/5，多-程e-值＝0.01，多-程常數＝25，最終缺口化對比的陡降(dropoff)＝25，和評分矩陣＝BLOSUM62。
當使用NCBI-BLAST2進行氨基酸序列比較時，給定氨基酸序列A針對給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者說，給定氨基酸序列A具有或含有與給定氨基酸序列B相同的氨基酸序列的％)如下計算X/Y比值乘以100其中X是用序列對比程序NCBI-BLAST2比較A和B氨基酸殘基后計算出的相同氨基酸數量，其中Y是B的氨基酸殘基總數量。可以理解，當氨基酸序列A與氨基酸序列B的長度不相等時，A針對B的氨基酸序列同一性％將不等于B針對A的氨基酸序列同一性％。
″PRO10282變體多核苷酸″或″PRO10282變體核酸序列″是指編碼下述定義的活性PRO10282多肽的多核苷酸分子，它與(a)編碼圖2(SEQ ID NO2)所示PRO10282多肽的1至667殘基的氨基酸序列的核苷酸序列或編碼圖7(SEQ ID NO5)中1至658殘基的氨基酸序列的核苷酸序列，(b)編碼圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中1至X氨基酸的核苷酸序列，其中X是圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中49至59的任何氨基酸，或者(c)編碼衍生自圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)所示氨基酸序列的另一特定片段的核苷酸序列，具有至少約80％的氨基酸序列同一性。通常，PRO10282變體多核苷酸與(a)編碼圖2(SEQ ID NO2)所示PRO10282多肽的1至667殘基的氨基酸序列的核苷酸序列或編碼圖7(SEQ ID NO5)中1至658殘基的氨基酸序列的核苷酸序列，(b)編碼圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中1至X氨基酸的核苷酸序列，其中X是圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)中49至59的任何氨基酸，或者(c)編碼衍生自圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ ID NO5)所示氨基酸序列的另一特定片段的核苷酸序列，具有至少約80％、優選至少約81％、更優選至少約82％、更優選至少約83％、更優選至少約84％、更優選至少約85％、更優選至少約86％、更優選至少約87％、更優選至少約88％、更優選至少約89％、更優選至少約90％、更優選至少約91％、更優選至少約92％、更優選至少約93％、更優選至少約94％、更優選至少約95％、更優選至少約96％、更優選至少約97％、更優選至少約98％或至少約99％的核酸序列同一性。PRO10282多核苷酸變體不包括天然PRO10282核苷酸序列或天然PRO19578核苷酸序列。
一般地，PRO10282(Stra6)變體多核苷酸的長度是至少約30個核苷酸，經常是至少約60個核苷酸，更經常是至少約90個核苷酸，更經常是至少約120個核苷酸，或者至少約150個核苷酸，更經常是至少約180個核苷酸，更經常是至少約210個核苷酸，更經常是至少約240個核苷酸，或者至少約270個核苷酸，更經常是至少約300個核苷酸，更經常是至少約450個核苷酸，或至少600個核苷酸，或至少900或更多個核苷酸，而且特別排除包含在鼠Stra6核苷酸序列內的多核苷酸，參見Bouillet等，Mechanisms ofDevelopment 63，173-186(1997)所公開的內容。
有關本文鑒定的編碼PRO10282(Stra6)多肽的核酸序列的″核酸序列同一性百分比(％)″，是指候選序列中與編碼PRO10282多肽的核酸序列相比時，具有相同核苷酸的百分數，這是在對比序列，和如果必要則引入空隙，以達到最大序列同一性百分比的前提下獲得的。為測定核苷酸序列同一性百分比而進行的序列對比，可使用本領域各種方法，例如，使用公眾可得到的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可以決定用于測量對比的適宜參數，包括針對所比較序列的全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為此目的，核苷酸序列同一性％值是如下述使用序列對比計算機程序ALIGN-2而獲得的，其中ALIGN-2程序的全部源代碼見表4A-Q。ALIGN-2序列對比計算機程序的作者是Genentech，Inc.，表4A-Q所示源代碼和用戶數據一起已經提交地處Washington D.C.，20559的美國版權局，其美國版權注冊登記號為TXU510087。公眾通過Genentech，Inc.，South San Francisco，Calfornia可以得到ALIGN-2程序，或者從表1提供的源代碼進行編制。ALIGN2程序應當為在UNIX操作系統，優選在數碼UNIX V4.0D使用而進行編制。ALIGN-2程序設定了所有序列對比參數并且不變。
為了本發明目的，給定核酸序列C相對于給定核酸序列D的核酸序列同一性％(或者這樣說給定核酸序列C具有或含有與給定核酸序列D相同的核酸序列的％)如下計算W/Z比值乘以100其中W是用序列對比程序ALIGN-2比較C和D后計算出的相同核苷酸的數量，和其中Z是D的核苷酸總數量。可以理解，當核酸序列C與核酸序列D的長度不相等時，C針對D的核酸序列同一性％將不等于D針對C的核酸序列同一性％。作為計算核酸序列同一性％的一個實例，表3C-D說明如何計算指定為″對照DNA″的核酸序列與指定為″PRO-DNA″的核酸序列的同一性％。
除非另外特別聲明，否則本文所用所有核酸序列同一性％值是按照上述使用ALIGN-2序列對比計算機程序獲得的。然而，核酸序列同一性％也可使用序列對比程序NCBI-BLAST2(Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))進行測定。NCBI-BLAST2序列對比程序可從http//www.ncbi.nlm.nih.gov下載。NCBI-BLAST2使用數種檢索參數，其中所有這些參數設定為默認值，包括例如，非掩蔽＝yes，鏈＝全部，預期的出現＝10，最低復雜長度＝15/5，多-程e-值＝0.01，多-程常數＝25，最終缺口化對比的陡降＝25，和評分矩陣＝BLOSUM62。
當使用NCBI-BLAST2進行序列比較時，給定核酸序列C與給定核酸序列D的核酸序列同一性％(或者說，給定核酸序列C具有或含有與給定核酸序列D相同的核酸序列的％)如下計算W/Z比值乘以100其中W是用序列對比程序NCBI-BLAST2比較C和D后計算出的相同核苷酸數量，和其中Z是D的核苷酸總數量。可以理解，當核酸序列C與核酸序列D的長度不相等時，C針對D的核酸序列同一性％將不等于D針對C的核酸序列同一性％。
在其它實施方案中，PRO10282(Stra6)變體多核苷酸是編碼活性PRO10282多肽的核酸分子，它能夠與編碼圖2(SEQ ID NO2)或圖7(SEQ IDNO5)所示全長PRO10282多肽的核苷酸序列雜交(優選地在嚴格雜交和洗滌條件下雜交)。PRO10282變體多肽可以是由PRO10282變體多核苷酸編碼的那些多肽。
在如上述進行氨基酸序列同一性比較時使用的術語″陽性″，不僅包括所比較的序列中相同的氨基酸殘基，也包括其中具有相似特性的氨基酸殘基。針對目的氨基酸殘基評分為陽性值的氨基酸殘基是那些與目的氨基酸殘基相同或是目的氨基酸殘基的首選取代的氨基酸殘基。(見下表1中定義)。
為了本發明目的，給定氨基酸序列A相對于給定氨基酸序列B的氨基酸序列陽性值％(或者這樣說給定氨基酸序列A具有或含有與給定氨基酸序列B相同的氨基酸序列的陽性％)如下計算X/Y比值乘以100其中X是用上述序列對比程序ALIGN-2比較A和B后得出的如上定義的評分陽性氨基酸數量，其中Y是B的氨基酸殘基總數量。可以理解，當氨基酸序列A與氨基酸序列B的長度不相等時，A針對B的陽性％將不等于B針對A的陽性％。
當用″分離的″來描述本文的各種多肽時，是指已從天然環境的組成中鑒定和分離和/或回收的多肽。優選地，分離的多肽與其天然結合的所有組分沒有任何結合。多肽的天然環境中的污染成分是那些將干擾使用多肽進行診斷和治療的物質，可包括酶、激素和其它蛋白性或非-蛋白性溶質。在優選的實施方案中，多肽被純化為(1)使用轉杯式蛋白測序儀，達到足以獲得N-末端或內部氨基酸序列至少15個殘基的程度，或者(2)達到在非-還原或還原條件下經SDS-PAGE電泳和考馬斯藍或優選銀染色證實為同質性的程度。分離的多肽包括在重組細胞內的原位多肽，因為PRO10282(Stra6)自然環境中的至少一個組分是不存在的。然而，通常用至少一個純化步驟來制備分離的多肽。
編碼PRO10282(Stra6)多肽的″分離的″核酸分子，是從PRO10282編碼核酸的天然來源中通常與其結合的至少一種雜質核酸分子中鑒定并分離的核酸分子。優選地，所述分離的核酸與其天然結合的所有組分沒有任何結合。一分離的編碼PRO10282的核酸分子不同于其天然形式或組合(setting)。因此，分離的編碼PRO10282的核酸分子區別于其在天然細胞中的存在形式。但是，編碼PRO10282(Stra6)多肽的分離的核酸分子，包括通常表達PRO10282的細胞中所含的PRO10282-編碼核酸分子，例如，所述核酸分子與天然細胞中相應核酸分子所在的染色體位置不同。
術語“控制序列”，指在特定宿主生物中使可操作連接的編碼序列表達所需的DNA序列。適于原核生物的調控序列可包括如啟動子，任選操縱子序列，和核糖體結合位點。已知真核生物細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號和增強子。
當一種核酸與另一種核酸序列處于功能相關的位置時，該核酸與該另一種核酸“可操作相連”。例如如果一種多肽表達為參與該多肽的分泌的前體蛋白，則將前序列或分泌前導序列的DNA與該多肽的DNA可操作相連；啟動子或增強子當能影響編碼序列的轉錄時可與該編碼序列可操作相連；或核糖體結合位點當其位置能促進翻譯時可與編碼序列可操作相連。通常“可操作相連”指被連接的DNA序列是相鄰的，而且，如果是分泌前導序列，則相鄰且為閱讀狀態。然而，增強子不必是相鄰的。連接可通過在方便的限制性位點相連而實現。如果不存在這樣的位點，可根據常規實踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
本文所用術語″抗體″是指最廣義上的抗體，并特別包括例如單鏈抗-PRO10282單克隆抗體(包括激動劑、拮抗劑和中和抗體)、具有多表位特異性的抗-PRO10282抗體組合物、單鏈抗-PRO10282抗體和抗-PRO10282抗體的片段(見下述)。本文中術語″單克隆抗體″，是指來自基本上同質的抗體群的抗體，即除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個抗體均相同。
雜交反應的″嚴格度″由本領域技術人員很容易地確定，通常根據經驗在考慮探針長度、洗滌溫度和鹽濃度的基礎上計算得出。一般而言，長的探針需要較高的溫度以便正確退火，而短的探針需要較低溫度。雜交通常取決于變性的DNA在低于解鏈溫度的環境中存在互補序列時的重退火能力。探針和雜交序列之間所需同源程度越高，則可使用的相對溫度越高。結果是，相對溫度較高將使反應條件趨于更加嚴格，而較低溫度則使反應的嚴謹度較小。有關雜交反應的嚴格度的其它細節和解釋，見Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biologv，Wiley Interscience Publishers，(1995)。
本文的″嚴格條件″或″高度嚴格條件″，可以定義為(1)使用低離子強度和高溫洗滌，例如，50℃0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交過程中42℃使用變性劑如甲酰胺，譬如，含0.1％牛血清白蛋白的50％(v/v)甲酰胺/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉；或者(3)42℃使用50％甲酰胺、5xSSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5xDenhardt′s溶液、超聲處理的鮭精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，于42℃在0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中和于55℃在50％甲酰胺中洗滌，接著于55℃用含EDTA的0.1xSSC進行高度嚴格洗滌。
″中等嚴格條件″可以按照Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual，New YorkCold Spring Harbor Press，1989的定義，包括使用嚴格度低于前述的洗滌溶液和雜交條件(例如，溫度，離子強度和SDS％)。中等嚴格條件的一個實例是，于37℃在如下組成的溶液中過夜溫育20％甲酰胺，5xSSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5xDenhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml變性剪切的鮭精DNA，接著于37-50℃在1xSSC中洗滌雜交膜。本領域熟練技術人員懂得如何必要地調整溫度、離子強度等條件以適應諸如探針長度等因素。
本文使用的術語″表位標簽″，是指含有與″標簽多肽″融合了的PRO10282多肽的嵌合多肽。該標記多肽具有足夠多的殘基以提供針對所制備抗體的表位，而且要足夠短以便它不干預與其融合的多肽的活性。標記多肽也優選確實是獨一無二的，以便該抗體與其它表位基本上不發生交叉反應。通常，適宜的標記多肽至少有6個氨基酸殘基，一般為約8～50個氨基酸殘基(優選為約10～20個氨基酸殘基)。
本文所用術語″抗體″是指最廣義上的抗體，并特別包括例如單鏈抗-PRO10282(抗-Stra6)單克隆抗體(包括激動劑、拮抗劑和中和抗體)、具有多表位特異性的抗-PRO10282抗體組合物、單鏈抗-PRO10282抗體和抗-PRO10282抗體的片段(見下述)。
本文中術語″單克隆抗體″，是指來自基本上同質的抗體群的抗體，即除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個抗體均相同。
″抗體片段″包含完整抗體的一部分，優選是完整抗體的抗原結合或可變區。抗體片段的實例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；二價抗體；線形抗體(Zapata等，Protein Eng.8(10)1057-1062)；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異抗體。
木瓜蛋白酶消化抗體可產生兩個相同的各帶有單個抗原結合位點的抗原結合片段(稱為“Fab”片段)和殘余的“Fc”片段，Fc段的名稱反應了其易于結晶的能力。經胃蛋白酶處理可產生具有兩個抗原結合位點并仍然能交聯抗原的F(ab’)2片段。
“Fv”是含有完整的識別和結合位點的最小抗體片段。此區由一個重鏈可變區與一個輕鏈可變區緊密地非共價連接形成的二聚體組成。在這個構象中每個可變區的三個CDR相互作用，在VH-VL二聚體表面限定一個抗原結合位點。這六個CDR共同賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使是單個可變區(或Fv的一半僅含有三個抗原特異性CDR)也具有識別和結合抗原的能力，盡管其比完整的結合位點具有較低的親和力。
Fab段還包括輕鏈恒定區和重鏈的第一個恒定區(CH1)。Fab’與Fab的差別在于Fab在重鏈CH1的羧基末端多出幾個殘基，其包括抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是指恒定區半胱氨酸殘基中至少有一個游離巰基的Fab’。F(ab’)2抗體片段在最初產生為Fab’片段對，在它們之間具有鉸鏈區半胱氨酸。抗體片段的其它化學偶聯是眾所周知的。
脊椎動物任何物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”，可依據其恒定區氨基酸序列而歸為完全不同的兩型(稱為k和λ)中的一型。
根據其重鏈恒定區的氨基酸序列，可將免疫球蛋白分為不同類。主要有5類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分成“亞類”(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應于不同類抗體的重鏈恒定區，分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結構和三維構象是眾所周知的。
術語“二價抗體”是指具有兩個抗原結合位點的小分子抗體片段，這些片段在一條多肽鏈(VH-VL)上含有相連的一個重鏈可變區(VH)和一個輕鏈可變區(VL)。利用一種非常短的接頭，其使得同一條鏈上的兩個結構域無法配對，不得不與另一條鏈上的互補結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。例如，在EP404，097；WO93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，906444-6448(1993)中有對二價抗體的更詳細描述。
“分離的”抗體是已從其天然環境的組成中鑒定、分離和/或回收的抗體。其天然環境的污染成分是干擾抗體的診斷或治療應用的物質，可包括酶、激素和其它蛋白性或非蛋白性溶質。在優選的實施方案中，該抗體的純度應達到(1)經Lowery法確定的抗體重量的95％以上，最優選所述重量的99％以上，(2)足以獲得用旋轉杯狀(spinning cup)序列分析儀所測至少15個殘基的N端或內部氨基酸序列，(3)通過還原或非還原條件下的SDS-PAGE以及考馬斯亮藍染色、優選銀染色所證實的同質性。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為該抗體的自然環境中的至少一種組分已不存在。然而，一般情況下分離的抗體可通過至少一個純化步驟來制備。
術語“可變”是指可變區某些部分的序列在抗體之間有很大差異，它們可在各個抗體對其特定抗原的結合和特異性方面發揮作用。然而，該變異性不是均勻的分布于整個抗體的可變區。它集中于輕鏈和重鏈可變區中三個稱為“互補決定區”(CDR)或超變區的節段中。可變區中保守性較高的區域稱為框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區各包括4個FR區，主要采取β-片層構象，由形成環狀連接的三個CDR相連接，而在某些情況下可形成部分β片層結構。每條鏈的CDR通過FR區緊密的靠近在一起，并且與其它鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位點(見Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，第I卷，第647-669頁(1991))。恒定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是表現出各種效應功能，例如參與抗體的抗體依賴性細胞毒性作用。
術語“超變區”在本文中是指抗體上負責結合抗原的氨基酸殘基。所述超變區通常包括“互補決定區”或“CDR”的氨基酸殘基(即輕鏈可變區的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))和/或那些“超變環”的氨基酸殘基(即輕鏈可變區的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987))。“框架區”或“FR”殘基是那些除了本文所定義的超變區殘基以外的可變區殘基。
“人源化”型非人(例如鼠)抗體是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab’、F(ab)’2或抗體的其它抗原結合亞序列)，它們包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中受者互補決定區(CDR)殘基被具有所需特異性、親和力和性能的小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類等非人源物種抗體(供體抗體)的CDR殘基所取代。在一些實例中，人免疫球蛋白的Fv FR殘基由相應的非人類殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在受者抗體或供體CDR或框架序列中均不存在的殘基。這些修飾旨在進一步改善和最大化抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(通常包括兩個)可變區的全部，其中CDR區的全部或基本上全部對應于非人免疫球蛋白的相應部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗體還任選包括免疫球蛋白恒定區(Fc)，通常為人免疫球蛋白的恒定區的至少一部分。詳見Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332323-329 (1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。任選地，人源化抗體也包括PRIMATIZEDTM抗體，所述抗體的抗原結合區可從用目標抗原免疫接種獼猴制得的抗體中衍生獲得。
本文中所用術語“免疫粘附素”定義為抗體樣分子，其將異源蛋白(一種“粘附素”)的結合特異性與免疫球蛋白恒定區的效應器功能組合。結構上，免疫粘附素包括具有所需結合特異性之氨基酸序列與免疫球蛋白恒定區序列的融合，所述氨基酸序列不同于抗體的抗原識別和結合位點(即為“異源性”)。免疫粘附分子的粘附素部分通常是至少包括一個受體或一個配體的結合位點的鄰接氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區序列，可以得自任何免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亞型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
本文中″活性″是指保留完整或天然PRO10282的生物學和/或免疫學活性的PRO10282形式，其中″生物學″活性指完整或天然PRO10282引起的生物學功能(抑制或興奮)，并且不包括誘導產生針對完整或天然PRO10282所擁有的表位的抗體的能力；而″免疫學″活性則是指誘導產生針對完整或天然PRO10282所攜表位的抗體的能力。優選的生物活性包括例如下述任何一種或多種活性應答視黃酸而在生長、發育或分化中的作用。基于與Stra6(一種應答視黃酸而誘導的小鼠蛋白)的密切相似性，本文公開的PRO10282多肽，可能在例如早期的背腹側四肢結構模式和后期的軟骨內成骨中起著重要的作用。另一生物學活性涉及在腫瘤發展和生長中的作用。
本文所用″免疫學活性″，優選是″免疫交叉-反應性，″是指候選多肽能夠與用已知活性PRO10282(Stra6)多肽制備(raised)的多克隆抗血清競爭性抑制具有此活性的PRO10282(Stra6)多肽的定性生物學活性。以常規方式制備此類抗血清，例如給山羊或兔子皮下注射在完全Freund′s佐劑中的已知活性類似物，接著經腹膜內或皮下注射在不完全Freund′s佐劑中的已知活性類似物以加強。免疫交叉反應性優選是″特異的″，這意味著所鑒定的免疫交叉-反應分子(例如抗體)與相應Stra6多肽的結合親和力顯著高于(優選高至少約2-倍，更優選至少約4-倍，更加優選至少約8倍，最優選高至少約10-倍)其與任何其它已知天然多肽的結合親和力。
本文中術語″拮抗劑″，使用其廣義含義，包括部分或完全阻斷、抑制或中和本文所述天然PRO10282多肽生物活性的任何分子。類似地，術語″激動劑″也使用其廣義含義，包括模擬本文所述天然PRO10282多肽生物活性的任何分子。適宜的激動劑或拮抗劑分子特別包括激動劑或拮抗劑抗體或抗體片段、天然PRO10282多肽的片段或氨基酸序列變體、肽、小的有機分子等。鑒定PRO10282多肽的激動劑或拮抗劑的方法可以是，使PRO10282多肽與待測激動劑或拮抗劑分子接觸，并測定正常情況下與PRO10282多肽有關的一個或多個生物活性的可測得變化。
本文中″腫瘤″是指所有贅生細胞生長和增殖(無論是惡性還是良性腫瘤)，和所有癌前和癌性細胞及組織。
術語″癌″和″癌性的″指或描述哺乳動物中通常以無控細胞生長為特征的生理狀況。癌的實例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌的更具體的實例包括乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、 鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非-小細胞肺癌、胃腸癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝臟癌和各種類型頭頸部癌。
″治療″，既指治療性治療也指預防性措施，其目的是阻止或延緩(減輕)所針對的病理性病癥。那些需要治療的個體包括，已經患有病癥或有患病傾向或者為了預防患上病癥的個體。在腫瘤(例如癌)治療中，治療劑可直接減少腫瘤細胞的病狀，或使得腫瘤細胞對其它治療劑的治療(例如，放療和/和化療)更為敏感。
癌的″病理學″包括危害患者健康的所有現象。包括但不限于異常或失去控制的細胞生長、轉移、干擾毗鄰細胞的正常功能、異常水平釋放細胞因子或其它分泌產物、抑制或加重炎癥或免疫應答等。
″慢性″給藥，指與快速給藥模式相反，將試劑以連續給藥模式施用，以便在長時間內保持初始治療效果(活性)。″間斷″給藥是指治療不是沒有間歇地連續進行，而是以周期性為特征。
意欲治療的″哺乳動物″是指歸為哺乳動物的任何動物，包括人、家畜和農場動物，以及動物園里的動物、參與運動項目的動物或寵物如狗、貓、牛、綿羊、豬、山羊、兔、馬等。優選所述哺乳動物為人類。
與一種或多種其它治療劑″聯合″給藥，包括同時(并行)和以任何順序聯貫給藥。
本文所用″載體″包括在所用劑量和濃度下對細胞或哺乳動物無毒性的可藥用載體、賦形劑、穩定劑。可藥用載體常常是含水的pH緩沖的溶液。可藥用載體的實例包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于10個殘基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成鹽離子如鈉；和/或非離子表面活性劑如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
本文中所用″標記″一詞，是指直接或間接地與抗體偶聯從而產生″標記″抗體的可檢測的化合物或組分。標記可以是其本身可被測得(例如放射性同位素標記或熒光標記)，或者如果是酶標記時，可催化底物化合物或組分發生化學變化，這種變化是可檢測的。
“固相”是指本發明抗體可粘附的非水性基質。本文中固相的實例包括部分或全部由玻璃(如控制孔徑的玻璃)、多糖(如瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅氧烷制成的那些固相。在某些實例中，根據上下文的內容，固相可包括測試板的孔；在其它的例子中，它可以是純化柱(如親和層析柱)。該術語也包括美國專利4275149中公開的分散顆粒的不連續固相。
“脂質體”是由能向哺乳動物有效運送藥物(如本文公開的PRO10282多肽和/或其抗體)的各類脂質、磷脂和/或表面活性劑組成的小分子囊泡。脂質體的組分通常排列為雙層形式，與生物膜的脂質排列相似。
本文中″小分子″定義為分子量低于約500道爾頓的分子。
短語″基因擴增″和″基因復制″可交替使用，它們是指使多拷貝基因或基因片段在具體細胞或細胞系內形成的過程。重復的區域(擴增DNA的延伸)一般常指″擴增子″。通常，信使RNA(mRNA)的產生量，即基因表達水平，也與表達的具體基因所產生的拷貝數量成比例增加。
本文所用術語“細胞毒性劑”，是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質。該術語意在包括放射性同位素(例如I131、I125、Y90和Re186)，化療劑，毒素如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段。
″化療劑″是治療癌有效的化合物。化療劑的實例包括阿霉素，阿霉素(doxorubicin)，表阿霉素(epirubicin)，5-氟尿嘧啶，胞嘧啶阿拉伯糖苷(arabinoside)(″Ara-C″)，環磷酰胺，噻替派，白消安，細胞毒素(cytoxin)，紫杉烷例如紫杉醇(Taxol，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和泰索帝(doxetaxel)(泰索帝(Taxotere)，Rhne Poulenc Rorer，Antony，Rnace)，toxotere，甲氨蝶呤，順鉑，苯丙氨酸氮芥，長春花堿，博萊霉素，依托泊苷，異環磷酰胺，絲裂霉素C，米托蒽醌，長春新堿，長春瑞賓，卡鉑，替尼泊苷，道諾霉素，洋紅霉素，氨基蝶呤，放線菌素D，絲裂霉素，esperamicins(見美國專利4,675,187)，5-FU，6-硫代鳥嘌呤，6-巰基嘌呤，放線菌素D，VP-16，苯丁酸氮芥，苯丙氨酸氮芥及其它有關的氮芥子。對腫瘤起調節或抑制激素作用的激素制劑如他莫昔芬和奧那司酮也包括在此定義中。
本文所用″生長抑制劑″，是指抑制細胞生長的化合物或組合物，特別是抑制過度表達本文鑒定的任一種基因的癌細胞，無論是在體內還是在體外。因此，生長抑制劑是顯著降低過度表達此基因的S期細胞百分比的化合物或組合物。生長抑制劑的實例包括阻斷細胞周期進程的試劑(在S期之外的環節)，譬如，誘導G1期和M-期停滯的試劑。傳統的M-期阻斷劑包括長春花堿(長春新堿和長春堿)、紫杉酚和拓撲酶II抑制劑如阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、依托泊苷和博萊霉素。那些使G1期停滯的試劑也使S-期停滯，例如，DNA烷化劑如他莫昔芬、潑尼松、達卡巴嗪、氮芥、順鉑、氨基蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞嘧啶-C。進一步的信息可在下列文獻中找到TheMolecular Basis of Cancer，Mendelsohn和Israel，eds.，Chapter 1，entitled″Cellcycle regulation，oncogens，和antineoplastic drugs″by Murakami等(WBSaundersPhiladelphia，1995)，特別是第13頁。
″阿霉素″是蒽環霉素類抗生素。阿霉素的化學全名為(8S-順式)-10-[(3-氨基-2，3，6-三去氧-α-L-來蘇-吡喃糖苷)]-7，8，9，1O-四氫-6，8，11-三羥-8-(羥乙酰)-甲氧基-5，1 2-naphthacenedion。
術語″細胞因子″是一般性術語，指由一個細胞群釋放的作用于另一個細胞群起細胞間調節子作用的蛋白。這些細胞因子的實例是淋巴因子、單核因子和傳統的多肽類激素。細胞因子包括生長激素，如人生長激素，N-甲二磺酰人生長激素和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；前胰島素；松馳素；前松馳素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲狀腺刺激素(TSH)，促黃體(生成)激素(LH)；肝細胞生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳激素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和β；繆氏抑制物質(mullerian-inhibitingsubstance)；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮細胞生長因子；整聯蛋白；血小板生成素(TPO)；神經生長因子如NGF-β；血小板生長因子；轉化生長因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子(osteoinductive factors)；干擾素如干擾素-α，-β，-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；粒細胞-CSF(G-CSF)；白細胞介素(IL)如IL-1，IL-1α，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-11，IL-12；腫瘤壞死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和kit配體(KL)。本文中術語細胞因子包括天然蛋白或來自重組細胞培養物的蛋白以及天然序列細胞因子的生物活性等效物。
本申請所用術語″前體藥物″，是指藥物活性物質的前體或衍生物形式，其相對于親本藥物對腫瘤細胞的細胞毒作用較小且可酶促活化或被轉換成更具活性的親本形式。例見Wilman，″Prodrugs in Cancer Chemotherapy″，Biochemical Society Transactions，14375-382，615th Meeting，Belfast(1986)，和Stella等，″ProdrugsA Chemical Approach to Targeted Drug Delivery″，Directed Drug Delivery Borchardt等，(ed.)，pp.147-267，Humana press(1985)。本發明的前體藥物包括但不限于含有磷酸鹽的前體藥物，含有硫代磷酸鹽的前體藥物，含有硫酸鹽的前體藥物，含有肽的前體藥物，D-氨基酸修飾的前體藥物，糖基化的前體藥物，含有β-內酰胺的前體藥物，任選含有取代的苯氧乙酰胺的前體藥物或任選含有取代的苯基乙酰胺的前體藥物，5-氟胞嘧啶和可轉化為更具細胞毒活性的游離藥物的其它5-氟尿嘧啶前體藥物。可衍生為本發明所用前體藥物形式的細胞毒藥物，包括但不限于上述化療藥物。
本文公開的多肽、其激動劑和/或拮抗劑對于抑制贅生細胞生長、腫瘤生長或癌細胞生長的″有效量″，是指能夠將靶細胞生長抑制到一定程度的量。該術語包括可引發對靶細胞的生長抑制、細胞靜息和/或細胞毒性作用和/或編程性細胞死亡的量。
而PRO10282(包括PRO19578)多肽或其拮抗劑，用于抑制贅生細胞生長、腫瘤細胞或癌細胞生長目的時的″有效量″，可以完全根據經驗和以常規方式予以確定。
有關治療腫瘤的″治療有效量″，是指能夠達到下列一種或多種效果的量(1)將腫瘤生長抑制到一定程度，包括減緩生長和完全阻止生長；(2)減少腫瘤細胞數量；(3)縮小腫瘤尺寸；(4)抑制(即減少、減緩或完全阻止)腫瘤細胞浸潤周邊器官；(5)抑制(即減少、減緩或完全阻止)轉移；(6)提高抗-腫瘤免疫應答，這可能但并非必須導致腫瘤消退或者排斥(rejection)；和/或(7)與病癥有關的一種或多種癥狀緩解到一定程度。用于治療腫瘤為目的的PRO10282多肽拮抗劑的″治療有效量″，可根據經驗和按常規方式予以確定。
PRO10282拮抗劑的″生長抑制量″，是能夠抑制細胞尤其是腫瘤細胞(例如癌細胞)在體內或體外生長的量。用于抑制贅生細胞生長目的的PRO10282拮抗劑的″細胞毒性量″，可根據經驗并以常規方式予以確定。
PRO10282拮抗劑的″細胞毒性量″，是能夠引起體內或體外細胞尤其是腫瘤細胞(例如癌細胞)破壞的量。用于抑制贅生細胞生長的PRO10282拮抗劑的″細胞毒性量″，可根據經驗和以常規方式予以確定。
″反義寡脫氧核苷酸″或″反義寡核苷酸″(術語之間可互用)，定義為可以按照序列-特異性方式抑制靶基因進行轉錄和/或翻譯的核酸分子。術語″反義″是指核酸與靶基因的編碼(″正義″)遺傳序列互補的事實。反義寡核苷酸與新生的mRNA通過Watson-Crick堿基配對而反向平行雜交。通過與靶mRNA模板結合，反義寡核苷酸阻斷mRNA模板所編碼蛋白質的成功轉錄。術語特別包括稱為″核酶(ribozomes)″的反義因子，已經證明所述核酶通過加入具有天然自-剪切活性的序列而誘導靶RNA催化裂解(Warzocha和Wotowiec，″Antisense strategy″biological utility and prospects in the treatment ofhematological malignancies.″Leuk.Lymphom 24267-28 1)。
II.本發明組合物和方法A.全長天然序列人PRO10282和PRO19578(Stra6)多肽本發明提供編碼本申請分別稱為天然序列人PRO10282(或者也稱為UNQ3126)和PRO19578多肽的新鑒定和分離的核苷酸序列。更具體而言，如下面的實施例進一步詳細公開的那樣，已經鑒定和分離出編碼天然人PRO10282和PRO19578多肽的cDNA。應注意到在不同表達循環中產生的蛋白可能具有不同的PRO數，但是，任何特定DNA和其編碼的蛋白的UNQ數是獨一無二的，而且將不會變化。然而，為了簡明起見，在本說明書中將DNA148380-2827編碼的蛋白以及前述定義的PRO10282的所有其它天然同系物和變體均稱為″PRO10282″，而不論其來源或制備模式如何。而″PRO10282″的天然變體-由DNA148389-2827-1編碼的多肽，則特別稱之為″PRO19578″。
如下面的實施例所公開的那樣，本文的DNA148380-2827和DNA148389-2827-1 cDNA克隆已經在ATCC保藏。該克隆的實際核苷酸序列，可由本領域熟練技術人員使用本領域常規方法通過對保藏克隆進行序列分析而很容易地測得。使用本領域常規技術可以預測該核苷酸序列編碼的氨基酸序列。關于本文所述天然人PRO10282和PR1O9578多肽以及本文所述其編碼核酸，申請人已經確定此時在閱讀框上什么是與現有序列信息最一致的。
使用上述ALIGN-2序列對比計算機程序，業已發現全長天然PRO10282序列(見圖2和SEQ ID NO2)與Stra6(應答視黃酸中誘導的小鼠蛋白(AFO62476))具有一定的氨基酸序列同一性。因此，目前據信本申請公開的PRO10282多肽是Stra6蛋白家族的新鑒定的成員，而且可能具有該蛋白家族通常具有的一種或多種生物學和/或免疫學活性或者特性。目前，據信PRO19578是天然全長人PRO10282的其它剪切變體，它在天然人PRO10282氨基酸序列的89-97位缺失9個氨基酸(SPVDFLAGD)，并且在518位處由Ile(I))替代了Met(M)，所述518位與PRO10282的527位相對應。這表明Stra6可以是多形態的。
B.PRO10282 (Stra6)變體本文公開了兩種具體天然序列人Stra6多肽(天然序列人PRO10282和PRO19578)。如上所述，據信PRO19578是天然序列人PRO10282的其它剪切型天然變體，因而是一種″PRO10282變體″。除了本文描述的全長天然序列PRO10282和PRO19578多肽外，也考慮了制備PRO10282和PRO19578變體。通過在PRO10282或PRO19578 DNA中引入適當的核苷酸改變，和/或通過合成所需PRO10282變體多肽，可以制備PRO10282和PRO19578變體。本領域技術人員懂得，氨基酸變化將會改變PRO10282或PRO19578的翻譯后加工，例如改變糖基化位點的數量和位置或者改變膜錨著特性。
使用例如在美國專利5364934號中闡述的保守和非-保守突變的任一技術和指導路線，可以在天然全長序列PRO10282、PRO19578或者在本文所述PRO10282或PRO19578的各種結構域中制造變化。變化可以是編碼PRO10282或PRO19578的一個或多個密碼子的取代、缺失或插入，其導致相對于天然序列PRO10282或PRO19578的PRO10282或PRO19578氨基酸序列變化。任選地，變化是PRO10282或PRO19578的一個或多個結構域中的至少一個氨基酸被任何其它氨基酸取代。將PRO10282或PRO19578序列與已知同源蛋白分子進行比較，并使高度同源區氨基酸序列數量變化最小，可以建立決定哪個氨基酸殘基可以被插入、取代或缺失而對所需活性無負面影響的指導原則。氨基酸取代可以是一個氨基酸被另一個具有類似結構和/或類似化學特性的氨基酸代替的結果，如絲氨酸置換亮氨酸，即保守氨基酸置換。插入或缺失可任選地在約1～5個氨基酸的范圍內。通過系統地在序列中進行氨基酸插入、缺失或取代并檢測所得變體顯示全長或成熟天然序列的活性的情況，可以確定能允許的變化。
本文提供PRO10282多肽片段。該類片段可以是，例如，與全長天然蛋白相比，在N-末端或C-末端截短的或者是缺乏內部殘基的片段。某些片段缺乏那些對于PRO10282或PRO19578多肽的預期生物活性非必要的氨基酸殘基。
PRO10282或PRO19578片段可以按照大量常規技術中的任何一個來制備。可以化學合成所需肽片段。另一方法涉及通過酶消化產生PRO10282或PRO19578片段，例如，用已知在特定氨基酸殘基所限定的位點裂解蛋白的酶處理蛋白，或用適宜的限制性內切酶消化DNA并分離所需片段。另一適宜的技術包括分離并用聚合酶鏈反應(PCR)擴增編碼所需多肽片段的DNA片段。將限定DNA片段所需末端的寡核苷酸用作PCR的5′和3′端引物。優選地，PRO10282或PRO19578多肽片段具有圖2(SEQ ID NO2)所示天然PRO10282或PRO19578多肽的至少一種生物學和/或免疫學活性。
在特定實施方案中，目標保守取代冠以優選取代的名稱示于下表1中。如果這類取代導致生物活性變化，則可引入起更多實質性改變并篩選產物，所述改變在表1中命名為示范性取代，或者如下文有關氨基酸種類的詳述。
表1原始殘基示范性取代 優選取代Ala(A) val；leu；ile valArg(R) lys；gln；asn lysAsn(N) gln；his；lys；argglnAsp(D) glu gluCys(C) ser serGln(Q) asn asnGlu(E) asp aspGly(G) pro；ala alaHis(H) asn；gln；lys；argargIle(I) leu；val；met；ala；phe；norleucineleuLeu(L) norleucine；ile；val；met；ala；phe ileLys(K) arg；gln；asn argMet(M) leu；phe；ile leu
Phe(F)leu；val；ile；ala；tyrleuPro(P)alaalaSer(S)thrthrThr(T)serserTrp(W)tyr；phe tyrTyr(Y)trp；phe；thr；ser pheVal(V)ile；leu；met；phe；ala；norleucineleu對PRO10282多肽的功能和免疫學特性的實質性修改可通過選擇性取代來完成，所述取代的效應在維持(a)取代區多肽骨架的結構，例如片層結構或螺旋構象，(b)該分子靶位點的電荷或疏水性，(c)側鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據共有的側鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水性cys，ser，thr；(3)酸性asp，glu；(4)堿性asn，gln，his，lys，arg；(5)影響鏈取向的殘基gly，pro；和(6)芳香族trp，tyr，phe。
非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。也可將這種取代的殘基引入到保守取代位點，或者更優選地引入其余(非-保守)位點。
可以使用本領域已知方法如寡核苷酸-介導的(定點)誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變技術來產生變異。可以對克隆的DNA進行定點誘變[Carter等，Nucl.Acids Res.，134331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.，106487(1987)]、盒式誘變[Wells等，Gene，34315(1985)]、限制選擇誘變[Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317415(1986)]或其它已知技術以產生PRO10282變體DNA。
掃描氨基酸分析也可沿鄰接序列確定一個或多個氨基酸。優選的掃描氨基酸是相對小的中性氨基酸。此類氨基酸包括丙氨酸，甘氨酸、絲氨酸和半胱氨酸。通常，丙氨酸是此組中優選的掃描氨基酸，因為它的β-碳上無側鏈并且不太可能改變變體的主鏈構象[Cunningham和Wells，Science，2441081-1085(1989)]。優選丙氨酸的另一原因是因為它是最常用氨基酸。而且，它常常既出現在掩蔽位置也出現在暴露位置[Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，1501(1976)]。如果丙氨酸取代不能產生足夠量的變體，則可使用同配氨基酸。
C.天然PRO10282(Stra6)和變體PRO10282(Stra6)的修飾本發明包括PRO1028和PRO10282變體(包括PRO19578)的共價修飾。一種共價修飾包括使PRO10282多肽的靶氨基酸殘基和能夠與PRO10282的選定側鏈或N-或C-末端殘基發生反應的有機衍生化劑進行反應。具有雙官能劑的衍生化是非常有用的，例如，PRO10282與純化抗-PRO10282抗體方法中所用的非水溶性載體基質或表面交聯，反之亦然。通常使用的交聯劑包括例如，1，1-雙(二偶氮乙酰基)-2-苯乙烷，戊二醛，N-羥琥珀酰亞胺酯如與4-疊氮基水楊酸的酯，高雙官能亞胺基酯，包括二琥珀酰亞胺酯如3，3′-連二硫酸雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)、雙官能馬來酰亞胺酯如雙-N-馬來酰亞胺-1，8-辛酯和化學試劑如甲基-3-[(對-疊氮苯基)二硫]丙炔亞胺酯。
其它修飾包括谷氨酰胺和天冬酰殘基分別成為相應的谷氨酰和門冬氨酰殘基的脫酰胺，脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨酰或蘇氨酰殘基的羥基磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的α-氨基甲基化[T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983)]，胺的N-末端乙酰化，和任何C-末端羧基的酰胺化。
本發明還包括PRO10282多肽的另一類共價修飾，所述共價修飾包括改變多肽的天然糖基化模式。天然序列PRO10282和PRO19578多肽含有位于其氨基酸序列8-12位的N-連接的糖基化位點。″改變天然糖基化模式″，在這里的目的是為了刪除天然序列PRO10282或PRO19578中一個或多個碳水化合物部分(通過除去發生糖基化的位點或者通過化學和/或酶手段而刪除糖基化)，和/或在天然序列PRO10282或PRO19578中加入一個或多個本不存在的糖基化位點。此外，該短語包括天然蛋白糖基化的性質變化，包括不同碳水化合物部分在性質和比例上的變化。
通過改變氨基酸序列可以實現在天然或變體PRO10282多肽中加入糖基化位點。此變更可以例如，通過向天然序列PRO10282中加入、或者取代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基(針對O-連接的糖基化位點)而完成。任選地，可以通過DNA水平的變化，特別是通過使編碼PRO10282多肽的DNA中預先選定的堿基發生突變從而產生將會翻譯成期望氨基酸的密碼子，來改變PRO10282氨基酸序列。
在PRO10282多肽上增加碳水化合物部分數量的另一方法是，將糖苷與多肽化學性或酶性地偶聯。現有技術有此類方法的描述，例如1987年9月11日公布的WO87/05330，以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.第259-306頁(1981)。
用化學或酶方法，或者通過突變性取代編碼作為糖基化靶點的氨基酸殘基的密碼子，來實現去除PRO10282多肽中的碳水化合物部分。化學性去糖基化技術為本領域所公知，并描述在例如下述文獻中Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.，25952(1987)和Edge等，Anal.Biochem.，118131(1981)。使用Thotakura等在Meth.Enzvmol.，138350(1987)中描述的各種內-和外-糖苷酶，可以完成多肽中碳水化合物部分的酶裂解。
PRO10282的另一類共價修飾，包括以美國專利4640835、4496689、4301144、4670417、4791192或4179337中所述方式，將PRO10282多肽與各種非蛋白類聚合物之一連接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙烯二醇或聚氧化亞烷基。
本發明PRO10282多肽也可被修飾成嵌合分子，包括將PRO10282與另一異源多肽或氨基酸序列融合。
在一實施方案中，嵌合分子含有PRO10282與標記多肽的融合體，其中的標記多肽具有抗-標記抗體可選擇性結合的表位。表位標記一般位于PRO10282的氨基-或羧基-末端。使用抗標記多肽的抗體，可以檢測到此類表位-標記型PRO10282的存在。另外，表位標記的提供，使得利用抗-標記抗體或另一類與表位標記結合的親和基質來親和純化PRO10282變得非常容易。各種標記多肽及其各自抗體是本領域眾所周知的。實例包括聚-組氨酸(poly-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標記；flu HA標記多肽及其抗體12CA5[Field等，Mol.Cell.Biol.，82159-2165(1988)]；c-myc標記和它的8F9、3C7、6E10、G4、B7及9E10抗體[Evan等，Molecular and Cellular Biology，53610-3616(1985)]；和單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標記及其抗體[Paborsky等，Protein Engineering，3(6)547-553(1990)]。其它標記多肽包括Flag-肽[Hopp等，BioTechnology，61204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science，255192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.，26615163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白肽標記[Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876393-6397(1990)]。
在另一實施方案中，嵌合分子可包括PRO10282與免疫球蛋白或免疫球蛋白特定區域的融合。對于二價形式的嵌合分子(也指″免疫粘附素″)，融合可以是與IgG分子Fc區的融合。Ig融合優選包括PRO10282多肽的可溶形式(跨膜結構域缺失或失活)取代Ig分子內至少一個可變區。在一特別優選的實施方案中，免疫球蛋白融合包括IgG1分子的鉸鏈區、CH2和CH3區，或鉸鏈區、CH1、CH2和CH3區。免疫球蛋白融合體的制備也參見1995年6月27日發布的美國專利5428130。
D.天然或變體PRO10282(Stra6)多肽的制備下面的描述主要涉及通過培養轉化或轉染了含PRO10282核酸的載體的細胞來制備天然序列PRO10282(Stra6)多肽和變體PRO10282(Stra6)多肽(特別包括PRO19578)。因此，當然考慮到本領域熟知的供選擇方法可用于制備PRO10282。例如，通過利用固相合成技術的直接合成肽的方法來生產PRO10282序列或其一部分[參見例如，Stewart等，Solid-Phase PeptideSynthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，CA(1969)；Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)]。使用手工或自動操作技術，進行蛋白體外合成。例如，按照制造商的指示，使用實用生物系統肽合成儀(Foster City，CA)，可以完成自動合成。可以分別化學合成PRO10282的各部分，然后利用化學或酶學方法制得全長PRO10282。
1.編碼PRO10282(Stra6) DNA的分離可以從cDNA文庫獲得編碼PRO10282的DNA，所述cDNA文庫是從據信具有PRO10282 mRNA并且以可測得水平表達PRO10282的組織制備的。相應地，如實施例中所描述的那樣，從人組織制備的cDNA文庫中可以很方便地得到人的PRO10282 DNA。也可以從基因組文庫或者通過已知合成方法(例如自動核酸合成)獲得PRO10282-編碼基因。
使用為識別目標基因或其編碼的蛋白而設計的探針(如PRO10282抗體或至少約20-80個堿基的寡核苷酸)，可以篩選文庫。使用標準操作，如Sambrook等在Molecular CloningA Laboratory Manual(New YorkColdSpring Harbor Laboratory，1989出版)中所描述的方法，用選擇的探針進行cDNA或基因組文庫的篩選。分離PRO10282編碼基因的另一個可選用方法是使用PCR方法[Sambrook等，出處同上；Dieffenbach等，PCR PrimerALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，1995年出版)]。
下述實施例描述cDNA文庫篩選技術。選作探針的寡核苷酸序列應當具有足夠的長度并且足夠清晰，以便使假陽性出現機率最小。寡核苷酸優選是標記的，這樣通過與正在篩選的文庫中的DNA雜交而可被檢測到。標記方法為本領域所公知，包括使用放射性標記物如32P-標記的ATP、生物素或酶標記。包括中等嚴格和高度嚴格的雜交條件，見Sambrook等，出處同上。
可將在篩選文庫方法中鑒定的序列與其它已知的保藏序列或公共數據庫如GenBank或其它私有序列數據庫中的序列進行比較。使用本領域已知的和本文描述的方法，可以測定分子中限定區域或全長序列的序列同一性(無論在氨基酸水平還是在核苷酸水平)。
使用本文首次公開的推定氨基酸序列，和如果必要，使用Sambrook等(出處同上)描述的常規引物延伸程序，以檢測沒有被逆轉錄為cDNA的mRNA的前體和加工中間體，可以從選定的cDNA或基因組文庫獲得具有蛋白編碼序列的核酸。
2.宿主細胞的選擇和轉化用生產本文所述PRO10282的表達或克隆載體轉染或轉化宿主細胞，并在常規營養培養基中培養宿主細胞，對所述培養基進行改良使之適宜于誘導啟動子、選擇性轉化體或擴增編碼所需序列的基因。無需繁瑣的試驗，本領域熟練技術人員就可以選擇培養條件如培養基、溫度、pH等。通常，使細胞培養物產量最大化的原則、方案和實用技術見于Mammalian CellBiotechnologya Practical Approach，M.Butler編著(IRL出版，1991)和Sambrook等，出處同上。
轉染真核細胞和轉化原核細胞的方法為本領域熟練技術人員所已知，例如，CaCl2、CaPO4、脂質體-介導的方法和電穿孔法。根據所用的宿主細胞，使用適合于該宿主細胞的標準技術進行轉化。如Sambrook等出處同上所述的使用氯化鈣的鈣處理，或電穿孔法一般用于原核生物。如Shaw等在Gene，23315(1983)和1989年6月29日公布的WO89/05859中描述的那樣，根癌農桿菌的感染用于轉化某些植物細胞。對于沒有細胞壁的哺乳動物來說，可以使用Graham和van der Eb在Virology，52456-457(1978)中所述的磷酸鈣沉淀法。哺乳動物細胞宿主系統轉化的總的情況在美國專利4399216中已有描述。根據Van Solingen等，J.Bact.，130946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，763829(1979)所述方法，通常可以完成向酵母的轉化。然而，也可使用將DNA引入細胞的其它方法，例如通過核的顯微注射、電穿孔、細菌原生質體與完整細胞的融合，或者聚陽離子如聚凝胺(polybrene)、聚鳥氨酸。轉化哺乳動物細胞的各種方法見Keown等，Methods inEnzymology，185527-537(1990)和Mansour等，Nature，336348-352(1988)。
克隆或表達本文所述載體中DNA的適宜的宿主細胞，包括原核生物、酵母或高等真核細胞。適宜的原核生物包括但不限于革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌等真細菌，譬如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)如大腸桿菌。各種大腸桿菌株均是公眾可以得到的，如大腸桿菌K12株MM294(ATCC 31446)；大腸桿菌X1776(ATCC 31537)；大腸桿菌株W3110(ATCC 27325)和K5772(ATCC53635)。其它適宜的原核宿主細胞包括腸桿菌科如埃希氏桿菌屬，例如，大腸桿菌，腸桿菌屬，歐文菌屬，克雷白菌屬，變形菌桿屬，沙門菌屬(如鼠傷寒沙門菌)，沙雷菌屬(如粘質沙雷菌)和志賀菌屬等，以及芽孢桿菌屬如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(例如1989年4月12日出版的DD 266710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬的銅綠菌假單胞菌，及鏈霉菌。這些實例是用于說明而并非限制于此。W3110株是一個特別優選的宿主或母宿主，因為它是重組DNA產物發酵的常用宿主株。優選地，宿主細胞分泌少量蛋白水解酶。例如，修飾W3110株以使編碼宿主內源性蛋白的基因發生遺傳突變，此類宿主的實例包括大腸桿菌W3110株1 A2，該株具有完整基因型tonA；大腸桿菌W3110株9E4，該株具有完整基因型tonA ptr3；大腸桿菌W3110株27C7(ATCC 55244)，該株具有完整基因型tonA ptr3 phoAE15(argF-lac)169degP ompTkanr；大腸桿菌W3110株37D6，該株具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 degP ompTrbs7 ilvG kanr；大腸桿菌W3110株40B4，它是37D6發生非-卡那霉素耐藥degP缺失突變的株；和具有1990年8月7日發布的美國專利4946783中披露的突變型周質蛋白酶的大腸桿菌株。或者，克隆的體外方法，例如PCR或其它核酸聚合酶反應，是適宜的。
除了原核生物，真核微生物如絲狀真菌或酵母也是適于使編碼PRO10282的載體克隆或表達的宿主。釀酒酵母是常用的低等真核宿主微生物。其它真核微生物包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(Beach和Nurse，Nature，290140；1985年5月2日公布的EP139383)；克魯維酵母屬(Kluyveromyces)宿主(美國專利4943529；Fleer等，Bio/Technologv，9968-975(1991))，例如乳酸克魯維酵母(K.lactis)(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2)737-742)、脆壁克魯維酵母(K.fragilis)(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16045)、威克曼氏克魯維酵母(K.wickeramii)(ATCC24178)、K.waltii(ATCC 56500)、果蠅克魯維酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906；Van den Berg等，Bio/Technology，8135(1990))、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans)和克魯維氏酵母屬(K.marxianus)等；yarrowia(EP402226)；巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)(EP183070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28265-278)；念珠菌屬；Trichoderma reesia(EP244234)；粗糙鏈孢霉(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，765259-5263)；許旺氏酵母屬(schwanniomyces)如西方許旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公布的EP394538)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、Tolypocladium(1991年1月10日公布的WO91/00357)以及曲霉屬宿主如構巢曲霉(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，112284-289；Tilburn等，Gene，26205-221；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，811470-1474)和黑曲霉等(Kelly和Hynes，EMBO J.，4475-479)。在本文中嗜甲基(Methylotropic)酵母是適宜的，包括但不限于選自下述屬的能夠在甲醇中生長的酵母漢遜氏酵母屬(Hansenula)，念珠菌屬(Candida)，克勒克酵母屬(Kloeckera)，畢赤酵母屬(Pichia)，酵母屬，球擬酵母屬和紅酵母屬。此類酵母的例證性特定酵母屬的清單見C.Anthony，TheBiochemistrv ofMethylotrophs，269(1982)。
用于表達糖基化PRO10282的適合宿主細胞來自多細胞生物。無脊椎動物細胞的實例包括昆蟲細胞(例如果蠅屬S2和草地夜蛾Sf9)和植物細胞。有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和COS細胞。更具體的實例包括SV40(COS-7，ATCC CRL 1651)轉化的猴腎CV1細胞系；人胚腎細胞系(293細胞或亞克隆培養成在懸浮培養液中生長的293細胞，Graham等，J.Gen Virol.3659(1977))；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774216(1980))；鼠賽爾托利細胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23243-251(1980))；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝臟細胞(Hep G2，HB 8065)；和鼠乳腺癌細胞(MMT 060562，ATCCCCL51)。選擇合適宿主細胞是本領域常識。
3.復制型載體的選擇和應用可將編碼PRO10282的核酸(例如cDNA或基因組DNA)插入復制型載體中以進行克隆(DNA擴增)或表達。各種載體是公眾可以獲得的。載體可以是例如質粒、粘粒、病毒顆粒或噬菌體的形式。使用各種方法可將合適的核酸序列插入載體。通常，利用本領域已知技術將DNA插入到合適的限制性核酸內切酶位點。載體組成部分一般包括但不限于一個或多個信號序列、復制起點、一個或多個標記基因、增強子元件、啟動子和轉錄終止序列。使用本領域熟練技術人員熟知的標準連接技術，構建包括這些組成部分中一個或多個元件的適宜載體。
PRO10282不僅可直接重組制備，而且還可制備成與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽為信號序列或在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特異性裂解位點的其它多肽。通常，信號序列是載體的一個組分或者是被插入載體的PRO10282-編碼DNA的一部分。信號序列可以是選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、1pp或熱穩定腸毒素II前導區的原核信號序列。對于酵母分泌，可以是例如酵母轉化酶前導區、α因子前導區(包括糖酵母屬和克魯維酵母屬的α因子前導區，后者在美國專利5010182中有述)，或酸性磷酸酶前導區、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導區(1990年4月4日公布的EP362179)，或者1990年11月15日公布的WO90/13646中所述信號序列。在哺乳動物細胞表達時，可使用哺乳動物信號序列以直接分泌蛋白，如得自相同物種或相關物種分泌型多肽的信號序列以及病毒分泌前導區。
表達載體和克隆載體均含有使載體在一個或多個選定宿主細胞中復制的核酸序列。在多種細菌、酵母和病毒中，這樣的序列眾所周知。來自質粒pBR322的復制起點適宜于大多數革蘭氏陰性細菌，2μ質粒復制起始點適于酵母，各種病毒復制起始點(SV40，多瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)適宜于哺乳動物細胞中的克隆載體。
表達載體和克隆載體通常包含篩選基因，也稱為可篩選標記。典型的篩選基因編碼蛋白，該蛋白(a)提供對抗生素或其它毒素，如氨芐青霉素、新霉素、氨基蝶呤或四環素等的抗性，(b)彌補營養缺陷，或(c)提供從復合培養基中不能得到的關鍵營養物質，例如編碼芽孢桿菌屬D-丙氨酸消旋酶的基因。
適于哺乳動物細胞的篩選標記實例，是那些使能接納編碼PRO10282核酸的細胞得到鑒定的標記，例如DHFR或胸苷激酶。當使用野生型DHFR時，適當的宿主細胞是按照Urlaub等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA774216(1980)中描述的方法制備和擴增的DHFR活性缺陷型中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。適用于酵母的合適篩選基因是存在于酵母質粒YRp7中的trp1基因[Stinchcomb等，Nature，28239(1979)；Kingsman等，Gene，7141(1979)；Tschemper等，Gene，10157(1980)]。trp1基因為不能在色氨酸中生長的酵母突變株(例如ATCC 44076或PEP4-1)提供了篩選標記[Jones，Genetics，8512(1977)]。
表達和克隆載體通常含有可操作地連接于PRO10282-編碼核酸序列的啟動子，以指導mRNA合成。被各種潛在宿主細胞識別的啟動子是眾所周知的。適用于原核宿主的啟動子，包括β-內酰胺酶和乳糖啟動子系統[Chang等，Nature，275615(1978)；Goeddel等，Nature，281544(1979)]，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統[Goeddel，Nucleic acids Res.，84057(1980)；EP 36776]，和雜合啟動子如tac啟動子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8021-25(1983)]。適用于細菌系統的啟動子，也含有可操作地連接于編碼PRO10282的DNA的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。
適用于酵母宿主的啟動序列的實例，包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzeman等，J.Biol.Chem.，2552073(1980)]或其它糖酵解酶[Hess等，J.Adv.EnzymeReg.，7149(1968)；Holl and，Biochemistry，174900(1978)]的啟動子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶，己糖激酶，丙酮酸脫羧酶，磷酸果糖激酶，萄萄糖-6-磷酸異構酶，3-磷酸甘油變位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖異構酶，磷酸葡萄糖異構酶和葡萄糖激酶。
其它的酵母啟動子，即那些具有由生長條件控制轉錄的優點的誘導型啟動子，是下述基因的啟動子區，即乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP73657中進一步描述了用于酵母表達系統的適當載體和啟動子。
在哺乳動物宿主細胞中，由載體轉錄PRO10282可受下述啟動子調控，所述啟動子來自病毒基因組如多瘤病毒、雞痘病毒(1989年7月5日公布的UK2211504)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的啟動子，或者來自異源哺乳動物的啟動子，如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子等，和來自熱休克啟動子，前提是這些啟動子與宿主細胞系統相容。
在載體中插入增強子序列，可以增加編碼PRO10282的DNA在高等真核生物中的轉錄。增強子是DNA的順式作用元件，作用于啟動子以增加所述DNA的轉錄，一般約10～300bp。目前已知很多哺乳動物基因(珠蛋白，彈性蛋白酶、白蛋白、α胎蛋白和胰島素)的增強子序列。然而，人們通常使用真核細胞病毒的增強子。實例包括在其復制起始點晚期側(late side)的SV40增強子(bp100-270)，巨細胞病毒早期啟動子增強子，在其復制起始點晚期側的多形瘤增強子，和腺病毒增強子。所述增強子可以剪接入PRO10282編碼序列的5’或3’端，但優選位于啟動子的5’端。
用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的有核細胞)的表達載體，還包括對轉錄終止和mRNA結構穩定所必須的序列。這些序列通常來自真核或病毒DNA或cDNA的5’(偶爾為3’)非翻譯區。這些區域包含轉錄為編碼PRO10282的mRNA的非翻譯區中聚腺苷酸化片段的核苷酸區段。
在重組脊椎動物細胞培養中適應PRO10282合成的其它適宜方法、載體和宿主細胞，見Gething等，Nature，293620-625(1981)；Mantei等，Nature，28140-46(1979)；EP117060；和EP117058中的描述。
4.檢測基因擴增/表達使用基于本文提供的序列的合適標記的探針，利用常規技術如Southern印跡、測定mRNA轉錄量的Northern印跡[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980)]、點印跡(DNA分析)或原位雜交，可以直接在樣品中測定基因擴增和/或表達。或者，使用能夠識別特異雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜合雙鏈體或者DNA-蛋白雙鏈體。然后標記該抗體，進行試驗，試驗中，雙鏈體結合于表面，使得通過在該表面雙鏈體的形成，來檢測與該雙鏈體結合的抗體的存在。
或者，為直接定量測定表達的基因產物，用免疫學方法測定基因表達，所述方法如細胞或組織切片的免疫組化染色和細胞培養物或體液分析。適用于免疫組化染色和/或樣品液分析的抗體，可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且可以在任何哺乳動物中制備。可以方便地制備抗天然序列PRO10282多肽的抗體，或抗基于本文提供的DNA序列的合成肽的抗體，或者抗與PRO10282 DNA融合并編碼特異抗體表位的外源序列的抗體。
5.多肽的純化可從培養基或宿主細胞裂解物中回收PRO10282。如果PRO10282與膜結合，那么使用適宜去垢劑溶液(例如Triton-X100)或通過酶裂解使之自細胞膜釋放。使用各種物理或化學手段，如反復凍融、超聲、機械破碎或細胞溶解劑，使表達PRO10282所用的細胞破裂。
可以期望從重組細胞蛋白或多肽中純化PRO10282。下述程序是適宜純化步驟的實例在離子-交換柱上分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅或陽離子-交換樹脂如DEAE上層析；聚焦層析；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如交聯葡聚糖(Sephadex)G-75進行凝膠過濾；過蛋白A瓊脂糖柱以除去污染物如IgG；和結合表位-標記形式PRO10282的金屬螯合劑柱。可以使用蛋白純化的各種方法，這些方法是本領域熟知的，并在例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，Protein PurificationPrincipes andPractice，Springer-Verlag，New York(1982)中作了描述。純化步驟的選擇，取決于例如，所使用的生產方法和所產生的特定PRO10282的性質。
E.編碼PRO10282(Stra6)多肽的基因在腫瘤組織和細胞系中的擴增一方面，本發明建立在對在某些癌細胞中擴增的基因的鑒定和描述上。
原核和真核生物的基因組表面上看來存在兩個相矛盾的需求。一方面是作為遺傳信息的DNA以其原始形式保存和擴增，以確保經過多代的穩定遺傳。另一方面，細胞或生物體必須能夠適應持久的環境變化。適應機制可以包括遺傳物質在性質或數量上的修飾。性質上的修飾包括DNA突變，其中編碼序列被改變從而產生結構和/或功能不同的蛋白質。基因擴增是數量上的修飾，由此全編碼序列即基因的實際數量增加，導致可利用的轉錄模板的數量增加，可翻譯的轉錄物的數量增加，并最終導致由擴增基因編碼的蛋白質的大量增加。
基因擴增的現象及其發生機制，已在數種原核和真核培養系統做過體外研究。基因擴增最具特征的實例，涉及在含有不同濃度細胞毒藥物甲氨蝶呤(MTX)的介質中培養真核細胞。MTX是一種葉酸類似物，它通過阻斷二氫葉酸還原酶(DHFR)而干擾DNA合成。在最初暴露于低濃度MTX時，大多數細胞(＞99.9％)會死亡。少量細胞存活，并且通過產生大量DHFR-RNA和蛋白質而能夠在MTX濃度升高的介質中生長。過度產生的基礎是單一DHFR基因的擴增。發現該基因增加的拷貝呈小的、超數染色體(雙微體)形式的非染色體拷貝或者呈集成染色體拷貝。
在發生對細胞毒性劑(細菌的抗體和真核細胞的化療劑)抗性和致瘤性轉化時最常遇到基因擴增。作為自發事件或由于病毒或化學/環境攻擊而致的真核細胞的轉化，通常與所述細胞中遺傳物質發生變化有關。在人惡性腫瘤中觀察到的最常見變化之一是p53蛋白突變。p53控制細胞從停滯期(G1)向復制期(S)轉變并且在有DNA損害時阻止這種轉變。換言之，p53突變體喪失功能的主要后果之一是DNA損害即遺傳變化的積聚和擴增。除點突變外，腫瘤細胞中遺傳變化的通常類型是擴增和嚴重的結構改變，如易位。
正如在DHFR實驗系統所闡明的那樣，DNA序列擴增可能表明特別的功能需要。因此，惡性腫瘤中一定致癌基因的擴增表明這些基因在惡性變和維持轉變表型的過程中的成因性作用。該假說已經得到最近研究的支持。例如，發現bcl-2蛋白在某些類型的非何杰金氏淋巴瘤中增多。該蛋白抑制細胞凋亡并導致腫瘤細胞進行性積聚。
業已發現生長因子受體基因家族的成員在各種型癌中擴增，提示這些受體的過度表達可能使得贅生細胞對于有限量可利用的生長因子更加不敏感。實例包括在雄激素剝奪治療期間復發性前列腺癌中雄激素受體擴增，和乳腺癌中生長因子受體同系物ERB2擴增。最終，涉及細胞內信號和控制細胞周期進展的基因在惡性變過程中可以發生擴增。這被bel-l和ras基因在各種上皮和淋巴腫瘤中的擴增證實。
這些早期研究提示，在腫瘤中鑒定擴增的DNA序列的可行性，因為這種方法可以鑒定對于惡性變而言非常重要的基因。由于改變蛋白可能代表腫瘤治療的新而特異的靶，因此，ERB2的情況從治療的角度也已經證明了這種可行性。
數種不同的技術可用于證明擴增的基因組序列。對制備自癌細胞的染色體伸展(spreads)的經典細胞遺傳學分析足以勝任鑒定大體的結構改變，如易位、缺失和倒位。如果有大范圍的高拷貝數量或者以染色體外物質存在的話，則僅有擴增的基因組區域可以看得見。雖然細胞遺傳學是證明具體染色體改變與特定腫瘤具有一致關聯性的首選技術，但是對于鑒定和分離可控制的DNA序列來說是不充分的。最近開發的比較基因組雜交(CGH)技術已經證明腫瘤中廣泛存在的基因組擴增現象。腫瘤DNA和正常DNA在正常細胞分裂中期同時雜交，通過對腫瘤中以增強的頻率出現的DNA序列進行圖形分析，可以篩選整個基因組(WO93118186；Gray等，Radiation Res.，137275-289)。作為篩選方法，該類型分析法已經揭示了各種人腫瘤中大量的復發(recurring)擴增子(一段擴增的DNA)。盡管CGH較經典的細胞遺傳學分析法在鑒定擴增的DNA段(stretches)方面更為敏感，但是使用標準分子遺傳學技術CGH不能夠快速鑒定和分離擴增子內的編碼序列。
檢測基因擴增最敏感的方法是基于聚合酶鏈反應(PCR)的分析法。這些分析法精巧靈敏，使用極小量的腫瘤DNA作為起始物料，提供用于后續分析(如序列分析)所需的DNA，并且該方法適于進行高容量通過量的分析。
上面提到的分析法并不相互排斥，而是經常被聯合應用以鑒定腫瘤中的擴增。盡管細胞遺傳學分析和CGH代表檢查整個基因組擴增區域的篩選方法，但是基于PCR的分析法最適于編碼序列即擴增區域的基因的最終鑒定。
根據本發明，使用定量PCR方法，通過將來源于各種原發腫瘤或腫瘤細胞系的RNA與來源于健康供體的庫存(pooled)DNA進行比較，已經鑒定了這些基因(S.Gelmini等，Clin.Chem.43752 )，所述腫瘤包括乳腺癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、腦瘤、肝癌、腎癌、胰腺癌、脾臟腫瘤、甲狀腺癌、睪丸癌、卵巢癌、子宮癌等。使用TaqMan儀(ABI)完成定量PCR操作。根據DNA的編碼序列設計基因-特異性引物和熒光探針。
人肺癌細胞系，包括A549(SRCC768)，Calu-1(SRCC769)，Calu-6(SRCC770)，H157(SRCC771)，H441(SRCC772)，H460(SRCC773)，SKMES-1(SRCC774)，SW900(SRCC775)，H522(SRCC832)和H810(SRCC833)，所有這些均可從ATCC獲得。原發性人肺腫瘤細胞通常衍生自腺癌，鱗狀細胞癌，大細胞癌，非小細胞癌，小細胞癌和支氣管肺泡癌，并且包括例如SRCC724(腺癌，簡寫為″AdenoCa″)(LT1)，SRCC725(鱗狀細胞癌，簡寫為″SqCCa)(LT1a)，SRCC726(腺癌)(LT2)，SRCC727(腺癌)(LT3)，SRCC728(腺癌)(LT4)，SRCC729(鱗狀細胞癌)(LT6)，SRCC730(腺癌/鱗狀細胞癌)(LT7)，SRCC731(腺癌)(LT9)，SRCC732(鱗狀細胞癌)(LT10)，SRCC733(鱗狀細胞癌)(LT11)，SRCC734(腺癌)(LT12)，SRCC735(腺鱗狀細胞癌)(LT13)，SRCC736(鱗狀細胞癌)(LT15)，SRCC737(鱗狀細胞癌)(LT16)，SRCC738(鱗狀細胞癌)(LT17)，SRCC739(鱗狀細胞癌)(LT18)，SRCC740(鱗狀細胞癌)(LT19)，SRCC741(肺細胞癌，簡寫為″LCCa″)(LT21)，SRCC811(腺癌)(LT22)，SRCC825(腺癌)(LT8)，SRCC886(腺癌)(LT25)，SRCC887(鱗狀細胞癌)(LT26)，SRCC888(adeno-BAC癌)(LT27)，SRCC889(鱗狀細胞癌)(LT28)，SRCC890(鱗狀細胞癌)(LT29)，SRCC891(腺癌)(LT30)，SRCC892(鱗狀細胞癌)(LT31)，SRCC894(腺癌)(LT33)。也包括指定為SRCC1125[HF-000631]，SRCC1127[HF-000641]，SRCC1129[HF-000643]，SRCC1133[HF-000840]，SRCC1135[HF-000842]，SRCC1227[HF-001291]，SRCC1229[HF-001293]，SRCC1230[HF-001294]，SRCC1231[HF001295]，SRCC1232[HF-001296]，SRCC1233[HF-001297]，SRCC1235[HF-001299]，andSRCC1236[HF-001300]的人肺腫瘤。
結腸癌細胞系，包括例如ATCC細胞系SW480(腺癌，SRCC776)，SW620(結腸腺癌的淋巴結轉移，SRCC777)，Colo320(癌，SRCC778)，HT29(腺癌，SRCC779)，HM7(結腸腺癌細胞系ATCC的高粘蛋白產生的變體，SRCC780，得自Dr.Robert Warren，UCSF)，CaWiDr(腺癌，SRCC781)，HCT116(癌，SRCC782)，SKC01(腺癌，SRCC783)，SW403(腺癌，SRCC784)，LS174T(癌，SRCC785)，Colo205(癌，SRCC828)，HCT15(癌，SRCC829)，HCC2998(癌，SRCC830)，和KM12(癌，SRCC831)。原發性結腸腫瘤包括指定為CT2(SRCC742)，CT3(SRCC743)，CT8(SRCC744)，CT10(SRCC745)，CT12(SRCC746)，CT14(SRCC747)，CT15(SRCC748)，CT16(SRCC749)，CT17(SRCC750)，CT1(SRCC751)，CT4(SRCC752)，CT5(SRCC753)，CT6(SRCC754)，CT7(SRCC755)，CT9(SRCC756)，CT11(SRCC757)，CT18(SRCC758)，CT19(腺癌，SRCC906)，CT20(腺癌，SRCC907)，CT21(腺癌，SRCC908)，CT22(腺癌，SRCC909)，CT23(腺癌，SRCC910)，CT24(腺癌，SRCC911)，CT25(腺癌，SRCC912)，CT26(腺癌，SRCC913)，CT27(腺癌，SRCC914)，CT28(腺癌，SRCC915)，CT29(腺癌，SRCC916)，CT30(腺癌，SRCC917)，CT31(腺癌，SRCC918)，CT32(腺癌，SRCC919)，CT33(腺癌，SRCC920)，CT35(腺癌，SRCC921)，and CT36(腺癌，SRCC922)的結腸腺癌。還包括指定為SRCC1051 [HF-000499]，SRCC1052[HF-000539]，SRCC1053[HF-000575]，SRCC1054[HF-000698]，SRCC1142[HF-000762]，SRCC1144[HF-000789]，SRCC1146[HF-000795]和SRCC1148[HF-000811]的人結腸腫瘤。
人乳腺癌細胞系，包括例如HBL100(SRCC759)，MB435s(SRCC760)，T47D(SRCC761)，MB468(SRCC762)，MB175(SRCC763)，MB361(SRCC764)，BT20(SRCC765)，MCF7(SRCC766)和SKBR3(SRCC767)，以及指定為SRCC1057[HF-000545]的人乳腺腫瘤中心。也包括指定為SRCC1094，SRCC1095，SRCC1096，SRCC1097，SRCC1098，SRCC1099，SRCC1100，SRCC1101的人乳腺腫瘤，和指定為SRCC893[LT32]的人乳腺-轉移-肺-NS腫瘤。
人腎腫瘤中心包括SRCC989[HF-000611]和SRCC1014[HF-000613]。
人睪丸腫瘤中心包括SRCC1001[HF-000733]和睪丸腫瘤邊緣(margin)SRCC999[HF-000716]。
人甲狀旁腺腫瘤包括SRCC1002[HF-000831]和SRCC1003[HF-000832]。
F.組織分布本文基因擴增分析的結果，可通過進一步的研究如通過測定各種人組織中mRNA表達來加以證實。
如前面指出的那樣，使用基于本文提供的序列的合適標記的探針，利用常規技術如Southern印跡、測定mRNA轉錄量的Northern印跡[Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775201-5205(1980)]、點印跡(DNA分析)或原位雜交，可以直接在樣品中測定基因擴增和/或表達。或者，使用能夠識別特異雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜化雙鏈體或者DNA-蛋白雙鏈體。
或者，為直接定量測定表達的基因產物，用免疫學方法測定基因在各種組織的表達，所述免疫方法如細胞或組織切片的免疫組化染色和細胞培養物或體液分析。適用于免疫組化染色和/或樣品液分析的抗體，可以是單克隆抗體或多克隆抗體，并且可以在任何哺乳動物中制備抗體。可以方便地制備抗天然序列PRO10282(Stra6)多肽的抗體，或抗基于本文提供的DNA序列和編碼特異抗體表位的合成肽的抗體。下文提供生產抗體所用的一般技術和Northern印跡與原位雜交所用的特殊方案。
G.染色體圖譜如果一指定基因的擴增是功能相關性的，那么該基因應當較對于腫瘤存活不重要的鄰近基因組區域被更多地擴增。為證實這種觀點，可通過例如放射-雜交分析法對特定染色體進行基因作圖。然后在所確定的位置和在鄰近基因組區域測定擴增水平。對選擇性或優先性擴增的基因組區域的基因圖譜表明，基因組區域選擇性或優先性擴增與觀察到的基因擴增促進腫瘤生長或存活的可能性是一致的。染色體圖譜既包括框架繪圖也包括中心繪圖。更進一步的細節請參見例如，Stewart等，Genome Research，7422-433(1997)。
H.抗體結合的研究基因擴增研究的結果，可通過抗體結合研究而得到進一步證實。在該抗體結合研究試驗中，檢測抗-PRO10282(抗-STRA6)抗體抑制腫瘤(癌)細胞上STRA6多肽表達的能力。例證性抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、雙特異性抗體和異源偶聯抗體，它們的制備將在下面予以描述。
可使用本領域已知的方法進行抗體結合研究，所述方法如競爭性結合試驗、直接和間接夾心試驗，及免疫沉淀試驗。Zola，單克隆抗體技術指南，147-158頁(CRC Press，Inc.1987)。
競爭性結合試驗依賴于標記的標準品在同限定量抗體結合中與測試樣品分析物競爭的能力。測試樣品中靶蛋白(由腫瘤細胞中擴增的基因編碼)的量與同抗體結合的標準品的量成反比。為便于測定結合形式的標準品的量，優選抗體在競爭之前或之后是不溶性的，這樣可以很方便地把與抗體結合的標準品和測試樣品從保持未結合狀態的標準品和測試樣品中區分開來。
夾心試驗涉及使用被檢測蛋白質的兩種抗體，每一種抗體能夠結合待測蛋白不同的免疫原性部分或表位。在一夾心試驗中，首先使測試樣品分析物與固定在固體載體上的第一抗體結合，然后再使第二抗體與分析物結合，從而形成不溶性的三組分復合物。參見例如美國專利4376110。第二抗體本身可標記有可檢測部分(直接夾心試驗)，或者通過使用標記有可檢測部分的抗-免疫球蛋白抗體來測定第二抗體(間接夾心試驗)。例如，一種類型的夾心試驗是ELISA分析法，其中可檢測部分是酶。
對于免疫組織化學而言，組織樣品可以是新鮮的或冷凍的，或者是包埋在石蠟中并用防腐劑如福爾馬林固定。
I.基干細胞的腫瘤分析腫瘤(例如癌)的基于細胞的分析和動物模型，可用于證實基因擴增分析的發現，并進一步了解本文鑒定的基因與腫瘤細胞生長的進展、發病機理之間的關系。使用已經確定擴增本文所述基因的原發性腫瘤細胞或細胞系，可以檢測本文鑒定的基因產物在腫瘤或癌發病和病理學中的作用。此類細胞包括例如乳腺、結腸和肺的癌細胞以及上文列舉過的細胞系。
在不同的研究中，用本文描述的cDNA轉染已知參與特定腫瘤的細胞類型的細胞，并分析這些cDNA誘導過度生長的能力。適宜的細胞，包括例如穩定的腫瘤細胞系如B104-1-1細胞系(neu原癌基因轉染的穩定的NIH-3T3細胞系)和ras-轉染的NIH-3T3細胞，可用所需的基因轉染所述細胞系，并監測腫瘤發生的發展(tumorogenic growth)。然后，可將此轉染的細胞系用于檢測多克隆或單克隆抗體或抗體組合物通過對轉化細胞生長發揮細胞抑制或細胞毒活性，或者通過介導抗體-依賴性細胞毒作用(ADCC)從而抑制腫瘤發生細胞生長的能力。用本文鑒定的基因編碼序列轉染的細胞，還可用于確定治療腫瘤的候選藥物。
此外，盡管優選穩定的細胞系，但是得自轉基因動物(見下述)的原代培養物，可用于本文基于細胞的分析中。從轉基因動物獲取連續細胞系的技術為本領域所熟知(參見例如Small等，Mol.Cell.Biol.5，642-648)。
J.動物模型各種眾所周知的動物模型，可用于進一步了解本文鑒定的基因在腫瘤發展和發病機理中的作用，并可用于檢測候選治療劑的有效性，所述候選治療劑包括抗體和天然多肽的其它拮抗劑，后者包括小分子拮抗劑。此類模型的在體(in vivo)特性，使得它們可以具體預見在人類患者的反應。腫瘤和癌(如乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌等)的動物模型包括非-重組動物和重組(轉基因)動物。非重組動物模型包括例如嚙齒動物如小鼠模型，此類模型可通過利用標準技術將腫瘤細胞引入同系基因鼠體內而制得，譬如，把結腸癌細胞植入結腸組織中，所述標準技術如皮下注射、尾靜脈注射、脾埋入法、腹膜內植入、腎囊植入法或orthopin植入。(參見例如，1997年9月18日公布的
發明者黛安娜·彭尼卡, 維多利亞·史密斯, 威廉·I·伍德 申請人:杰南技術公司