專利名稱：從大腸桿菌中提取的脂多糖的制作方法
技術領域：
本發明涉及從大腸桿菌中提取的新的脂多糖。
所謂的內毒素是指細菌的結構成分，其不同于外毒素，不是由活細菌排泄出的，而是特別在自體消化作用后釋放出來的。所謂的典型的內毒素涉及熱穩定的脂多糖，下面稱為LPS，從革蘭氏陰性細菌的外細胞膜中提取。LPS由所謂的脂質A，核低聚糖以及特定的O-鏈構成，其中脂質A是LPS的毒素作用的主要貢獻成分。
內毒素刺激宏觀生物中免疫系統的介質，如白介素1，簡稱IL-1和腫瘤-壞死因子，簡稱TNFα的產生。
對腸細菌的內毒素，特別是大腸桿菌內毒素的組成，已經進行了一系列的研究，其中已經確定，S/R突變株一般只含有其O-鏈的一個重復單元(參見
圖1)。出發點是，在這些情況下編碼O-鏈的聚合酶的基因有缺陷，因此只將一個重復單元轉移到核低聚糖。與LPS結構相似，但是為其它結構的類型，經常也在人體病原菌，如奈瑟氏菌，弧菌，彎曲桿菌，螺桿菌等中發現。這些細菌擁有一種LPS，使它們可能通過一種特殊的分子模擬，此外像哺乳動物的糖蛋白和糖脂質的唾液酸和含有唾液酸的低聚糖的存在，避開宿主的免疫防護。大腸桿菌DSM 6601(分類號為大腸桿菌(E.Coli)NISSLE 1917 SK22/1，于1991年7月11日保藏于德意志微生物保藏中心，該保藏單位的地址為德國(D-38124)不倫瑞克馬歇爾奧德路1b號)確定為O6-血清型。這種結構由P.E.Jansson等在Carbohydr.Res.131(1984)277-283中研究并發表。這種結構相應于圖2中描述的結構式。
也有不同的研究組研究了大腸桿菌的脂質A，其中確定，脂質A的結構在一般情況下以六酰基形式存在，對于大腸桿菌的所有血清型是一致的(圖3)。此六酰基化合物的結構在1984年由Th.Rietschel等的脂多糖的脂質A組分的結構和構象(Structure and conformationof the lipid A component of lipopolysaccharides)；內毒素手冊(Handbook of Endotoxins)(Proctor，R.編輯)，第一卷，內毒素化學(E.Th.Rietschel編寫)，Elsevier，阿姆斯特丹(1984)，187-220頁中公開，相應于圖3中的描述。
特定的O-鏈和脂質A通過核低聚糖互相連接。目前已知大腸桿菌有五種不同的核低聚糖，這方面參閱O.Holst等的脂多糖的核心區的化學結構，在細菌的內毒素的脂多糖(Bacterial EndotoxicLipopolysacehariides)，第一卷，Morrison D.C.和Ryan，J.L.(編輯)，Boca Raton，FL，美國(1992)第135-170頁(參見圖4)。
在大腸桿菌菌株DSM 6601的LPS的研究方面已經確定，脂質A在其組成上對應于通常對大腸桿菌描述的脂質A的六酰基形式。
關于IL-1和TNFα的釋放方面的研究在人體的單核細胞中確認，脂質A具有相同的活性，因此很有可能對應于大腸桿菌的脂質A的已知結構(參見圖5，圖6)。這種假設通過化學分析證實。
有關大腸桿菌DSM 6601的特定O-抗原的結構令人驚奇的事實是，明顯地鏈中總是只存在唯一一個“重復單元”(參見圖1)，由此可以得出的結論是，菌株DSM 6601涉及S/R突變株，這對于一個人體分離物是極其特殊的。但是，這種“重復單元”的結構，如血清學分析表明，對應于大腸桿菌O6的O-鏈的基本模式。
盡管菌株DSM 6601的核心區相應于已知的R1結構。然而，結構的特殊性在于，分析確定了每個LPS分子具有8個磷酸酯殘基，其中脂質A一般分攤到只有2個磷酸酯殘基。此外還發現了非化學計量含量的焦磷酸乙醇胺。
因此概括地確定，菌株DSM 6601的LPS與目前已知的由大腸桿菌提取的LPS特別在核心的磷酰化的糖組分方面和在O-鏈的聚合度方面區別很大。脂質A在結構和生物學上相應于對于大腸桿菌常規的類型，這強調了這種物質在生物活性方面的作用。所述的LPS不只是適用于鑒別帶有它的大腸桿菌菌株，還在保持其免疫調制作用的情況下賦予其降低了的致病性。O-鏈是β-糖苷而不是α-糖苷連接的事實，對于大腸桿菌可以用S/R突變株DSM 6601的例子首次明確地表明。
大腸桿菌DSM 6601的脂多糖(LPS)涉及一種新型的平滑-粗糙(S/R)結構，其一方面由目前已知的部分結構組成(O-特定鏈，核低聚糖和脂質A)，另一方面以這里存在的復雜的形式表征為第一次且完整的結構(參見圖7)。僅由血清型O6的一個唯一的重復單元構成的O-特定鏈以β-糖苷連接到核低聚糖上，因此不同于O-鏈內部(α-糖苷)的連接。核低聚糖具有R1結構，一種通過用R1特異性抗體進行血清學研究證實的化學判斷。脂質A組分具有大腸桿菌脂質A特征性的某種化學結構。
大腸桿菌菌株DSM 6601的LPS具有一個奇特的均一性。僅僅在磷酸酯取代基方面存在非均一性(PP和P-Etn對P和P)可以加以確定，其首次以這種形式被描述。借助復雜的NMR分析可以明確地確定在核低聚糖R1核低聚糖中的P-Etn-取代基在第二個庚糖(HepII)的2-位。
菌株DSM 6601的LPS的完整的結構在圖7中描述。
下面借助實施例對本發明進一步闡述。
實施例1LPS的制備LPS由洗滌并干燥的細菌生物質在改進的苯酚/水萃取工藝后獲得；就此方面參閱O.Westphal等，細菌的脂多糖，用苯酚/水萃取和這種工藝的進一步應用，Meth.Carbohydr.Chem.，第V卷(1965)第83-91頁。
47g事先用蒸餾水洗滌兩次的凍干的細菌按照Westphal和Jann相應的改進的規程提取。這種改進在于，隨后進行的對含水提取物的酶處理(DNA酶，RNA酶，蛋白質酶K)，其用于除去可能出現的雜質蛋白質和DNA/RNA組分。為此室溫下向這種水相中加入各20mgRNA酶(核糖核酸酶A，牛胰，Sigma)和20mg DNA酶(DNA酶1，牛胰，II級，Sigma)，混合物在室溫下攪拌30h。然后，加入20mg蛋白質酶K(Tritirachium album，Boehringer，Mannheim)，再攪拌12h。然后，懸浮液在4℃下對15L蒸餾水滲析24小時三次，再凍干。酶處理的提取物重新吸收在蒸餾水中，以致于最后濃度達到50mg/mL。這種懸浮液在冷狀態下超速離心分離(155，000×g，4℃，4h)三次。沉淀物(LPS)用150mL蒸餾水吸收，再相對于水滲析三天一次，然后凍干(產量LPS1.45g，3.1％m/m)。
實施例2來自大腸桿菌菌株DSM 6601的LPS的分析己糖胺(HexN)(這里指葡糖胺+半乳糖胺，GlcN+GalN)按照改進的Morgan-Elson試驗來測定(Strominger，J.L.，Park，J.T.Thompson，R.E.J.Biol.Chem.234，3263-3268(1959))，但是也可選擇利用HPLC(PICO-TAG，Waters)來測定。不同于Morgan-Elson試驗，這種分析方法不僅可以分開測定和量化GlcN和GalN，而且還可以平行查出經常在LPS中出現的GlcN磷酸酯，2-乙醇胺(Etn)和2-乙醇胺磷酸酯(Etn-P)的存在。氣液色譜(GC)利用Varian 3700GC或Hewlett Packard(HP 5890系列II)色譜通過毛細管柱(熔融硅膠SPB-5，30m，Supelco)進行。聯合的氣液色譜/質譜(GC-MS)利用裝有HP-1毛細管柱(30m，Hewlett Packard)的質譜儀(HP Modell5989)完成。GC或GC-MS分析用于測定糖醇乙酸酯形式的中性糖(Glc，Gal，Hep，Man)(Sawardeker，J.S.，Slonerker，J.H.Jeanes，A.Anal.Chem.37，1602-1604(1967))，以及在強烈的甲醇醇解(2MHCl/MeOH，120℃，16h)(Wollenweber，H.W.和Rietschel，E.Th.，脂多糖(脂質A)脂肪酸的分析，J.Microbiol.Meth.11，(1990)195-211)和氯仿提取后進行測定和量化脂肪酸甲酯衍生物形式的脂肪酸。兩種GC分析方法都在150℃(恒溫3min)開始，借助5℃/min的線性溫度梯度升溫至320℃。磷酸酯根據Lowry等(Lowry，O.H.，Roberts，N.R.，Leiner，K.Y.，Wu，M.KL.Farr，A.L.，J.Biol.Chem.207，1-17(1954))，2-氧代-3-脫氧-D-甘露辛酮糖酸(Kdo)借助硫代巴比妥酸試驗測定(Waravdekar，V.C.& Saslaw，L.D.，J.Biol.Chem.234，1945-1950(1959))。
游離脂質A和核低聚糖的制備和純化LPS(258.8mg)懸浮在25mL 0.1M NaOAc/HOAc(pH4.4)中，在100℃進行溫和的酸水解1h。然后用25mL氯仿從水解產物中萃取親油組分(脂質A)三次(產量23.2mg)。有機相中的脂質A借助制備的薄層色譜(PSC)進一步提純(2mmPSC Kieselgel 60板，E.Merck，Darmstadt)，其用氯仿-甲醇-水100∶75∶15(v/v/v)進行色譜提純，通過浸入在蒸餾水中展開。用這種方法得到6個級分，其中主要的級分(Rf≈0.4)是純化的二磷酰化的六酰基脂質A(DPHLA-Ec6601)。提純的DPHLA-Ec6601(產量2.06mg)溶解在氯仿-甲醇8∶2(v/v)中，在進行MALDI-TOF-MS分析前用離子交換劑(Amberlite IRA 120，H+型)處理。純化的DPHLA-Ec6601的等分試樣(250μg)用于生物學試驗。
對氯仿抽提物的含水相進行凍干(產量272mg)，低聚糖借助TSK-柱[3.5×90cm，TSK HW-40(S)，E.Merck]用吡啶-醋酸-水8∶20∶2000，(v/v/v)進一步純化。各個低聚糖級分(Pool A，B，C和D)借助GC-MS和NMR-譜分析。含有O-鏈的糖組分(Man，GalNac)和核低聚糖的糖組分(Hep，Kdo)的主要級分(Pool A，#28-41；49.05mg)，進行進一步純化。其它級分含有單糖，沒有詳細研究的Kdo的人造物(Artefakte)(酐和內酯)和最終鹽。TSK分離的主要級分不僅在GC-MS分析中而且在NMR-分析中都表現出核低聚糖(Kdo，Gal，Hep)和O-鏈(Man，GalNac)的所有組分，因此進一步處理。
為此首先檢測是否分析用的高壓-陰離子交換色譜(HPAEC)適合將低聚糖純化為均相。這里應用帶有分析用的CarboPac PA1柱；(4.6mm×250mm)和線性的鹽梯度(5min在0值，然后50min內升至0.5M NaOAc)，流速為1mL/min的用于分析復雜糖結構的特殊的HPLC方法(DIONEX體系)。洗脫液借助脈沖電流檢測器(PAD)檢測還原當量(糖分子)。用這種方法可以得到四種低聚糖級分，其借助半制備的HPAEC，按類似的方法進一步提純。
半制備的HPAEC借助CarboPac PA1柱；[(9mm×250mm)Dionex體系]用與如在分析用的HPAEC(5min在0值，然后50min內升為0.5M NaOAc)中一樣的鹽梯度和4mL/min的流速完成。低聚糖(42mg；從TSK-柱得到的pool A)在半制備的HPAEC上的裝載是在兩個類似的HPAEC進程中進行。洗脫液每分鐘收集一個級分，各個級分利用分析用的HPAEC分別進行研究。按照這種方法利用半制備的HPAEC得到兩個主要的級分(級分I，保留時間tR～12min和組分II，tR～15min)。兩種HPAEC級分必須在MALDI-TOF-MS和NMR分析之前借助G-10柱(2.5×120cm)脫鹽(產量級分I 4.68mg；級分II 4.39mg)。
基體輔助的激光解吸/離子化時間飛行(MALDI-TOF)質譜分析基體輔助的激光解吸/離子化時間飛行質譜分析(MALDI-TOF-MS)在Bruker-ReflexII飛行時間質譜儀(Bruker-Franzen Analytik，Bremen)中只以線性的組態和負模式，在加速電壓為20kV和“延遲的離子萃取”的狀態下進行。試樣首先以10μg/μL的濃度溶解在氯仿(脂質A)或蒸餾水(低聚糖級分)中，其中2μL的等分試樣用2μL于甲醇含有0.5M 2，4，6-三羥基乙酰苯(Aldrich，Steinheim)的基體溶液溶解。這種混合物的等分試樣(0.5μL)涂敷在金屬桿上，用電吹風機干燥。
NMR譜圖分析一維(1D)1H和31P-NMR-譜圖與二維(2D)NMR譜圖用Bruker AvanceDRX-600譜圖儀(Bruker，Rheinstetten)進行，13C NMR譜圖用BrukerAMX-360譜圖儀在300K用2H2O進行。每次測量前，樣品用氘代水2H2O凍干兩次。作為外標使用丙酮(δH2.225ppm，δC31.45ppm)或85％H3PO4(δPOppm)。標準的Bruker軟件(XWINNMR 1.3)用于采集NMR數據。用于TOCSY(整體相關譜圖)或NOESY(核奧佛好塞增強譜圖)的混合時間是100或500ms。
血清學分析血清學分析作為用三種不同的抗體顯現的Western-Blots進行。
1.多克隆抗-O6-抗血清(家兔)用大腸桿菌菌株DSM 6601(血清型O6∶K5∶H1)在漢堡的衛生研究院制備(Bockemühl教授)。
2.多克隆抗-大腸桿菌R1-抗血清(家兔，內部記號K299/d58)通過用粗糙型突變株的免疫得到，其具有R1-核心(抗-R1)。
3.應用一種單克隆抗體(WN1-222-5，內部記號F167)，其對從最小結構(＞Rd)起的所有的大腸桿菌核低聚糖廣泛地交叉反應。
表由菌株DSM 6601提取的大腸桿菌LPS的成分分析成分 成分含量nmol/mg(mol/LPS)a糖 1.分析 2.分析GlcNb283(1.8)n.b.GalN 139(0.9)n.b.HexNc591(3.8)589(2.9)Kdo248(1.6)242(1.2)Man321(2.1)383(1.9)Gal474(3.0)557(2.8)Glc1069(6.9) 1291(6.4)L，D-Hep 566(3.6)442(2.2)極性端基P 1188(7.6) 1146(5.7)Etn-P 85(0.5) n.b.脂肪酸12∶0 130(0.8)162(0.8)14∶0 156(1.0)201(1.0)14∶0(3-OH)460(3.0)504(2.5)16∶0 痕量痕量a各組分的摩爾比(在括號中)因為O-鏈中GalNAc和GlcNAc的存在而標化到肉豆蔻酸的值(14∶0)(1.0mol 14∶0/mol LPS)。
bGlcN借助氨基酸分析儀測定。數值由GlcN和GlcN-6P的總和得到。
cHexN根據Morgan-Elson光度測定。
n.b.未確定。
按上述方法得到的LPS-制品與比較的LPS一起進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(參見圖1)。對于LPS的SDS-PAGE-分析用16％聚丙烯酰胺凝膠進行(英國，Laemmli，噬菌體T4的頭部的組裝過程中結構蛋白質的斷裂，Nature，227，680-685(1970))。LPS-帶借助靈敏的堿性銀染方法著色(C.M.Tsai和Frasch，C.F.，一種用于檢測聚丙烯酰胺凝膠中的脂多糖的敏感的銀染方法Anal.Biochem.，119，1982，115-119)。
研究結果在圖1中說明。
實施例3生物活性a)IL-1-活性IL-1-活性借助MNC-增殖試驗在培養液的上清液中測定。人體單核細胞(MNC)由志愿捐獻者的外周血液分離(8×105MNC/200mL)，轉移到玻璃瓶中，同時摻入試驗物質。對于體外生物活性的試驗，首先用LPS刺激(10ng/mL)細胞。在8個小時的溫育時間后研究150mL培養液的上清液的細胞因子的釋放。IL-1-活性借助纖維細胞-增殖試驗在培養液的上清液中測定。對此需要的成纖維細胞從人體的包皮取得。這種成纖維細胞的增殖通過IL-1提高。通過在概率分析中比較培養液的上清液的劑量作用曲線與標準曲線，測定培養液的上清液中的生物活性。由已知內毒素活性的細菌菌株(弗里德奧沙門氏菌)提取的LPS用作陽性參照(陽性對照)，因此在圖5中引用。
b)TNFα-活性培養液的上清液的TNFα-活性在細胞毒性試驗中用TNF敏感的細胞系L929測定。在概率分析中比較培養液的上清液的劑量作用曲線與標準曲線，可以測定TNF活性。這里也使用已知內毒素活性的由弗里德奧沙門氏菌中提取的LPS作為陽性對照。結果在圖6中圖解說明。
結果表明，關于IL-1和TNFα-釋放(Ausschuettung)，可以確定在用作標準和陽性對照的由弗里德奧沙門氏菌中提取的LPS與由菌株DSM 6601中提取的LPS之間沒有顯著的區別(圖5和6，下圖)。這也可以由菌株DSM 6601的脂質A與大腸桿菌的高純化的脂質A幾乎具有全等的活性來證明(圖5和6，上圖)。
權利要求
1.具有圖7描述的結構的脂多糖(LPS)。
2.權利要求1的LPS，其特征為，每個LPS分子含有8個磷酸酯殘基。
3.權利要求1或2的LPS，其特征為，每個LPS分子含有0.5molP-Etn。
4.獲得按權利要求1至3的LPS的方法，其特征為，洗滌并干燥的大腸桿菌生物質按已知方式進行苯酚/水提取，這樣得到的提取物用RNA酶/DNA酶和蛋白酶K處理。
5.權利要求4的方法，其特征為，使用大腸桿菌菌株DSM 6601。
6.按權利要求1至3的由大腸桿菌菌株DSM 6601提取的脂多糖在微生物學，生物技術，分析，診斷和/或醫藥方面的應用。
全文摘要
本發明涉及由大腸桿菌DSM 6601提取的脂多糖。這種LPS與大腸桿菌提取的目前已知的LPS特別在核心的磷酰化的糖組分和O－鏈的聚合度方面不同。脂質A在結構和生物學上相應于大腸桿菌的常規類型。所述的LPS不只適用于鑒定帶有它的大腸桿菌菌株，還在保持其免疫調制作用的同時賦予其降低了的致病性。
文檔編號C12P19/00GK1436245SQ01806916
公開日2003年8月13日 申請日期2001年3月20日 優先權日2000年3月20日
發明者H·普羅珀特, J·馬林卡, J·舒爾澤, U·索南博恩, U·扎林格, A·厄爾默, E·T·里特徹爾 申請人:制藥中心有限公司