通過遺傳改變莽草酸路徑來改變生物體中精細化學品含量的制作方法

專利名稱：通過遺傳改變莽草酸路徑來改變生物體中精細化學品含量的制作方法
技術領域：
本發明涉及通過培養生物體尤其是植物用來產生精細化學品尤其是維生素E、維生素K和/或泛醌的方法，其中所述生物體尤其是植物的莽草酸路徑在野生型基礎上被遺傳改變，本發明還涉及轉基因生物體自身。
生物體，尤其是植物，呈現出一系列具有高經濟重要性的作為精細化學品的代謝物。以舉例方式提及的精細化學品為芳族氨基酸、水楊酸衍生物、類苯丙烷(phenylpropanoids)、黃酮類化合物、1，2-二苯乙烯、呫噸酮和醌，尤其是具維生素E或維生素K活性的混合的含異戊二烯基的脂類化合物。
用于產生精細化學品的生物技術方法為培養可產生這些精細化學品的生物體并從生物體中分離目標精細化學品。
以定向方式改變生物體中精細化學品含量，通過生物技術產生精細化學品的經濟方法及用生物體作為已加工或未加工的食品或飼料是人們所希望的，其中所述以定向方式改變生物體中精細化學品含量如增加想要的精細化學品含量和/或阻止代謝物向不想要的精細化學品的轉變。
經濟上重要的精細化學品的實例為塑體醌、泛醌以及類異戊二烯側鏈連接至芳香母核上的具維生素E或維生素K活性的化合物。
天然存在的具維生素E活性的八種化合物均為6-色原烷醇衍生物(Ullmann工業化學百科全書(Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry)，A 27卷(1996)，VCH Verlagsgesellschaft，第4章，478-488，維生素E)。生育酚基團(1a-d)顯示一個飽和側鏈，而生育三烯酸基團(2a-d)顯示一個不飽和側鏈 1a，α-生育酚R1＝R2＝R3＝CH31b，β-生育酚R1＝R3＝CH3，R2＝H1c，γ-生育酚R1＝H，R2＝R3＝CH31d，δ-生育酚R1＝R2＝H，R3＝CH3 2a，α-生育三烯酸R1＝R2＝R3＝CH32b，β-生育三烯酸R1＝R3＝CH3，R2＝H2c，γ-生育三烯酸R1＝H，R2＝R3＝CH32d，δ-生育三烯酸R1＝R2＝H，R3＝CH3在本發明中，維生素E理解為包括具維生素E活性的所有上述生育酚和生育三烯酸。
這些具維生素E活性的化合物是重要的天然脂溶性抗氧化劑。人和動物維生素E缺乏可導致病理生理學上的疾病。因此，將維生素E化合物作為食品和飼料、藥物制劑和化妝品中的添加物是有大的經濟價值的。
天然存在的具維生素K活性的化合物為1，4-萘醌衍生物(Ullmann工業化學百科全書，A27卷(1996)，VCH Verlagsgesellschaft，第5章，488-506，維生素K)。葉綠醌(早期名稱維生素K1)呈現出一個很大程度上飽和的側鏈，而甲基萘醌類(早期名稱維生素K2)呈現出一個具4至13個異戊二烯殘基的不飽和側鏈。
在本發明中，維生素K理解為包括所有具維生素K活性的化合物，尤其是上述化合物。
類異戊二烯側鏈的生物合成始于異戊二烯焦磷酸酯(IPP)。IPP與其異構體二甲烯丙焦磷酸酯(DMAPP)相平衡。IPP與DMAPP首尾縮合產生單萜(C10)香葉基焦磷酸(GPP)。進一步添加IPP單元產生倍半萜(C15)焦磷酸法呢酯(FPP)和雙萜(C20)香葉基香葉焦磷酸酯(GGPP)。
葉綠醌含有C20葉綠基鏈，其中只有第一個異戊二烯單元含有雙鍵。GGPP通過香葉基香葉焦磷酸酯氧化還原酶(GGPPOR)轉化為葉綠基焦磷酸酯(PPP)，后者進一步形成生育酚的起始物質。
導致維生素E和K形成的混合的含異戊二烯基脂類的環結構為醌，其起始代謝物來自莽草酸路徑。
分支酸從赤蘚糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)開始，通過它們的縮合，經中間體3’-脫氫奎尼酸、3’-脫氫莽草酸、莽草酸、莽草酸-3-磷酸和5’-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸產生3-脫氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)而形成的。赤蘚糖-4-磷酸在卡爾文循環中形成，而PEP是通過糖原酵解提供的。
在高等植物中，酪氨酸是從分支酸開始，通過預苯酸和arogenate而形成的。芳族氨基酸酪氨酸轉化為羥基苯丙酮酸，后者通過雙加氧作用轉化為尿黑酸。
尿黑酸接下來結合葉綠基焦磷酸酯(PPP)或香葉基香葉焦磷酸酯以形成α-生育酚和α-生育三烯酸的前體，分別名為2-甲基-6-葉綠基-氫醌和2-甲基-6-香葉基香葉基氫醌。與作為甲基供體的S-腺苷甲硫氨酸的甲基化作用步驟首先產生2，3-二甲基-6-葉綠基醌醇，接下來環化產生γ-生育酚，并進一步甲基化產生α-生育酚。
通過過表達或下調生育酚合成路徑的生物合成基因來改變植物中的維生素E含量是公知的，為了本發明的目的，其中所述生育酚合成路徑理解為從羥基苯丙酮酸至生育酚的生物合成路徑。
WO 97/27285描述了通過提高生育酚表達或通過下調對羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)來改變生育酚含量。
WO 99/04622和D.DellaPenna等，科學(Science)1998，282，2098-2100描述了來自集胞藻屬(Synechocystis)PCC6803和擬南芥菜(Arabidopsisthaliana)的編碼γ-生育酚甲基轉移酶的基因序列，并描述了將其摻入轉基因植物，后者具改變的維生素E含量。
進一步公知在植物中通過過表達或下調類異戊二烯側鏈生物合成路徑的生物合成基因來改變維生素E含量。
WO 99/23231顯示了在轉基因植物中香葉基香葉還原酶的表達導致增加的生育酚生物合成。
WO 00/08169描述了編碼1-脫氧-D-木糖-5-磷酸合酶和香葉基香葉焦磷酸酯氧化還原酶的基因序列，并描述了將它們摻入轉基因植物，后者具改變的維生素E含量。
雖然所有這些方法產生的生物體尤其是植物具有改變的精細化學品維生素E的含量，但對于通過從轉基因生物體分離而產生維生素E的方法而言，維生素E含量水平仍經常不令人滿意。
本發明的一個目的是提供通過培養可產生精細化學品的生物體或轉基因生物體來產生精細化學品的進一步的方法，其中所述生物體或轉基因生物體具有不顯示上述現有技術缺點的優化特性。
我們發現該目的通過這樣一種產生精細化學品的方法而達到，其中培養其莽草酸路徑在野生型基礎上被遺傳改變的生物體。
為了本發明的目的，尤其是對高等植物而言，莽草酸路徑理解為始于D-赤蘚糖-4-磷酸，經莽草酸、分支酸、預苯酸、arogenate、酪氨酸直至并包括4-羥基苯丙酮酸的上述生物合成路徑(G.Michal，生物化學路徑，生物化學圖集(Biochemical pathways，Biochemie-Atlas)，SpektrumAkademischer Verlag Heidelberg，柏林，1999，59至60頁，圖4.7-1和第4.7.1章)。
優選地，為了本發明目的，將莽草酸路徑理解為從莽草酸至4-羥基苯丙酮酸的代謝路徑，尤其優選地理解為從分支酸至4-羥基苯丙酮酸的代謝路徑，在植物中該代謝路徑從分支酸經預苯酸、arogenate和酪氨酸而進行。
精細化學品理解為來自莽草酸路徑的生物體代謝產物。在此上下文中，莽草酸路徑如上所述始于D-赤蘚糖-4-磷酸并終止于4-羥基苯丙酮酸。對于這些代謝物而言，莽草酸路徑的起始化合物D-赤蘚糖-4-磷酸、終產物4-羥基苯丙酮酸以及所有上述中間體構成了由生物體生物轉化為代謝物的起始化合物，它們此后也稱為中間體。
優選的精細化學品為芳族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)、水楊酸衍生物、葉酸衍生物、類苯丙烷(如木素、木酚素或香豆素，尤其是莨菪亭或莨菪苷)、黃酮類化合物(如查耳酮、黃烷酮、黃烷醇、花色素或異黃酮類化合物)、1，2-二苯乙烯、呫噸酮或醌衍生物(如維生素E、維生素K、泛醌、塑體醌或紫草寧。
尤其優選的精細化學品為維生素E、維生素K或泛醌，尤其是維生素E。
根據莽草酸路徑的遺傳改變是否導致朝向形成莽草酸路徑之一部分的某一中間體的代謝物流量增加或減少，在生物體中由該中間體生物合成的精細化學品含量得以增加或減少。因此，莽草酸路徑的遺傳改變優選地理解為朝向莽草酸路徑中間體的代謝物流量的增加或減少。
導致朝向中間體的代謝物流量增加的莽草酸路徑的遺傳改變，以及由此對應的精細化學品的遺傳改變為下列方法A、B或CA提高野生型莽草酸路徑中至少一種酶的活性，例如通過過表達莽草酸路徑的編碼具該酶活性的蛋白質的基因，通過關閉導致中間體產生的代謝路徑的反向調節機制，如關閉反饋抑制或導入在目標生物體中不受調節的直向同源基因。
B向生物體中導入至少一種這樣的基因，對該基因而言在野生型中不存在直向同源基因且其橋接野生型莽草酸路徑的代謝路徑。例如，由于該新基因的功能，該基因可在橋接終止處引起朝向中間體的物質流量增加。
C滅活編碼這樣的酶的基因，該酶與產生目標產物的代謝路徑的酶競爭。
導致朝向中間體的代謝物流量減少的莽草酸路徑的遺傳改變，以及由此對應的精細化學品的遺傳改變為下列方法D、E或FD過表達一種代謝基因，并因此提高偏離該中間體的對應的酶活性；E滅活編碼形成該中間體的酶的基因，例如通過反義技術或共抑制來滅活；F表達這樣的基因，對該基因而言在野生型中不存在直向同源基因。例如該基因可橋接野生型的莽草酸路徑的代謝路徑，并且由于新基因的功能，該基因可引起朝向橋接中間體的物質流量減少。
在本發明方法的一個優選的實施方案中，生物體中莽草酸路徑的遺傳改變導致朝向目標中間體的代謝物流量增加，并因此增加了相應的目標精細化學品。
優選通過至少一種選自方法A和B的方法，也就是說通過方法A和/或B，增加朝向莽草酸路徑的目標中間體流量并因此增加目標精細化學品，方法A和B具有上述含義。
因此，本發明方法的一個優選實施方案包括進行至少一種選自A和B方法，用于遺傳改變莽草酸路徑，A和B具有下列含義A提高野生型莽草酸路徑的至少一種酶的活性；B將至少一種基因導入生物體，其中對該基因而言，在野生型中不存在其直向同源基因且其橋接野生型的莽草酸路徑的代謝路徑。
根據方法A可實現對野生型莽草酸路徑的至少一種酶活性的提高，例如通過過表達編碼具該酶活性的蛋白質的核酸即莽草酸路徑的基因，通過關閉導致中間體產生的代謝路徑的反向調節機制，如關閉反饋抑制或導入在目標生物體中不受調節的直向同源基因。
優選地，野生型莽草酸路徑的至少一種酶的活性是根據方法A通過過表達莽草酸路徑中編碼具該酶活性的蛋白質的核酸而提高的。
在本方法的一個優選實施方案中，方法A是通過向生物體導入編碼分支酸變位酶的核酸而進行的。
分支酸變位酶理解為具有將分支酸轉化為預苯酸的酶活性的蛋白質。
原則上，所有的分支酸變位酶均可用于本發明的方法中，如歐芹(Petroselinum Crispum)分支酸變位酶(登記號T14902，T14901)、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)分支酸變位酶(T36865)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)分支酸變位酶(A33894)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)分支酸變位酶(AAD30065)或下面描述的擬南芥菜分支酸變位酶或下面描述的大腸桿菌(E.coli)分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶(tyrA)的分支酸變位酶活性。
在一個優選的實施方案中，使用了編碼這樣的分支酸變位酶的分支酸變位酶基因，其中所述分支酸變位酶的活性在生物體中受到減輕的翻譯后調節。減輕的調節理解為與野生型的調節相比，對活性的調節為不超過99％，優選地不超過70％，尤其優選地為50％，特別優選地為0％，即對活性沒有調節。
編碼其活性在生物體中受到減輕的調節，尤其是不受到調節的分支酸變位酶的分支酸變位酶基因為例如在表達位點處受到減輕的翻譯后調節，尤其是不受到翻譯后調節的來自不同屬生物體的分支酸變位酶基因，或為來自相同生物體或來自相關屬生物體的分支酸變位酶基因。
根據本發明，生物體理解為原核生物或真核生物，如細菌、酵母、藻類、蘚類植物、真菌或植物，它們作為野生型或通過遺傳改變后可產生上述精細化學品。優選的生物體為光合活性生物體，如藍細菌、蘚類植物、藻類或植物，它們的野生型已能產生上述的精細化學品。
尤其優選的生物體為植物。
根據本發明方法的方法A的一個進一步優選的實施方案中，將編碼其活性受到減輕的翻譯后調節的分支酸變位酶的分支酸變位酶基因導入植物。
它們為例如一些細菌分支酸變位酶基因或由其衍生的分支酸變位酶基因，即為編碼這樣的蛋白質的核酸，其中所述蛋白質包含細菌分支酸變位酶的氨基酸序列，其活性在植物中受到減輕的翻譯后調節，如下面描述的編碼大腸桿菌分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶(tyrA)的分支酸變位酶活性的核酸或通過氨基酸的替換、插入或刪除而衍生于該序列的序列，后者在氨基酸水平上與細菌分支酸變位酶的序列具有至少30％的同源性，優選地至少50％的同源性，更優選地至少70％的同源性，尤其優選地至少90％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
在本說明書中，術語“替換”理解為用一個或多個氨基酸置換一個或多個氨基酸。優選進行所謂的保守置換，其中替換氨基酸具有與原始氨基酸類似的特性，如用Asp置換Glu、用Asn置換Gln、用Ile置換Val、用Ile置換Leu以及用Thr置換Ser。
刪除是用直接鍵替換氨基酸。優選的刪除位置為多肽的末端和獨立的蛋白質結構域之間的結合處。
插入為將氨基酸導入多肽鏈，直接鍵在形式上被一個或多個氨基酸替換。
兩個蛋白質間的同源性優選地理解為在全長蛋白質中氨基酸的一致性，其優選地通過比較，在程序算法GAP(UWGCG，University ofWisconsin，Genetic Computer Group)的輔助下設置下列參數來計算間隔權重12長度權重4平均匹配2.912平均不匹配 -2.003因此，在氨基酸水平上與上述大腸桿菌分支酸變位酶的序列具至少30％同源性的蛋白質應理解為這樣的蛋白質，將其序列與上述分支酸變位酶的序列優選地使用上述程序算法，用上面設置的參數進行比較，結果為具有至少30％的同源性。
細菌分支酸變位酶基因或由其衍生的分支酸變位酶基因也可編碼具有分支酸變位酶特性和其它酶特性的蛋白質，如下述來自大腸桿菌K12的分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因(tyrA)。如下所述，當組合進行方法A和B時該實施方案是尤其優選的。
在本發明方法的方法A的一個尤其優選的實施方案中，尤其是當只進行方法A時，將分支酸變位酶基因導入生物體的特定位點，在該位點處，相應的分支酸變位酶受到減輕的翻譯后調節。
在此上下文中，優選使用在表達位點處受到減輕的翻譯后調節的來自相同生物體或來自相關屬生物體的編碼分支酸變位酶的核酸。
分離自生物體不同部位的分支酸變位酶同工型在它們的調節方面是不同的。
可將來自生物體或相關屬生物體特定部位的相應分支酸變位酶基因導入編碼的分支酸變位酶不受到翻譯后調節的生物體的其它部位。
在植物中本發明方法的一個尤其優選的實施方案為將編碼植物胞質分支酸變位酶的核酸導入植物質體來實施方法A。
原則上適用于此目的的核酸為編碼植物胞質分支酸變位酶的所有核酸，優選地為編碼擬南芥菜胞質分支酸變位酶的核酸(Seq ID No.3)和由其衍生的天然或非天然核酸。
已發現在多種生物體中，存在多種同工型的分支酸變位酶。因此從擬南芥菜分離了三種不同的分支酸變位酶(Eberhard等，1993，FEBS 334，233-236；Eberhard等，1996，植物雜志(Plant J.)10，815-821；Mobley等，1999，基因(Gene)15；240(1)115-123)。
這些同工型在它們的定位和它們的酶特性方面相互間是不同的。這樣，分支酸變位酶-1位于質體且通過芳族氨基酸變構調節。
胞質同工酶分支酸變位酶-2受到未知的調節(Benesova，M.Bode，R，植物化學(Phytochemistry)1992，31，2983-2987)。
編碼擬南芥菜胞質分支酸變位酶的核酸以及由其衍生的天然或非天然核酸應理解為編碼這樣的蛋白質的核酸，其中所述蛋白質包含胞質分支酸變位酶氨基酸序列(SEQ ID No.4)，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，優選地至少50％的同源性，更優選地至少70％的同源性，尤其優選地至少90％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
因此，在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.4具有至少30％同源性的蛋白質應理解為這樣的蛋白質，通過將其序列與序列SEQ ID No.4優選地使用上述程序算法，用上面設置的參數進行比較，結果為具有至少30％的同源性。
在本發明方法的另一優選的實施方案中，將編碼擬南芥菜胞質分支酸變位酶(SEQ ID No.4)的核酸導入植物的質體。
例如可根據遺傳密碼通過反向翻譯多肽序列獲得合適的核酸序列。
為此目的優選使用的密碼子為那些根據植物特異的密碼子使用而頻繁使用的密碼子。通過參考計算機對所研究植物的其它已知基因的估定易于確定密碼子使用。
在本發明方法的一個進一步尤其優選的實施方案中，將序列SEQ ID No.3的核酸導入植物質體。序列SEQ ID No.3代表擬南芥菜胞質分支酸變位酶(分支酸變位酶-2)基因。
將編碼分支酸變位酶的核酸導入植物質體可如如下詳述的將分支酸變位酶預苯酸脫氫酶導入植物那樣通過導入表達盒而進行，其中表達盒中的核酸序列編碼分支酸變位酶融合蛋白質，融合蛋白質中的一部分為支配該多肽轉運的轉運肽。優選葉綠體特異的轉運肽，其在將胞質分支酸變位酶轉運至葉綠體后，被從分支酸變位酶部分酶切掉。
在本發明方法的一個進一步尤其優選的實施方案中，將這樣的核酸構建體導入植物，其中所述核酸構建體包含編碼質體轉運肽的核酸和包含編碼以下蛋白質的核酸，該蛋白質包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
編碼質體轉運肽的核酸為例如在三個閱讀框中的煙草質體轉酮醇酶的質體轉運肽的三個盒的DNA序列，它們為在NcoI切割位點處具有ATG密碼子的KpnI/BamHI片段pTP09KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGATCC_BamHIpTP10KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTGGATCC_BamHIpTP11KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGGATCC_BamHI，或為編碼擬南芥菜質體分支酸變位酶-1的質體轉運肽的核酸(SEQ ID No.7)KpnI_GGCGTCATTGTTGATGAGATCGTCTTGTTGCTCCTCTGCGATTGGTGGGTTCTTCGACCATCGACGTGAATTATCAACCTCAACACCCATTTCCACTCTTCTTCCTCTTCCATCAACCAAATCTTCTTTCTCTGTTCGTTGTTCTCTTCCTCAGCCATCAAAGCCACGCTCTGGAACCAGCTCTGTTCACGCCGTTATGACACTCG_NCo1編碼擬南芥菜質體分支酸變位酶-1的質體轉運肽的核酸優選地用于胞質分支酸變位酶在質體中的定位。
因此，在本發明方法的一個進一步尤其優選的實施方案中，將這樣的核酸構建體導入植物，其中所述核酸構建體包含編碼擬南芥菜質體分支酸變位酶-1的質體轉運肽的核酸和包含編碼以下蛋白質的核酸，該蛋白質包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
在本發明方法的方法A的一個尤其優選的實施方案中，將包含序列(SEQ ID No.5)的核酸構建體導入植物。
SEQ ID No.5構成了編碼擬南芥菜質體分支酸變位酶-1的質體轉運肽的核酸和編碼擬南芥菜胞質分支酸變位酶-2的核酸的核酸構建體。
本申請尤其涉及這些核酸構建體，并涉及它們在本發明方法的方法A中的應用。


圖1以舉例的方式示出了從赤蘚糖-4-磷酸至維生素E的生物合成示意圖。由于分支酸變位酶基因增加的表達，野生型的莽草酸路徑被遺傳改變，且朝向羥基苯丙酮酸的代謝物流量增加。對于羥基苯丙酮酸，現在可得到較大量的，其進一步朝向生育酚反應。提高的羥基苯丙酮酸含量導致向維生素E和/或維生素K的轉化提高。提高的羥基苯丙酮酸含量優選地導致增加的維生素E含量。
如下詳述的那樣構建表達盒使用如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA LaboratoryManual)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合實驗(Experiments with Gene Fusions)，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1984)以及Ausubel，F.M.等，分子生物學最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)中所述的常規重組和克隆技術將合適的啟動子與合適的分支酸變位酶核酸序列融合，且優選地將編碼質體轉運肽的核酸插入啟動子和分支酸變位酶核酸序列之間，即優選地將合適的啟動子與合適的上述核酸構建體并與聚腺苷酸化信號融合。
用于改變野生型莽草酸路徑的方法B如上所述通過將至少一種這樣的基因導入生物體而進行，所述基因在野生型中不存在其直向同源基因且其橋接野生型莽草酸路徑的代謝路徑。該基因編碼這樣的酶，由于新的酶活性，該酶引起朝向橋接終止處的中間體的物質流量增加。該新的酶活性優選地不受生物體的調節，也就是說使代謝路徑短路，以避免如在代謝中的限制性調節位置。這使得可以將朝向限速物質的代謝物流量與現存的調節解偶聯。
與野生型直向同源的基因理解為來自另一生物體的基因，該基因所編碼的酶活性在野生型中已存在。
因此，表述“在野生型中不存在其直向同源基因的基因”理解為來自另一生物體的基因，在轉化前該基因所編碼的酶活性不存在于野生型中或未被活化。
與野生型直向同源的基因優選地理解為來自另一生物體的功能等同物，功能等同物理解為基因產物(蛋白質)的全部特性。
因此，表述“在野生型中不存在其直向同源基因的基因”優選地理解為在野生型中該基因不存在上面定義的功能等同物，因此建立了產生替代代謝路徑的代謝性能，用來產生已存在于植物中的產物(包括代謝物)。
根據本發明，如上所述的用于方法A的生物體理解為原核生物體或真核生物體，如細菌、酵母、藻類、蘚類植物、真菌或植物，它們作為野生型或通過遺傳改變后可產生上述精細化學品。優選的生物體為光合活性生物體，如藍細菌、蘚類植物、藻類或植物，它們的野生型已能產生上述的精細化學品。
尤其優選的生物體為植物。
因此，在本發明方法的一個尤其優選的實施方案中，將植物用作欲轉化的生物體。在這種情況下，基因為細菌基因，該基因在優選地適于進行方法B的植物中不存在其直向同源基因。
在本發明方法的方法B的一個優選的實施方案中，該植物莽草酸路徑的代謝路徑被至少一種導入的基因橋接。
在本發明方法的方法B的一個尤其優選的實施方案中，將編碼預苯酸脫氫酶的核酸導入植物。編碼預苯酸脫氫酶的所有基因均適用于本發明方法的該優選實施方案。
預苯酸脫氫酶理解為具有將預苯酸轉化為4-羥基苯丙酮酸酶活性的酶。
編碼預苯酸脫氫酶且可用于本發明方法的核酸的實例為來自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)(存取號X78413)、集胞藻屬spec PCC 6803(slr2081)、恐獸球菌(Deinococcus radiodurans)(AAF10695)或枯草芽孢桿菌(P20692)的預苯酸脫氫酶基因，這些基因均是已知的，且可從國際互聯網數據庫中得到。通過將序列與這些已知的預苯酸脫氫酶基因進行同源性比較，可發現其它的例子，如來自Termotoga maitima(AAD35430)或幽門螺旋體(Heliobacter pylori)26695(存取號AAD08422)的潛在預苯酸脫氫酶基因。
在本發明方法的一個優選的實施方案中，使用了預苯酸脫氫酶基因，導入的是這樣的核酸，其編碼的蛋白質包含集胞藻屬spec PCC 6803預苯酸脫氫酶的氨基酸序列，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與集胞藻屬spec PCC 6803預苯酸脫氫酶的序列具有至少30％的同源性，優選地至少50％的同源性，更優選地至少70％的同源性，尤其優選地至少90％的同源性，且其具有預苯酸脫氫酶的酶特性。
因此，在氨基酸水平上與集胞藻屬spec PCC 6803預苯酸脫氫酶的序列具至少30％同源性的蛋白質應理解為這樣的蛋白質，將其序列與集胞藻屬spec PCC 6803預苯酸脫氫酶的序列優選地使用上述程序算法，用上面設置的參數進行序列比較，顯示出具有至少30％的同源性。
圖1以舉例的方式示出了從赤蘚糖-4-磷酸至生育酚的生物合成示意圖。由于預苯酸脫氫酶基因增加的額外表達，野生型的莽草酸路徑被遺傳改變，且朝向羥基苯丙酮酸的代謝物流量增加。對于羥基苯丙酮酸，現在可得到較大量的，其進一步朝向生育酚反應。提高的羥基苯丙酮酸含量導致向維生素E和/或維生素K的轉化提高。提高的羥基苯丙酮酸含量優選地導致增加的維生素E含量。
但根據需要，將本發明代謝路徑的橋接與莽草酸路徑過表達的其它酶結合是有利的，目的在于達到使朝向形成目標精細化學品的代謝物流量增大。
在本發明方法的一個進一步優選的實施方案中，將方法A和B結合使用。
在本發明方法變體的一個尤其優選的實施方案中，將編碼預苯酸脫氫酶的核酸與編碼分支酸變位酶的核酸組合導入植物。
例如，這種組合可通過導入兩種核酸而實現，其中兩種核酸分別編碼具分支酸變位酶活性的酶和具預苯酸脫氫酶活性的酶。對于這種實施方案，需要將兩種不同的核酸導入植物，其中每一種核酸編碼這些酶之一。
在本發明方法的一個尤其優選的實施方案中，這種組合是通過將一種編碼分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸導入植物而實現的。
分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因編碼的蛋白質具有分支酸變位酶和預苯酸脫氫酶兩者的酶特性。因此導入一種核酸過表達酶活性，或導入酶活性，其受到減輕的翻譯后調節(分支酸變位酶)且酶特性(預苯酸脫氫酶)被新導入。
分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶理解為具有將分支酸轉化為4-羥基苯丙酮酸的酶活性的酶。
在本發明方法變體的一個進一步尤其優選的實施方案中，將這樣的核酸導入，其編碼的蛋白質包含氨基酸序列SEQ ID No.2，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.2具有至少30％的同源性，優選地至少50％的同源性，更優選地至少70％的同源性，尤其優選地至少90％的同源性，且其具有分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的酶特性。
具有氨基酸序列SEQ ID No.2的蛋白質構成了大腸桿菌K12分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶(tyrA)。
因此，在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.2具有至少30％同源性的蛋白質應理解為這樣的蛋白質，將其序列與序列SEQ ID No.2優選地使用上述程序算法，用上面設置的參數進行序列對比，結果為具有至少30％的同源性。
本說明書中所提及的所有核酸例如可為RNA、DNA或cDNA序列。
可如上所述根據遺傳密碼通過反向翻譯多肽序列獲得合適的核酸序列。
為此目的優選使用的密碼子為那些根據生物體特異的密碼子使用而頻繁使用的密碼子。通過參考計算機對所研究生物體的其它已知基因的估定易于確定密碼子使用。
例如，如果該蛋白質欲在植物中表達，通常有利地使用植物的密碼子使用來進行反向翻譯。
進一步優選的分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶或編碼它們的核酸尤其為細菌來源的核酸，如來自草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)的分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因(存取號X60420；其蛋白質也可通過刪除5’末端的109 Bp區域而轉換為單功能的預苯酸脫氫酶，然后例如如上所述用作預苯酸脫氫酶)或來自支氣管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)的分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因(存取號AAF01289)，或易于從數據庫中對多種基因組序列已知的生物體通過將其氨基酸序列或其對應的反向翻譯的核酸序列與SEQ ID No.2或上述其它序列如來自揚氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的潛在分支酸變位酶一預預苯酸脫氫酶基因(存取號Q58029)進行同源性比較而鑒定。
尤其優選使用的核酸編碼細菌分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶。
尤其優選使用的核酸具有序列SEQ ID No.1。這種核酸構成了原核大腸桿菌K12基因組DNA，其編碼具序列SEQ ID No.2的分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶，也稱為tyrA基因。
圖1以舉例的方式示出了從赤蘚糖-4-磷酸至生育酚的生物合成示意圖。由于分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因增加的表達，野生型的莽草酸路徑被遺傳改變，且朝向形成羥基苯丙酮酸的代謝物流量增加。對于羥基苯丙酮酸，現在可得到較大量的，其進一步朝向生育酚反應。提高的羥基苯丙酮酸含量導致向維生素E和/或維生素K的轉化提高。提高的羥基苯丙酮酸含量優選地導致增加的維生素E含量。
在本發明的用于產生精細化學品的方法中，優選地在培養轉基因生物體的步驟后，收獲該生物體并從生物體分離精細化學品。
生物體用適于生物體的已知方式收獲。在液體營養培養基中通過發酵培養的微生物(如細菌、蘚類植物、酵母和真菌)或植物細胞可例如通過離心、傾析或過濾而分離。以已知方式在營養基質上培養植物并收獲。
從收獲的生物量中以已知方式分離精細化學品，例如通過提取，并且如果合適的話，采用進一步的化學或物理的純化方法，如沉淀法、結晶法、熱分離法(如精餾法)或物理分離法如層析法。
例如，優選地從含油植物中通過化學轉化和蒸餾從植物油或從蒸汽蒸餾物(除臭劑冷凝物)中分離維生素E，其中所述蒸汽蒸餾物在植物油的除臭過程中獲得。
從除臭劑冷凝物分離維生素E的其它方法例如在DE 31 26 110 A1，EP 171 009 A2，GB 2 145 079，EP 333 472 A2和WO 94/05650中進行了描述。
優選地通過用包含上述核酸尤其是包含編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸的核酸構建體或用上述核酸構建體，尤其是編碼質體轉運肽和胞質分支酸變位酶的核酸構建體轉化起始生物體(尤其是植物)來產生轉基因生物體(尤其是植物)。
將編碼核酸序列或編碼核酸構建體功能性連接至一個或多個調節信號的這些核酸構建體以下也稱為表達盒，其中所述一個或多個調節信號確保在生物體尤其是在植物中的轉錄和翻譯。
因此，本發明還涉及這樣的核酸構建體，其充當表達盒角色并包含與一個或多個確保在生物體尤其是在植物中轉錄和翻譯的調節信號功能性連接的上述核酸，尤其是編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸，或上述核酸構建體，尤其是編碼質體轉運肽和胞質分支酸變位酶的核酸構建體。
表達盒優選地包含確保在質體中定位的編碼質體轉運肽的核酸。
表達盒包含調節信號，也稱為調節核酸序列，其支配編碼序列在宿主細胞中的表達。根據一個優選的實施方案，表達盒包含上游序列(即在編碼序列的5’末端、啟動子)和下游序列(即在3’末端、聚腺苷酸化信號)，且如果合適的話，還包含其它可操作地與插入的編碼序列連接的調節元件，其中所述編碼序列至少為上述基因之一。可操作地連接應理解為啟動子、編碼序列、終止子的依次排列，且如果合適的話，還有以這種方式排列的其它調節元件，其中當表達編碼序列時，每一調節元件可行使其預期功能。
下文以舉例的方式描述了優選的核酸構建體、植物表達盒和產生轉基因植物的方法。
優選的用于可操作連接的序列為(但不限于)確保在質外體、液泡、質體、線粒體、內質網(ER)、核、油質體或其它區室中進行亞細胞定位的靶向序列以及翻譯增強子如煙草花葉病毒5’前導序列(Gallie等，核酸研究(Nucl.Acids Res.)15(1987)，8693-8711)。
合適的表達盒啟動子原則上為任一可支配外源基因在植物中表達的啟動子。優選地使用植物啟動子或來自植物病毒的啟動子。尤其優選花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子(Franck等，細胞(Cell)21(1980)，285-294)。如所知的那樣，該啟動子包含多個轉錄效應子的識別序列，它們總體上導致了插入基因的永久性和組成型表達(Benfey等，EMBO J.8(1989)，2195-2202)。
表達盒也可包含化學誘導型啟動子，這種啟動子可使植物中外源tyrA基因及時地在特定點表達。可使用的此類啟動子的實例尤其為PRP1啟動子(Ward等，植物分子生物學(Plant.Mol.Biol.)22(1993)，361-366)、水楊酸誘導的啟動子(WO 95/19443)、苯磺酰胺誘導的啟動子(EP-A 388186)、四環素誘導的啟動子(Gatz等，(1992)植物雜志(Plant J.)2，397-404)、脫落酸誘導的啟動子(EP-A 335528)或乙醇-或環己酮-誘導的啟動子(WO93/21334)。
進一步地，優選的啟動子尤其為那些確保在以下組織或植物器官中表達的啟動子，其中例如精細化學品尤其是維生素E或其前體的生物合成在該組織或植物器官中進行。必須提及的啟動子尤其是那些確保在葉中特異性表達的啟動子。可提及的啟動子為馬鈴薯胞質FBPase啟動子或馬鈴薯ST-LSI啟動子(Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-245)。
在轉基因煙草植物的種子中，在種子特異的啟動子協助下外源蛋白質可占總可溶種子蛋白質0.67％的穩定表達(Fiedler和Conrad，生物/技術(Bio/Technology)10(1995)，1090-1094)。因此表達盒可包含例如種子特異的啟動子(優選菜豆蛋白啟動子(US 5504200)、USP啟動子(Baumlein，H.等，分子普通遺傳學(Mol.Gen.Genet.)(1991)225(3)，459-467)、LEB4啟動子(Fiedler和Conrad，1995)、蔗糖結合蛋白啟動子(Zitat))、LEB4信號肽、欲表達基因和ER滯留信號。
使用如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，基因融合實驗，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1984)以及Ausubel，F.M.等，分子生物學最新方法，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)中所述的常規重組和克隆技術，通過例如將合適的啟動子與合適的上述核酸序列尤其是編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸序列并與聚腺苷酸化信號融合來產生表達盒，且優選地在啟動子和核酸序列之間插入核酸，且該核酸編碼葉綠體特異的轉運肽。
如上所述用于分支酸變位酶的、確保其靶向質體的插入序列是尤其優選的。
也可使用其核酸序列編碼融合蛋白的表達盒，尤其是編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶融合蛋白的表達盒，融合蛋白的一部分為支配多肽轉運的轉運肽。優選葉綠體特異的轉運肽，其在蛋白質尤其是分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶已轉運至葉綠體后被從蛋白質部分尤其是分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶和/或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶部分酶切下來。尤其優選來自煙草(Nicotiana tabacum)質體轉酮醇酶的轉運肽或其它轉運肽(如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞單位轉運肽，或鐵氧還蛋白NADP氧化還原酶轉運肽和異戊二烯焦磷酸酯異構酶-2轉運肽)或它們的功能等同物。
質體分支酸變位酶的轉運肽或其編碼核酸尤其優選地應用于上述胞質分支酸變位酶或編碼胞質分支酸變位酶的核酸。
本發明另一尤其優選使用的核酸為在三個閱讀框中的煙草質體轉酮醇酶的質體轉運肽的三個盒的DNA序列，它們為在NcoI切割位點處具有ATG密碼子的KpnI/BamHI片段pTP09KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGATCC_BamHIpTP10KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGCTGGATCC_BamHIpTP11KpnI_GGTACCATGGCGTCTTCTTCTTCTCTCACTCTCTCTCAAGCTATCCTCTCTCGTTCTGTCCCTCGCCATGGCTCTGCCTCTTCTTCTCAACTTTCCCCTTCTTCTCTCACTTTTTCCGGCCTTAAATCCAATCCCAATATCACCACCTCCCGCCGCCGTACTCCTTCCTCCGCCGCCGCCGCCGCCGTCGTAAGGTCACCGGCGATTCGTGCCTCAGCTGCAACCGAAACCATAGAGAAAACTGAGACTGCGGGGATCC_BamHI質體轉運肽的另一實例為擬南芥菜質體異戊烯焦磷酸異構酶-2(IPP-2)的轉運肽。
本發明的核酸，尤其是編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸，可合成獲得或天然獲得，或可包含合成核酸和天然核酸的組成或可由多種生物體的多個異源基因片段組成。
如上所述優選的為合成的核苷酸序列，其中的密碼子是為植物所優選的。為植物所優選的密碼子可從在大多數感興趣的植物種類中具最高蛋白質頻率的密碼子來確定。
當制備表達盒時，可按順序操作多個DNA片段，以獲得便于以正確的方向讀出并具有正確閱讀框的核苷酸序列。為進行DNA片段相互間的連接，可將銜接子或接頭加至片段上。
可方便地將包含一個或多個限制性位點的接頭或多接頭以轉錄方向提供給啟動子和終止子區域，用于該序列插入。通常，接頭具1至10個，在大多數情況下為1至8個，優選地具2至6個限制性位點。通常在調節區域的接頭大小為小于100bp，通常小于60bp，但至少為5bp。啟動子可為宿主植物自身的或同源的啟動子，或為外源的或異源啟動子。按轉錄的5’-3’方向，表達盒優選地包含啟動子、編碼核酸序列或核酸構建體，以及轉錄終止區域。不同的終止區域可如所希望的那樣相互交換。
而且，可進行提供合適限制性切割位點或去除過量DNA或限制性切割位點的操作。體外誘變、引物修補、限制或連接可用于插入、刪除或替換，并適用于如堿基轉換或顛換。
可提供片段的互補末端用于連接，可進行適當的操作如限制、外切或填平突出端形成平末端。
優選的聚腺苷酸化信號為植物聚腺苷酸化信號，優選那些基本上對應于根瘤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的聚腺苷酸化信號，尤其是Ti質粒pTiACH5的T-DNA基因3(章魚堿合酶)的聚腺苷酸化信號(Gielen等，EMBO J.3(1984)，835往后)或其功能等同物。
本發明還涉及上述核酸尤其是編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸，或上述核酸構建體，或蛋白質的用途，用于產生轉基因植物。
優選地，這些轉基因植物中精細化學品尤其是泛醌、維生素E和/或維生素K，優選地維生素E的含量較野生型相比提高了。
已知具高維生素E含量的植物對非生物應力的抗性增加。非生物應力理解為如低溫、霜、干旱、高溫和鹽。
本發明因此還涉及上述核酸的用途，用于產生對非生物應力的抗性高于野生型的轉基因植物。
上述蛋白質和核酸可用于在轉基因生物體中產生精細化學品，優選地在轉基因植物中產生維生素E、維生素K和/或泛醌，尤其是用來產生維生素E。
將外源基因轉移入生物體的基因組尤其是植物的基因組稱為轉化。在植物中，尤其是由植物組織或植物細胞轉化和再生植物的公知方法可用于瞬時或穩定轉化。
用于轉化植物的合適方法為通過聚乙二醇誘導DNA攝入的原生質體轉化法、使用基因槍的生物彈射擊法-所謂的粒子轟擊法、電穿孔法、在含DNA的溶液中培育干燥胚、顯微注射法和上述農桿菌介導的基因轉移。上述方法例如在S.D.Kung和R.Wu編輯，Academic Press(1993)出版的轉基因植物(Transgenic Plants)一書的第1卷，設計和應用(Engineering andUtilization)中的B.Jenes等，基因轉移技術(Techniques for GeneTransfer)，128-143，以及在Potrykus，植物生理學和植物分子生物學年鑒(Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.)42(1991)，205-225中進行了描述。
優選地將欲表達的構建體克隆入適用于轉化根瘤農桿菌的載體，如pBin19(Bevan等，核酸研究12(1984)，8711)。
因此，本發明還涉及包含上述核酸、核酸構建體或表達盒的載體。
用表達盒轉化的農桿菌可使用已知的方式轉化植物，如將劃破的葉或葉部分置于農桿菌溶液，并接下來在合適的培養基中培養它們。
表達盒不僅可用于轉化植物，也可用于轉化細菌尤其是藍細菌、蘚類植物、酵母、絲狀真菌和藻類。
至于遺傳改變的植物(以下也稱為轉基因植物)的優選產生方法，優選地將編碼本發明蛋白質尤其是分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的融合表達盒克隆入如適于轉化根瘤農桿菌的pBin19載體。
用此載體轉化的農桿菌接下來可使用已知的方式轉化植物，尤其是轉化培育植物，如將劃破的葉或葉部分置于農桿菌溶液，并接下來在合適的培養基中培養它們。
用農桿菌轉化植物的方法是已知的，如F.F.White“在高等植物中用作基因轉移的載體(Vectors for Gene Transfer in Higher Plants)”一文中所述的方法(參見S.D.Kung和R.Wu編輯，Academic Press(1993)出版的轉基因植物一書的第1卷，設計和應用，15-38頁)。可用公知方式從劃破的葉或葉部分的轉化細胞再生包含了整合入表達盒的用于表達本發明基因尤其是編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸的轉基因植物。
為了用編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸轉化宿主植物，將表達盒作為插入部分摻入重組載體，其中重組載體的載體DNA包含其它功能調節信號如包含用于復制或整合的序列。合適的載體尤其在“植物分子生物學和生物技術中的方法(Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology)”(CRC Press)，第6/7章，71-119頁(1993)中進行了描述。
例如可將植物表達盒摻入具35S啟動子的轉化載體pBin-19的衍生物中(Bevan，M.，核酸研究，128711-8721(1984))。圖2示出了具種子特異性豆球蛋白B4啟動子的轉化載體pBin-19的衍生物。
使用上述引用的重組和克隆技術，可將表達盒克隆入使得它們復制的合適載體中，例如在大腸桿菌中合適克隆載體的實例為pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。在大腸桿菌和農桿菌中均可復制的雙元載體尤其適用。
本發明因此涉及上述核酸的用途，尤其是涉及編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸的用途，涉及上述核酸構建體的用途，尤其涉及用于產生遺傳改變植物的表達盒或用于轉化植物、植物細胞、植物組織或植物部分的表達盒的用途。優選的使用目的是增加植物或植物部分的精細化學品含量，尤其是維生素E、維生素K或泛醌的含量，優選地增加維生素E的含量。
根據對啟動子的選擇，表達可特異地發生在植物的葉、種子、花瓣或其它部分中。
因此，本發明還涉及通過將上述核酸或上述核酸構建體導入起始生物體基因組用來產生遺傳改變的生物體的方法。
本發明優選地涉及轉化植物的方法，其包括將含有編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸序列的表達盒導入植物細胞或植物原生質體，并再生它們以產生完整的植物。
本發明還涉及遺傳改變的生物體，涉及改變野生型莽草酸路徑的代謝物流量的遺傳改變并涉及野生型的精細化學品含量改變的生物體的精細化學品含量。
如上所述，優選的遺傳改變生物體的精細化學品尤其是維生素E、維生素K和泛醌，優選地維生素E的含量較野生型的含量升高。
遺傳改變的生物體根據本本發明理解為尤其是其中進行了遺傳改變的生物體，當起始生物體包含所討論的核酸時，該遺傳改變使得相對于野生型而言，編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸的基因表達提高，或當起始生物體不包含所討論的核酸時，該遺傳改變使得相對于野生型而言，引起了野生型進行編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸的基因表達。
在一個優選的實施方案中，如上所述將光合活性生物體如藍細菌、蘚類植物、藻類或植物，尤其優選地植物用作起始生物體，并因此也作為遺傳改變的生物體，作為用于產生其精細化學品含量較野生型升高的生物體。
此類轉基因植物、它們的增殖物質以及它們的植物細胞、植物組織或植物部分是本發明的進一步的對象。
用于本發明目的的植物尤其為單子葉植物和雙子葉植物。
優選的植物為萬壽菊、向日葵、擬南芥屬(Arabidopsis)、煙草、紅胡椒、大豆、番茄、茄子、紅胡椒(bell pepper)、胡蘿卜、馬鈴薯、玉米、saladings和甘藍、谷物、苜蓿、燕麥、大麥、裸麥、小麥、黑小麥、高梁和小米、稻子、苜蓿、亞麻、棉花、大麻、十字花科如油料種子油菜或蕓苔、sugarbeet、甘蔗、堅果和葡萄藤類或木材類如白楊或紫杉。
尤其優選的植物為擬南芥菜、萬壽菊(Tagetes erecta)、歐洲油菜(Brassica napus)、煙草、蕓苔、馬鈴薯和其它油料作物如大豆。
遺傳改變的生物體，尤其是植物可如上所述用于產生精細化學品，尤其是用于產生維生素E、維生素K和泛醌。
根據本發明的遺傳改變植物可如直接或在以公知的方式加工后用作食品或飼料，該遺傳改變的植物可為人或動物消費，且其具有增高的精細化學品含量，尤其是增高的維生素E、泛醌和/或維生素K，優選地維生素E含量。
增高的精細化學品含量是指為了本發明目的，這些化合物在植物中的生物合成與未被遺傳改變的植物中至少一代植物相比，前者具有人工獲得的提高的生物合成的能力。
增高的維生素E含量通常是指總生育酚含量的增高。但增高的維生素E含量也理解為尤其是指上述8種具生育酚活性的化合物的含量改變。
例如，將分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因導入植物令人吃驚地導致生育三烯酸含量的明確增高。
當維生素E含量增高時，生育酚含量或生育三烯酸含量均可增高。優選地升高生育酚含量。但在某些情況下，也優選地升高生育三烯酸含量。
例如，維生素E的生物合成位點在植物中尤其為葉組織，因此本發明核酸尤其是編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸的葉特異性表達是有意義的。但這不構成限制，因為表達也可以組織特異性方式在植物的所有其它部分尤其是含脂肪的種子中進行。
一個進一步優選的實施方案因此涉及本發明核酸尤其是編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸的種子特異性表達。
此外，外源的分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因的組成型表達是有利的。另一方面，也希望進行誘導型表達。
可例如在體外通過枝條分生組織增殖測定重組表達的分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因的表達效率。另外，可在溫室實驗中對被測試植物測試分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因性質和表達水平的改變以及它們對維生素E生物合成的影響。
本發明現在通過下面的實施例闡述，但不限于這些實施例一般實驗條件重組DNA的序列分析用Licor激光熒光DNA測序儀(可從MWG Biotech，Ebersbach得到)，使用Sanger法對重組DNA分子進行測序(Sanger等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)74(1977)，5463-5467)。
實施例1-編碼大腸桿菌K12分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的tyrA基因的克隆從大腸桿菌K12用正義特異性引物(tyrA5’SEQ ID No.10)和反義特異性引物(tyrA3’SEQ ID No.9)通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增編碼tyrA基因的DNA。
PCR條件如下在50μl反應混合物中進行PCR，其中所述反應混合物中包含- 2μl大腸桿菌K12細胞懸液- 0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP
-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol tyrA5’-40pmol tyrA3’-15μl 3.3×rTth DNA聚合酶XL緩沖液(PE AppliedBiosystems)-5U rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下列循環條件下進行PCR步驟194℃5分鐘(變性)步驟294℃3秒步驟355℃1分鐘(退火)步驟472℃2分鐘(延伸)步驟2至4重復30次步驟572℃10分鐘(后延伸)步驟64℃(等候)用標準方法將擴增子克隆入PCR克隆載體pGEM-T(Promega)。所產生的擴增子通過用M13F(-40)引物進行測序鑒定。
實施例2-產生包含編碼大腸桿菌K12分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的tyrA基因的表達盒產生在組成型CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子(Franck等，細胞(Cell)21285-294，1980)控制下表達大腸桿菌K12分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的轉基因煙草和擬南芥菜植物。所產生的用于組成型表達大腸桿菌K12分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的質粒基礎為pBinAR-TkTp-10(RalfBadur，博士論文，University of Gttingen，1998)。該載體為pBinAR的衍生物(Hfgen和Willmitzer，植物科學(Plant Sci.)66221-230，1990)，其包含CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子(Franck等，1980)、章魚堿合酶基因的終止信號(Gielen等，EMBO J.3835-846，1984)和編碼煙草質體轉酮醇酶的轉運肽的DNA序列。將大腸桿菌K12分支酸變位酶預苯酸脫氫酶以正確的閱讀框克隆入該載體，產生分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶與質體轉運肽的翻譯融合。它可使轉基因轉運入質體。
為構建該質粒，用側翼的SmaI或SalI限制性切割位點將tyrA基因從質粒pGEM-T/tyrA分離。用標準方法將該片段連接入SmaI/SalI切割的pBinAR-TkTp-10(見圖2)。該質粒(pBinAR-TkTp-10/tyrA)用于產生轉基因煙草和擬南芥菜(A.thaliana)植物。
在圖2中的片段A(529 bp)包含CaMV 35S啟動子(花椰菜花葉病毒的核苷酸6909至7437)，片段B(245bp)編碼煙草轉酮醇酶的轉運肽，片段C(1232Bp)編碼大腸桿菌K12 tyrA基因，且片段D(219Bp)編碼章魚堿合酶基因的終止信號。
實施例3-產生用于表達位于種子特異的啟動子控制下的大腸桿菌K12分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸構建體為了構建嵌合的DNA構建體，用來產生表達位于種子特異的啟動子控制下的大腸桿菌K12分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的轉基因擬南芥菜、煙草和歐洲油菜植物核酸構建體，使用了載體pPTVkanLeP-IPP-TP-9。
該載體為pGPTVkan的衍生物(D.Becker，E.Kemper，J.Schell，R.Masterson.植物分子生物學(Plant Molecular Biology)201195-1197，1992)，其uidA基因已刪除。取而代之的是，載體pPTVkanLeP-IPP-TP-9包含豆球蛋白B4基因的種子特異的啟動子(Kafatos等，核酸研究，14(6)2707-2720，1986)、編碼擬南芥菜質體特異的異戊二烯焦磷酸酯異構酶-2(IPP-2)轉運肽的序列(Badur，未公開發表)以及根瘤農桿菌胭脂堿合酶的終止信號(Depicker等，分子應用遺傳學雜志(J.Mol.Appl.Genet.)1，561-73，1982)。
將編碼大腸桿菌K12 tyrA的核酸片段以用T4聚合酶補平的具鈍末端的SmaI/SalI片段克隆入載體pPTVkanLeP-IPP-TP-9(圖3)，產生具IPP-2轉運肽的翻譯融合。這樣確保了分支酸變位酶-預預苯酸脫氫酶輸入質體。該質粒(pPTVkanLeP-IPP-TP-9/TyrA)用于產生轉基因煙草、擬南芥菜和歐洲油菜植物。
在圖3中，片段A(2700bp)包含蠶豆(Vicia faba)豆球蛋白B4基因的啟動子，片段B(206bp)編碼擬南芥菜異戊烯焦磷酸異構酶-2的轉運肽，片段C(1234bp)編碼大腸桿菌K12tyrA基因，且片段D(272 bp)編碼胭脂堿合酶基因的終止信號。
實施例4-產生表達tyrA基因的轉基因擬南芥菜植物基于改良真空滲入法用根瘤農桿菌菌株(GV3101[pMP90])轉化野生型擬南芥菜植物(哥倫比亞)(Steve Clough和Andrew Bent.植物浸入用于擬南芥菜的農桿菌介導轉化的簡化方法(Floral dipa simplified methodfor of Agrobacterium mediated transformation of A.thaliana)，植物雜志(Plant J)16(6)735-43，1998；Bechtold，N.Ellis，J.和Pelltier，G.，見通過滲透成熟擬南芥菜植物進行植物農桿菌介導的基因轉移(PlantaAgrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsisthaliana plants)一書中，CRAcad Sci Paris，1993，1144(2)204-212)。所用的根瘤農桿菌細胞事先用質粒pBinAR-TkTp-10/tyrA和pPTVkanLeP-IPP-TP-9/tyrA轉化(圖2和3)。
原代轉化的種子基于它們對抗生素的抗性進行選擇。將對抗生素具抗性的幼苗種植入土壤中，并將充分發育的植物用于生物化學分析。
實施例5-產生表達tyrA基因的轉基因歐洲油菜植物大體按照Bade，J.B.和Damm，B.的方法(見植物的基因轉移(GeneTransfer to Plants)，Potrykus，I.和Spangenberg，G.編輯，Springer LabManual，Springer Verlag，1995，30-38)產生轉基因油料種子油菜植物，其中所述方法也指出了所用培養基和緩沖液的組成。
用根瘤農桿菌菌株GV3101[pMP90]進行轉化。質粒pPTVkanLeP-IPP-TP-9/tyrA用于轉化(圖3)。用70％乙醇(v/v)將歐洲油菜var.Westar的種子進行表面滅菌，于水中在55℃洗10分鐘，在1％強度的次氯酸鹽溶液(25％v/v Teepol，0.1％v/v吐溫20)中孵育20分鐘，并用無菌水洗6次，每次20分鐘。在濾紙上干燥種子3天，并在含15ml發芽培養基的玻璃燒瓶中對10-15粒種子發芽。從一些幼苗(約10cm)去除根和頂端，并將剩下的下胚軸截成約6mm長的部分。這樣獲得的約600個外植體在50ml基本培養基中洗30分鐘，并轉移入300ml燒瓶中。加入100ml愈傷組織誘導培養基后，于100轉/分培養培養物24小時。
將農桿菌菌株29℃于補充了卡那霉素(20mg/l)的Luria肉湯培養基中過夜培養物，并取2ml，在50ml不含卡那霉素的Luria肉湯培養基中29℃培養4小時，直至OD600達到0.4-0.5。以2000轉/分沉淀培養物25分鐘后，將細胞沉淀重懸于25ml基本培養基。通過加入更多的基本培養基，將溶液的細菌濃度調節至OD600為0.3。
用無菌吸頭將愈傷組織誘導培養基從油料種子外植體移除，加入50ml農桿菌溶液，小心地混合該反應物并孵育20分鐘。去除農桿菌懸液，用50ml愈傷組織誘導培養基洗油料種子外植體1分鐘，并接下來加入100ml愈傷組織誘導培養基。定軌搖床上以100轉/分共培養24小時。通過移去愈傷組織誘導培養基停止共培養，并在100轉/分下，用25ml洗滌培養基洗外植體兩次，每次1分鐘，然后用100ml洗滌培養基洗外植體兩次，共60分鐘。將洗滌培養基和外植體一起轉移入15cm培養皿，并用無菌吸頭移去培養基。
至于再生，每次將20至30個外植體轉移入含25ml補充有卡那霉素的枝條誘導培養基的90mm培養皿中。該培養皿用兩層Leukopor密封并在25℃和2000勒下孵育，且光周期為16小時光照/8小時黑暗。每隔12天，將發育的愈傷組織轉移至含枝條誘導培養基的新培養皿中。再生完整植物的所有進一步的步驟如Bade，J.B和Damm，B.(見植物基因轉移，Potrykus，I.和Spangenberg，G.編輯，Springer Lab Manual，Springer Verlag，1995，30-38)所述進行。
實施例6-產生表達tyrA基因的轉基因煙草植物將10ml補充有抗生素的YEB培養基(5g/l牛肉膏，1g/l酵母提取物，5g/l蛋白胨，5g/l蔗糖和2mM MgSO4)與根瘤農桿菌菌落培養，并于28℃過夜培養。用臺式離心機于4℃3500轉/分沉淀細胞20分鐘，然后在無菌條件下重懸于無抗生素的新鮮YEB培養基中。細胞懸液用于轉化。
通過植物繁殖獲得無菌培養的野生型植物。為此目的，只截去植物的頂端，并轉移至在無菌保存廣口瓶中的新鮮的2MS培養基中。至于植物的其它部分，去除葉子的上表面毛和葉子的中央脈。使用剃刀片將葉分成約1cm2大小部分。將農桿菌培養物轉移入小的培養皿(直徑2cm)。葉部分簡短地抽撥自該溶液，并將葉的底面以接觸培養基的方式置于培養皿(直徑9cm)中的2MS培養基上。在暗處于25℃放置2天后，將外植體轉移至具愈傷組織誘導培養基的平板中并在環境受控的箱子中于28℃保溫。每7-10天更換培養基。一旦形成愈傷組織，就將外植體轉移入無菌保存廣口瓶中的補充有凱福隆(claforan)的枝條誘導培養基(0.6％BiTec瓊脂(w/v)，2.0mg/l玉米素核糖，0.02mg/l萘基乙酸，0.02mg/l赤霉酸，0.25g/ml凱福隆，1.6％葡萄糖(w/v)和50mg/l卡那霉素)上。約一個月后器官發生開始，并可截斷已形成的枝條。將枝條在補充有凱福隆和選擇標記的2MS培養基上培養。一旦發育出相當多的根球，則可將植物裝盆于種子堆肥中。
實施例7-實施例4、5和6的轉基因植物的鑒定分析用上述構建體轉化的植物(擬南芥菜、歐洲油菜和煙草)的葉和種子中生育酚和生育三烯酸的含量。為此目的，在溫室中培養轉基因植物，并將表達大腸桿菌K12分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶基因的植物在Northern和Western水平上分析。用HPLC測定這些植物的葉和種子中生育酚的含量和生育三烯酸的含量。在所有情況下，將額外表達tyrA基因的轉基因植物與未轉化的植物相比，生育酚和/或生育三烯酸的含量上升。
表1A(幼葉)和1B(老葉)示出了在SNN野生型和過表達大腸桿菌Tyr A基因的植物中不同年齡的煙草葉中α-生育酚、γ-生育酚、α-生育三烯酸和總維生素E的含量[μg/g FW](數據顯示為MW+/-SD，n＝9)。表A幼葉
表B老葉
實施例8-克隆編碼在質體中表達的擬南芥菜分支酸變位酶-1的基因的亞片段使用正義特異性引物(CM-1TP 5’SEQ ID No.11)和反義特異性引物(CM-1TP 3’SEQ ID No.12)從擬南芥菜通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增編碼分支酸變位酶-1的轉運肽的DNA序列。
PCR條件如下在50μl反應混合物中進行PCR，其中所述反應混合物中包含-2μl擬南芥菜cDNA-0.2 mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP
- 1.5mM Mg(OAc)2- 5μg牛血清白蛋白- 40pmol CM-1TP 5’引物- 40pmol CM-1TP 3’引物- 15μl 3.3×rTth DNA聚合酶XL緩沖液(PE AppliedBiosystems)- 5U rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下列循環條件下進行PCR步驟194℃5分鐘(變性)步驟294℃3秒步驟355℃1分鐘(退火)步驟472℃2分鐘(延伸)步驟2至4重復30次步驟572℃10分鐘(后延伸)步驟64℃(等候)用標準方法將擴增子克隆入PCR克隆載體pCR-script(stratagene)。所產生的擴增子通過用載體特異性引物進行測序鑒定。
實施例9-克隆編碼在胞質中表達的擬南芥菜分支酸變位酶-2的基因使用正義特異性引物(CM-2 5’SEQ ID No.13)和反義特異性引物(CM-2 3’SEQ ID No.14)從擬南芥菜通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增編碼分支酸變位酶-2的DNA。
PCR條件如下在50μl反應混合物中進行PCR，其中所述反應混合物中包含-2μl擬南芥菜cDNA-0.2mM dATP，dTTP，dGTP，dCTP-1.5mM Mg(OAc)2-5μg牛血清白蛋白-40pmol CM-2 5’引物
- 40pmol CM-2 3’引物- 15μl 3.3×rTth DNA聚合酶XL緩沖液(PE AppliedBiosystems)- 5U rTth DNA聚合酶XL(PE Applied Biosystems)在下列循環條件下進行PCR步驟194℃5分鐘(變性)步驟294℃3秒步驟355℃1分鐘(退火)步驟472℃2分鐘(延伸)步驟2至4重復30次步驟572℃10分鐘(后延伸)步驟64℃(等候)用標準方法將擴增子克隆入PCR克隆載體pGEM-T(Promega)。所產生的擴增子通過用M13F(-40)引物進行測序鑒定。
實施例10-產生由編碼分支酸變位酶-1(CM-1)的轉運肽(TP)的DNA序列和編碼分支酸變位酶-2(CM-2)的DNA序列組成的嵌合構建體CM-1-TP-CM-2為了產生嵌合基因CM-1-TP-CM-2，將質粒pCR-Script/CM-1-TP用限制性酶NcoI/SalI消化。
將用限制性酶NcoI/SalI從質粒pGEM-Teasy/CM-2分離的CM-2 DNA片段連接入該質粒。該嵌合DNA構建體(SEQ ID No.5)(pCR-Script/AtCM-1TP-AtCM-2，圖4)的翻譯導致融合蛋白質的形成，其中所述融合蛋白質中CM-1的轉運肽與CM-2(SEQ ID No.6)融合。
實施例11-產生包含嵌合基因CM-1-TP-CM-2的植物表達盒產生了這樣的轉基因植物，其首先在組成型CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子(Franck等，細胞，21285-294，1980)控制下且接下來在Viciafaba豆球蛋白基因的種子特異性啟動子(Kafatos等，核酸研究，14(6)2707-2720，1986)控制下表達來自擬南芥菜的嵌合基因CM-1-TP-CM2。
產生用于嵌合基因CM-1TP-CM-2的組成型表達的質粒基礎為載體pBinAR(Hfgen和Willmitzer，植物科學(Plant Sci.)66221-230，1990)。該載體包含CaMV(花椰菜花葉病毒)35S啟動子(Franck等，1980)和章魚堿合酶基因的終止信號(Gielen等，EMBO J.3835-846，1984)。為了產生該質粒，用側翼限制性酶切位點KpnI/SalI將嵌合基因CM-1-TP-CM2從質粒pCR-script/AtCM-1TP-AtCM-2分離出來(圖4)。使用標準方法將該片段連接AKpnI/SalI-切割的pBinAR。所得的質粒(pBinAR/CM-1TP/CM-2，圖5)用于產生轉基因擬南芥菜和煙草。
為了在植物中產生可使嵌合基因CM-1TP/CM-2進行種子特異性表達的質粒，使用了豆球蛋白B4基因的種子特異性啟動子(Kafatos等，核酸研究，14(6)2707-2720，1986)。從質粒pGEMTeasy/lePNOS上通過在啟動子5’側翼的EcoRI切割位點和在啟動子3’側翼的KpnI切割位點，分離該豆球蛋白B4基因啟動子的2.7kb片段。質粒pBinAR/CM-1TP/CM-2也用限制性酶EcoRI和KpnI處理。結果，CaMV 35S啟動子被從該質粒切除(見圖5)。接下來將作為EcoRI/KpnI片段的豆球蛋白基因啟動子克隆入該載體，得到在該種子特異的啟動子控制下表達嵌合基因CM-1TP-CM-2的質粒(見圖6)。該質粒(pBinLeP/CM-1TP/CM-2)用于產生轉基因擬南芥菜和煙草植物。
實施例12-產生表達嵌合基因CM-1-TP-CM-2的轉基因擬南芥菜植物類似于實施例4，用質粒(pBinAR/AtCM-1TP/CM-2)和(pBinLeP/CM-1TP/CM-2)產生該植物。
實施例13-產生表達tyrA基因的轉基因歐洲油菜植物類似于實施例5，用質粒(pBinAR/AtCM-1TP/CM-2)和(pBinLeP/CM-1TP/CM-2)產生該植物。
實施例14-產生表達tyrA基因的轉基因煙草植物類似于實施例6，用質粒(pBinAR/AtCM-1TP/CM-2)和(pBinARleP/CM-1TP/CM-2)產生該植物。
實施例15-實施例12、13和14的轉基因植物的鑒定分析用上述構建體轉化的植物(擬南芥菜，歐洲油菜和煙草)的葉和種子中生育酚和生育三烯酸的含量。為此目的，在溫室中培養轉基因植物，并將表達編碼胞質分支酸變位酶基因的植物在Northern和Western水平上分析。用HPLC測定這些植物的葉和種子中生育酚的含量和生育三烯酸的含量。在所有情況下，額外表達分支酸變位酶基因的轉基因植物與未轉化的植物相比，生育酚和/或生育三烯酸的含量上升。序列表<110>太陽基因兩合公司(SunGene GmbH & Co.KgaA)<120>通過遺傳改變莽草酸路徑來改變生物體中精細化學品含量<130>0817/780/2000<140><141><160>14<170>PatentIn Vers.2.0<210>1<211>1238<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<220><221>CDS<222>(25)..(1143)<400>1cccgggtggc ttaagaggtt tatt atg gtt gct gaa ttg acc gca tta cgc51Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg1 5gat caa att gat gaa gtc gat aaa gcg ctg ctg aat tta tta gcg aag 99Asp Gln Ile Asp Glu Val Asp Lys Ala Leu Leu Asn Leu Leu Ala Lys10 15 20 25cgt ctg gaa ctg gtt gct gaa gtg ggc gag gtg aaa agc cgc ttt gga 147Arg Leu Glu Leu Val Ala Glu Val Gly Glu Val Lys Ser Arg Phe Gly30 35 40ctg cct att tat gtt ccg gag cgc gag gca tct atg ttg gcc tcg cgt 195Leu Pro Ile Tyr Val Pro Glu Arg Glu Ala Ser Met Leu Ala Ser Arg45 50 55cgt gca gag gcg gaa gct ctg ggt gta ccg cca gat ctg 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1.通過培養生物體產生精細化學品的方法，其中生物體的莽草酸路徑在野生型基礎上被遺傳改變。
2.如權利要求1中所述的方法，其中用至少一種選自方法A和B的方法進行莽草酸路徑的遺傳改變，A和B具有下列含義A提高野生型莽草酸路徑的至少一種酶的活性；B將至少一種基因導入生物體，其中對該基因而言，在野生型中不存在其直向同源基因且其橋接野生型的莽草酸路徑的代謝路徑。
3.如權利要求2中所述的方法，其中在方法A中，莽草酸路徑的至少一種酶的活性通過過表達編碼具該酶活性的蛋白質的核酸而增加。
4.如權利要求3中所述的方法，其中將編碼分支酸變位酶的核酸導入生物體。
5.如權利要求4中所述的方法，其中將編碼這樣的分支酸變位酶的核酸導入生物體，在生物體中該分支酸變位酶的活性受到減輕的翻譯后調節。
6.如權利要求5中所述的方法，其中將編碼這樣的分支酸變位酶的核酸導入生物體，在生物體中表達位點處該分支酸變位酶受到減輕的翻譯后調節。
7.如權利要求1至6中任意一項所述的方法，其中所用的生物體為植物。
8.如權利要求7中所述的方法，其中將胞質分支酸變位酶導入植物的質體。
9.如權利要求8中所述的方法，其中將核酸構建體導入植物，其中所述核酸構建體包含編碼質體轉運肽的核酸和包含編碼以下蛋白質的核酸，該蛋白質包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ IDNo.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
10.如權利要求9中所述的方法，其中將編碼質體分支酸變位酶的質體轉運肽的核酸用作編碼質體轉運肽的核酸。
11.如權利要求10中所述的方法，其中將核酸序列SEQ ID No.5的核酸構建體導入植物。
12.包含編碼質體轉運肽的核酸和包含編碼以下蛋白質的核酸的核酸構建體，該蛋白質包含氨基酸序列SEQ ID No.4，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.4具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶的酶特性。
13.如權利要求12中所述的核酸構建體，其中將編碼質體分支酸變位酶的質體轉運肽的核酸用作編碼質體轉運肽的核酸。
14.如權利要求13中所述的核酸構建體，其包含核酸序列SEQ IDNo.5。
15.如權利要求2至11中任意一項所述的方法，其中所用的生物體為植物，且其中當進行方法B時，將編碼預苯酸脫氫酶的核酸作為這樣的基因導入植物，該基因在野生型中不存在其直向同源基因。
16.如權利要求1至11和權利要求15中任意一項所述的方法，其中將編碼預苯酸脫氫酶的核酸與編碼分支酸變位酶的核酸聯合導入植物。
17.如權利要求16中所述的方法，其中將編碼分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸導入植物。
18.如權利要求17中所述的方法，其中導入這樣的核酸，其編碼的蛋白質包含氨基酸序列SEQ ID No.2，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.2具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的酶特性。
19.如權利要求18中所述的方法，其中使用細菌來源的核酸。
20.如權利要求18或19中所述的方法，其中所用核酸包含SEQ ID No.1所示的序列。
21.核酸構建體，其包含將如權利要求3至6、8以及15至17中任意一項所述的核酸功能性連接至確保在植物中轉錄和翻譯的一個或多個調節信號。
22.如權利要求21中所述的核酸構建體，其還包含編碼質體轉運肽的核酸。
23.如權利要求22中所述的核酸構建體，其包含權利要求12的核酸構建體。
24.如權利要求22中所述的核酸構建體，其包含編碼質體轉運肽的核酸和包含編碼以下蛋白質的核酸，該蛋白質包含氨基酸序列SEQ ID No.2，或包含通過氨基酸的替換、插入或刪除衍生于該序列的序列，其中衍生序列在氨基酸水平上與序列SEQ ID No.2具有至少30％的同源性，且其具有分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的酶特性。
25.如權利要求3至6、8和15至17中任意一項所述的核酸以及如權利要求12至14和21至24中任意一項所述的核酸構建體的用途，用于產生轉基因植物。
26.如權利要求25中所述的用途，其中轉基因植物的精細化學品含量較野生型的精細化學品含量相比，是增加的。
27.如權利要求25中所述的用途，其中轉基因植物對非生物應力的抗性與野生型相比，是提高的。
28.遺傳改變的生物體，其中該遺傳改變改變了野生型莽草酸路徑的代謝物流量，且生物體的精細化學品含量與野生型相比被改變了。
29.如權利要求28所述的遺傳改變的生物體，其中當起始生物體包含所討論的核酸時，該遺傳改變使得相對于野生型而言，編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸的基因表達提高，或，當起始生物體不包含所討論的核酸時，該遺傳改變使得相對于野生型而言，引起了野生型進行編碼分支酸變位酶、預苯酸脫氫酶或分支酸變位酶-預苯酸脫氫酶的核酸的基因表達。
30.如權利要求29所述的遺傳改變的生物體，其用如權利要求21至24中任意一項所述的核酸構建體轉化。
31.如權利要求29所述的遺傳改變的生物體，其包含如權利要求21至24中任意一項所述的核酸構建體。
32.如權利要求28至31中任意一項所述的遺傳改變的生物體，其中所用的生物體為植物。
33.產生如權利要求28至32中任意一項所述的遺傳改變的生物體的方法，其包括將至少一種如權利要求3至6、8和15至17中任意一項所述的核酸或至少一種如權利要求12至14和21至24中任意一項所述的核酸構建體導入起始生物體的基因組中。
34.如權利要求28至32中任意一項所述的遺傳改變的生物體的用途，用于產生精細化學品。
35.如權利要求28至32中任意一項所述的遺傳改變的生物體用作飼料和食品的用途，其用于生產加工食品。
36.如權利要求3至6、8和15至17中任意一項所述的核酸以及如權利要求12至14和21至24中任意一項所述的核酸構建體的用途，用于增加生物體中精細化學品的含量。
37.如權利要求3至6、8和15至17中任意一項所述的核酸以及如權利要求12至14和21至24中任意一項所述的核酸構建體的用途，用于在生物體中產生精細化學品。
全文摘要
本發明涉及通過培養生物體尤其是植物產生精細化學品尤其是維生素E、維生素K和/或泛醌的方法，其中所述生物體尤其植物的莽草酸路徑在野生型基礎上被遺傳改變，本發明還涉及轉基因生物體自身。
文檔編號C12N9/90GK1439054SQ01811927
公開日2003年8月27日 申請日期2001年6月28日 優先權日2000年6月29日
發明者R·巴杜拉, M·蓋格爾, I·孔策, S·佐默 申請人:太陽基因兩合公司